CN104198726B - 一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒 - Google Patents

一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒；由试剂R1及试剂R2组成，所述试剂R1包含的各组分为：缓冲液，硫醇类还原剂，乳酸脱氢酶，丝氨酸，还原性辅酶，表面活性剂，稳定剂，防腐剂；所述试剂R2包含的各组分为：缓冲液，胱硫醚β-合酶，胱硫醚β-裂解酶，表面活性剂，稳定剂，防腐剂。本发明使用循环酶法检测血清中的同型半胱氨酸，提供了一种操作简便，快捷、精确、灵敏、稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒。

Description

一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体地，涉及一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的异种，在旁链部份硫醇基(-SH)前包含一个额外的亚甲基(-CH2-)。
1969年Mccully从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检中发现，其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化(AS)的病理表现，由此提出高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHCY)可导致动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。此后，各国学者对HCY与心脑血管疾病的相关关系做了大量研究。研究结果表明，Hcy可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成。
血清内同型半胱氨酸的高水平是心血管疾病及中风的风险因素，是这种疾病的标记。本发明正是一种检测血清中同型半胱氨酸的试剂盒，性能优良，检测过程简便，灵敏度高。
诊断方法：最早检测同型半胱氨酸是氨基酸分析法，Ueland等测定血清中同型半胱氨酸，后经改良，目前常用方法包括以下几种。
同位素法：由Refsum等1985年建立的方法。该方法通过14C标记的腺苷与HCY缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来测HCY浓度。该方法灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，未能推广使用。
色谱法：1987年Stabler首先报道了气相色谱---质谱法测定同型半胱氨酸。该法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质。虽然灵敏度、特异性好，但仪器价格昂贵而不能推广。高效液相色谱法(HPLC)是目前比较成熟且推广使用的方法，不足之处是样品处理、层析条件、样品检测及定量的诸多变异，使其难以标准化。Fiskertrand等首先于1993年用全自动高效液相色谱法对血浆和尿液的HCY和硫醇物进行测定。HPLC根据衍生方式(柱前或柱后衍生)、检测方法(荧光、电化学)可分为多种方法。应用HPLC准确测定同型半胱氨酸需要优良的设备、高超的技术经验和应用HPLC方法适当的时间，另外选择和制备内部质控也相当重要。
免疫学法：该法应用特异性的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆技术，采用荧光偏振法或免疫法测定HCY.美国雅培公司采用全自动荧光偏振免疫技术，用AXSYM仪器检测HCY，反应原理为：正常人血浆中HCY约1％以还原型存在，70％与白蛋白结合，30％形成小分子二硫化物。血浆标本在含二硫苏糖醇的预处理液作用下，HCY、混合的二硫化物及蛋白结合型等均被还原成游离HCY形式(tHCY)：tHCY在S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)水解酶和过量腺苷存在下，被转换成SAH；预稀释的SAH混合物、抗-SAH单克隆抗体及标记的荧光S-腺苷-L-半胱氨酸示踪物一同孵育，仪器自动检测偏振光的改变，即可测出标本总HCY水平。
上述方法都存在着各自的问题，或操作繁琐，或成本高，很难普及。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒，由试剂R1及试剂R2组成，所述试剂R1包含的各组分及浓度为：
所述试剂R2包含的各组分及浓度为：
优选地，所述试剂R1、试剂R2中的缓冲液均为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种或几种。
优选地，所述试剂R1、试剂R2中的缓冲液的pH均为6.0-8.0。
优选地，所述试剂R1中的复合硫醇类还原剂为DTT、β-巯基乙醇、TCEP中的几种混合。
优选地，所述试剂R1、试剂R2中的表面活性剂均为吐温20、吐温80、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。
优选地，所述试剂R1、试剂R2中的稳定剂均为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合剂EDTA类中的一种。
优选地，所述试剂R1、试剂R2中的防腐剂均为叠氮钠或proclin300防腐剂。
本发明试剂盒采用循环酶法，其反应原理为结合型HCY被还原成游离型HCY后，游离型HCY在胱硫醚β-合酶(CBS)催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚(CYS)；L-胱硫醚(CYS)在胱硫醚β-裂解酶(CBL)催化下生成HCY、丙酮酸和NH3；该循环反应生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下，引起β-NADH转化为β-NAD+，340nm处吸光度变化与样品中HCY浓度成正比。其反应过程如下：
通过循环反应，把血清中微量的HCY放大，使得检测结果更为准确，灵敏度更高，加上可以使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明不需要复杂的预处理及特殊仪器，试剂具有足够的、准确性、稳定性及易于操作等优点；
2、本发明通过循环反应，把血清中微量的HCY放大，使得检测结果更为准确，灵敏度更高，加上可以使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。
3、本发明中采用了复合硫醇类还原剂，一般采用的硫醇类还原剂为DTT，但是DTT稳定性不强，导致试剂稳定性下降，本发明中采用的复合硫醇类还原剂，减少DTT的用量至现有技术的20～50％，从而减少由于该物质的不稳定性导致的整个试剂的不稳定；加入的β-巯基乙醇、TCEP和DTT混合后，DTT稳定性加强，同时β-巯基乙醇、TCEP也是硫醇类还原剂，也能起到还原结合型HCY的作用。采用复合硫醇类还原剂后能使血清中的结合型HCY更充分的被还原，使得检测结果更为准确，同时还改善了试剂的稳定性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为使用标准品，定标HCY试剂的定标曲线图，其中X轴表示HCY的含量，Y轴表示吸光度。
图2为采用本发明试剂和贝克曼公司的HCY试剂，对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数进行测定，对测定值进行相关分析图；其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果，Y轴表示的是贝克曼公司试剂测定的病人血清结果，相关系数R2＝0.9979，回归方程为y＝1.0354x+0.0876。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1～3
本实施例1～3涉及一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒，由试剂R1及试剂R2组成，所述试剂R1、R2的各组分及浓度见表1所示：
表1
本实施例1～3本实施例描述的HCY检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表2。分析方法：速率法，即试剂R1；R2的用量分别为250ul和25ul，样本量16.5ul；250ul试剂R1加入16.5ul样本于37℃5min后加入25ulR2，延迟90秒开始读点，读数时间约120秒；检测波长分别主波长340nm，副波长405nm。
采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的HCY标准品的曲线(如图1所示)，其中X轴表示HCY含量(μmol/L)；Y轴表示吸光度。
表2
检测试剂的相关性试验
本实验目的是检测本发明试剂和现有试剂的相关性。
使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂贝克曼公司的HCY试剂，对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数进行测定，对测定值进行相关性分析。测定结果见图2(图中国外对照试剂即为贝克曼公司的HCY试剂)，X，Y轴均为测定值(HCY的含量μmol/L)。
由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R2＝0.9979，回归方程为y＝1.0354x+0.0876。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
此外，以上实验本试剂是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
最低检测限试验
本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。
采用实验例1试剂、对照试剂贝克曼公司的HCY试剂、标准品、正常人血清样本。
机器：日立7170自动生化分析仪。
操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。
结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值一2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。
表3结果显示，本发明试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值一2SD的数值均大于零点平均值+2SD，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到0.05μmol/L。其他方法检测HCY最低检测限一般为0.5～1.0μmol/L。可以看出本发明试剂检测灵敏度更高。
实施例2、3试剂的最低检测限试验同上，测得最低检测限同样至少可以达到0.05μmol/L。
表3
准确度试验
本实验目的是检测试剂在测试样本时的准确度。
采用实验例1试剂、对照试剂贝克曼公司的HCY试剂、标准品、质控品。
操作步骤：测定质控样本10次，计算偏差系数。
表4显示，本发明试剂测定3个浓度质控结果，偏差均小于3％。可以看出试剂的准确度很好。同时从表中CV值可以看出试剂的重复性也很好。
实施例2、3试剂的准确度试验同上，测得试剂的准确度、重复性基本同实施例1。
表4
低值质控 中值质控 高值质控
1 7.65 12.23 29.57
2 7.63 12.14 29.88
3 7.66 12.31 29.85
4 7.58 12.25 29.78
5 7.62 12.18 29.86
6 7.58 12.18 29.87
7 7.55 12.36 29.74
8 7.62 12.11 29.68
9 7.64 12.18 29.58
10 7.66 12.21 29.55
平均值 7.619 12.215 29.736
SD 0.04 0.08 0.13
CV 0.49％ 0.62％ 0.45％
靶值 7.5 12 29
相对偏差 1.59％ 1.79％ 2.54％
稳定性试验
本实验目的是检测试剂的稳定性。
采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、质控品。
操作步骤：
1.试剂盒在加热(37℃)条件下保存7天后，取出试剂盒测定各质控3次。
2.试剂盒开封后，2～8℃开盖保存，每隔一周测定质控，连续一个月。
3.试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，每2个月取出试剂盒测定质控。
表5显示，试剂在加热(37℃)条件下保存7天后，检测的准确度仍然很好。
表6显示，试剂盒开封后，2～8℃开盖保存条件下，一个月内试剂准确度保持良好。
表7显示，试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，保存14个月后，试剂准确度保持良好。
从以上结果可以看出试剂稳定性良好，能长时间保存。适合临床要求。
实施例2、3试剂的稳定性试验同上，测得试剂的稳定性基本同实施例1，稳定性良好，能长时间保存。
表5
低值质控 中值质控 高值质控
1 7.71 12.35 30.12
2 7.68 12.39 30.11
3 7.67 12.36 30.08
平均值 7.687 12.367 30.103
靶值 7.5 12 29
相对偏差 2.49％ 3.06％ 3.80％
表6
表7
对比例1
本对比例涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒，由试剂R1及试剂R2组成，所述试剂R1、R2的各组分及浓度同实施例1，所不同之处在于：试剂R1中的硫醇类还原剂为DTT20mmol/L。
对比例2
本对比例涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒，由试剂R1及试剂R2组成，所述试剂R1、R2的各组分及浓度同实施例3，所不同之处在于：试剂R1中的硫醇类还原剂为β-巯基乙醇和TCEP的复合物0.1mmol/L。
对比例1、2的准确度试验以及稳定性试验同实施例1，其结果如表8～11。比较可知，DTT稳定性不强，导致试剂稳定性下降；尽管β-巯基乙醇、TCEP也是硫醇类还原剂，然而仅采用此二者的复合物，稳定性以及准确性仍欠佳。本发明中采用的复合硫醇类还原剂，减少DTT的用量至现有技术的20～50％，从而减少由于该物质的不稳定性导致的整个试剂的不稳定；采用β-巯基乙醇、TCEP和DTT形成的复合硫醇类还原剂后能使血清中的结合型HCY更充分的被还原，使得检测结果更为准确，同时还改善了试剂的稳定性。
表8
表9
表10
表11
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (3)

1.一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，由试剂R1及试剂R2组成，所述试剂R1包含的各组分及浓度为：
所述试剂R2包含的各组分及浓度为：
所述试剂R1、试剂R2中的表面活性剂均为吐温20、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种；
所述试剂R1、试剂R2中的稳定剂均为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖中的一种；
所述试剂R1、试剂R2中的防腐剂均为叠氮钠或proclin300防腐剂；
所述试剂R1中的复合硫醇类还原剂为DTT、β-巯基乙醇、TCEP的混合。
2.如权利要求1所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、试剂R2中的缓冲液均为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、试剂R2中的缓冲液的pH均为6.0～8.0。
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