CN113621679A - 一种同型半胱氨酸试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种同型半胱氨酸试剂盒及其制备方法，该同型半胱氨酸试剂盒包括：还原试剂、酶试剂、发光酶试剂及磁珠试剂，四者的体积比例为(0.5‑10)：(0.5‑10)：(0.5‑10)：(0.5‑25)；其中，所述还原试剂的组成为：三(2‑羧乙基)膦0.01‑0.55wt％、二硫苏糖醇0.05‑0.08wt％、β‑巯基乙醇0.1‑0.2mol/L、异硫氰酸胍0.01‑0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠0.02‑0.8wt％、十二烷基硫酸钠0.01‑0.05wt％，pH值为7.4‑8.3；所述酶试剂为S‑腺苷‑同型半胱氨酸水解酶。本发明提供的试剂盒灵敏度较传统的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)灵敏度提高近50倍。

Description

一种同型半胱氨酸试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种同型半胱氨酸试剂盒及其制备方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术
同型半胱氨酸(HCY)是一种含巯基的氨基酸，主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。在体内，约1/2的HCY和甲基四氢叶酸在蛋氨酸合成酶(Methionine Synthase reductase，MS)的作用下，生成蛋氨酸和四氢叶酸，四氢叶酸在N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetralydrofolate， MTHFR)的作用下生成甲基四氢叶酸；其余约1/2的Hcy通过转硫基途径，即HCY与丝氨酸在胱硫醚β合成酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)作用下形成胱硫醚，一部分在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸，最后生成丙酮酸、硫酸和水，此过程需维生素B6为辅酶及丝氨酸羟甲基转移酶，另一部分则生成同型丝氨酸。任何原因引起前两条代谢途径障碍时，升高的HCY在氨基酰-tRNA合成酶的作用下，生成同型半胱氨酸硫内酯 (homocysteine thiolactone，HTL)，HTL是HCY在氨基酰-tRNA合成酶编辑或校正过程中形成的反应产物，属一种环硫酯。
相关临床资料显示HCY水平与心血管疾病密切相关，是心血管疾病发病的一个重要危险因子，血液中增高的HCY因为刺激血管壁引起动脉血管的损伤，导致炎症和管壁的斑块形成，最终引起心脏血流受阻。高同型半胱氨酸尿症患者，由于严重遗传缺陷影响HCY代谢，造成高HCY血症。轻微的遗传缺陷或维生素B营养缺乏会伴随中度或轻度的HCY升高，也会增加心脏病的危险。HCY升高还可引起神经管畸形等出生缺陷类疾病。因此，测定血液中tHCY浓度在临床上意义十分重要。现有技术的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)，其中氧化型同型半胱氨酸经三乙羧乙基膦(TCEP)还原成游离型HCY，游离型HCY与底物发生反应，循环放大；通过检测反应中NADH转化为NAD+吸光度降低的速率，可以计算出待测物中HCY的浓度；但该酶循环法检测HCY的浓度灵敏度低，在临床意义附近测试值重复性偏差大，当测试值≤12μmol/L时的相对偏差大于15％；线性范围窄，最高只检测到50μmol/L的样本，且只能在生化仪这个平台使用。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种同型半胱氨酸试剂盒及其制备方法，所解决的技术问题是通过磁微粒化学发光法制备同型半胱氨酸试剂盒。此方法快捷、操作简单、自动化程度高，适合大多数临床实验室应用。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种同型半胱氨酸试剂盒，其包括：还原试剂、酶试剂、发光酶试剂及磁珠试剂，四者的体积比例为(0.5-10)：(0.5-10)：(0.5-10)： (0.5-25)；
其中，所述还原试剂的组成为：三(2-羧乙基)膦(TCEP)0.01-0.55wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.05-0.08wt％、β-巯基乙醇0.1-0.2mol/L、异硫氰酸胍 0.01-0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.02-0.8wt％、十二烷基硫酸钠(SDS)0.01-0.05wt％，pH值为7.4-8.3；
所述酶试剂为重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶；
所述发光酶试剂为同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物；
所述磁珠试剂由体积比例为0.1-5:0.5-10的链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的同型半胱氨酸组成。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒中，其中所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦(TCEP)0.01wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.05wt％、β-巯基乙醇0.1mol/L、异硫氰酸胍0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.8wt％、十二烷基硫酸钠(SDS)0.05wt％，pH值为8.3。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒中，其中所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦(TCEP)0.05wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.05wt％、β-巯基乙醇0.2mol/L、异硫氰酸胍0.1mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.2wt％、十二烷基硫酸钠(SDS)0.25wt％，pH值为8.0。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒中，其中所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦(TCEP)0.55wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.08wt％、β-巯基乙醇0.1mol/L、异硫氰酸胍0.01mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na) 0.02wt％、十二烷基硫酸钠(SDS)0.01wt％，pH为7.4。
某一组分过多的用量会打破整体配伍平衡，过低的用量又不起原有作用，故还原试剂的中各组分的用量均为经验值。多次实验，配比发现，上述三种条件处理后的高半胱氨酸性能较稳定，可以用于实验。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒中，其中所述同型半胱氨酸试剂盒还包括校准品、质控品、清洗液、发光底物试剂。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒中，其中所述磁珠为1-5μm的羧基磁珠。
本发明的目的及解决其技术问题是还可以采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种上述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)还原试剂的制备：配制包含0.01-0.55wt％三(2-羧乙基)膦、 0.05-0.08wt％二硫苏糖醇、0.1-0.2mol/Lβ-巯基乙醇、0.01-0.2mol/L异硫氰酸胍、0.02-0.8wt％乙二胺四乙酸二钠、0.01-0.05wt％十二烷基硫酸钠，pH 值为7.4-8.3的溶液；
2)发光酶试剂的制备：将重量比例为(1-5):(0.2-60)的抗同型半胱氨酸单克隆抗体与碱性磷酸酶复合物偶联，得到同型半胱氨酸单克隆抗体- 碱性磷酸酶复合物；
3)磁珠试剂的制备：将重量比例为(1-10)：(0.5-100)的链霉亲和素与磁珠微球偶联，得到链霉亲和素包被的磁珠；将重量比例为(1-10)： (0.2-50)的生物素与同型半胱氨酸偶联，得到生物素化的同型半胱氨酸；将链霉亲和素包被的磁珠与生物素化的同型半胱氨酸按(0.1-5):(0.5-10) 的体积比例混合，即得所述磁珠试剂。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法中，其中步骤2)中所述发光酶试剂的制备具体包括：
①碱性磷酸酶活化、离心弃上清，用缓冲液重复清洗；
②加入偶联剂温育后离心，弃上清；
③抗同型半胱氨酸单克隆抗体加入缓冲液过纯化柱；
⑤抗同型半胱氨酸单克隆抗体过透析膜，浓缩；
⑥向步骤②中加入步骤⑤中的抗同型半胱氨酸单克隆抗体，混匀，温育，离心，弃上清加入稀释液；
⑦加入封闭液混匀，清洗离心；
⑧弃上清加入保存液保存。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法中，其中步骤3)中所述链霉亲和素包被的磁珠的制备具体包括：
①磁珠活化；
②加入偶联剂，混匀，温育后离心；
③链霉亲和素加入缓冲液过纯化柱；
④链霉亲和素过透析膜，浓缩；
⑤步骤④中的浓缩链霉亲和素加入到步骤②中，温育，混匀后离心，弃上清加入缓冲液；
⑥加入封闭液混匀偶联，8-24h后离心，弃上清加入保存液悬浮；
⑦弃上清加入保存液悬浮储存。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法中，其中3)中所述生物素化的同型半胱氨酸的制备具体包括：
①将同型半胱氨酸用洗涤缓冲液洗涤，离心，弃上清，重复多次；
②使用稀释液稀释活化生物素；
③步骤②活化后的生物素与步骤①浓缩处理的同型半胱氨酸偶联，温育混匀后离心，弃上清加入稀释液；
④加入终止液终止偶联；
⑤加入缓冲液清洗；
⑥加入保存液储存。
本发明的目的及解决其技术问题是还可以采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种上述的同型半胱氨酸试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)使用还原试剂处理样本中的同型半胱氨酸，得到游离态的同型半胱氨酸；所述还原剂与样本的体积比例为0.1-5)：(0.5-10)；
2)将步骤1)得到的游离态的同型半胱氨酸中加入重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)，得到S-腺苷-同型半胱氨酸(SAH)；所述S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶(rSAHHase)与样本的体积比例为 (0.01-0.5):(0.1-10)；
3)使用稀释液按比例稀释链霉亲和素包被的磁珠；所述稀释液与链霉亲和素包被的磁珠的重量比例为(10-1000):(0.05-1)；
4)使用稀释液按比例稀释生物素化的同型半胱氨酸；所述稀释液与生物素化的同型半胱氨酸的重量比例为(20-3000):(0.02-10)；
5)使用稀释液按比例稀释同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物；所述稀释液与同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物的重量比例为(15-4000):(0.06-18)；
6)将上述各种试剂组成一个试剂船，将该试剂船置入全自动化学发光检测分析仪器中测试；其中一个试剂船为一盒试剂，试剂盒的规格为100 人份/盒、50人份/盒。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法中，其中所述稀释液的组成为：10～100mM的Tris-HCl、0.1～2wt％的BSA、0.1～0.5wt％的PC300、0.02-0.5wt％的吐温20、0.1～2wt％的NaCl溶液，pH值为7.0～9.0。
由于同型半胱氨酸的额外亚甲基使硫醇基更接近羧基，令它能起动化学反应形成一个五元环，称为同型半胱氨酸硫内酯。当氨基酸正常地与它的毗邻形成一个肽键就会产生这种反应。所以血清中的同型半胱氨酸呈结合态或二聚化(氧化型)存在，同时同型半胱氨酸不适合与蛋白质混合，这是因含有同型半胱氨酸的蛋白质会自行分解。为此，本申请通过还原试剂及重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶对血清中的同型半胱氨酸进行两步预处理，使得结合态或二聚化的同型半胱氨酸成为游离的还原态，同时在 S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶下转化为S-腺苷-同型半胱氨酸，使得制备磁微粒化学发光同型半胱氨酸(HCY)成为可能。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的试剂盒灵敏度较传统的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)灵敏度提高近50倍。
本发明提供的试剂盒的最低检测限可以达到0.23μmol/L；同时该试剂盒的特异性强，测试200mmol/L的L-半胱氨酸、200mmol/L的L-谷胱甘肽，其测量值低于最低检测限浓度(0.23μmol/L)。
本发明提供的试剂盒的线性范围更宽，线性上限比传统酶循环法(传统酶法上限为50μmol/L)更宽，可以延展至150μmol/L，测试校准物即使测试浓度高达500μmol/L，也不会出现HOOK效应。磁微粒化学发光线性范围0.25-300μmol/L；
本发明提供的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(磁微粒化学发光) 的研制打破了只在生化平台测试同型半胱氨酸的历史，多平台同时检测，为医院检验科多提供一个检测平台，多一份选择。
附图说明
图1显示的是本发明实施例1中的同型半胱氨酸的标准曲线；
图2显示的是本发明实施例1中的同型半胱氨酸试剂盒的线性范围；
图3显示的是本发明实施例1中的同型半胱氨酸试剂盒的相关性分析。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
以下提及的材料或试剂，如非特别说明，皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。
本发明提供了一种同型半胱氨酸试剂盒，其包括：还原试剂、酶试剂、发光酶试剂及磁珠试剂，四者的体积比例为(0.5-10)：(0.5-10)：(0.5-10)： (0.5-25)，优选为3：3：3：5，这样使得所述试剂盒的最低检测限可达到 0.23μmol/L；
其中，所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦(TCEP)0.01-0.55wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.05-0.08wt％、β-巯基乙醇0.1-0.2mol/L、异硫氰酸胍0.01-0.2 mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.02-0.8wt％、十二烷基硫酸钠(SDS) 0.01-0.05wt％，pH值为7.4-8.3；优选地，所述还原试剂包含三(2-羧乙基) 膦0.02％、二硫苏糖醇0.06wt％、β-巯基乙醇0.15mol/L、异硫氰酸胍0.2 mol/L、乙二胺四乙酸二钠0.8wt％、十二烷基硫酸钠0.04wt％，pH值为8.0 的溶液，优选后可使得所述试剂盒的线性相关系数r更优；如果小于下限值或大于上限值，高值样本和低值样本的测量值与目标浓度值偏差较大，使得测量值与目标浓度值的拟合相关系数r值很差。
所述酶试剂为重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶；所述重组的S-腺苷 -同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)与样本的体积比例为(0.01-0.5)： (0.1-10)，其可将游离态的同型半胱氨酸转化为S-腺苷-同型半胱氨酸 (SAH)；为了使得测试样本的重复性更好，偏差CV更小，所述重组的S- 腺苷-同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)与样本的体积比例可以优选为0.02：0.5；如果小于下限值或大于上限值会影响酶试剂的稳定性，进而导致重复性测试时，变异系数CV很差。
所述发光酶试剂为同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物；所述抗同型半胱氨酸单克隆抗体与碱性磷酸酶的重量比例为(1-5):(0.2-60)，优选为2：5，优选后不会出现HOOK效应，可以延展至150μmol/L，测试校准物即使测试浓度高达500μmol/L，也不会出现HOOK效应；如果小于下限值或大于上限值会存在HOOK效应，这是因为同型半胱氨酸单克隆抗体含量过低，相对而言同型半胱氨酸过量，发生后带效应；同型半胱氨酸单克隆抗体含量过高，相对而言同型半胱氨酸过低，发生前带效应；此外，抗同型半胱氨酸单克隆抗体与碱性磷酸酶的搭配会产生发光信号值，使发光信号值与抗体浓度成比例关系。
所述磁珠试剂由体积比例为(0.1-5):(0.5-10)的链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的同型半胱氨酸，磁珠上的链霉亲和素会和生物素自发连接，同型半胱氨酸会自发和对应的抗同型半胱氨酸单克隆抗体自发连接，加入底物后，底物与碱性磷酸酶反应，产生发光，通过发光值，同时根据校准品可以推导出发光值对应的浓度值，从而间接获得血清中的浓度值；所述链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的同型半胱氨酸的体积比例优选为 1:4，优选后链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的同型半胱氨酸充分结合，发光值很高；如果小于下限值，链霉亲和素包被的磁珠少于生物素化的同型半胱氨酸，发光值会很低；如果大于上限值，链霉亲和素包被的磁珠多于生物素化的同型半胱氨酸，会造成磁珠试剂浪费应。
在一些实施例中，所述还原试剂的组成为：三(2-羧乙基)膦(TCEP) 0.01wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.05wt％、β-巯基乙醇0.1mol/L、异硫氰酸胍 0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.8wt％、十二烷基硫酸钠(SDS) 0.05wt％，pH值为8.3。
在另一些实施例中，所述还原试剂的组成为：三(2-羧乙基)膦(TCEP) 0.05wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.05wt％、β-巯基乙醇0.2mol/L、异硫氰酸胍0.1mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.2wt％、十二烷基硫酸钠(SDS) 0.25wt％，pH值为8.0。
在其他一些实施例中，所述还原试剂的组成为：三(2-羧乙基)膦(TCEP)0.55wt％、二硫苏糖醇(DTT)0.08wt％、β-巯基乙醇0.1mol/L、异硫氰酸胍0.01mol/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.02wt％、十二烷基硫酸钠 (SDS)0.01wt％，pH值为7.4。
所述还原试剂的组成中某一组分过多的用量会打破整体配伍平衡，过低的用量又不起原有作用，故还原试剂的中各组分的用量均为经验值。多次实验，配比发现，上述三种的还原试剂处理后的高半胱氨酸性能较稳定，可以用于实验。
三(2-羧乙基)膦(TCEP)是一种非常有效的硫醇类还原剂，又是一种高效的二硫键还原剂，在空气中不怕氧化，稳定性较好，没有难闻的气味，在很宽的PH值范围内都可以选择性定量地还原，酸性、碱性溶液中的稳定性均较佳。TCEP解离的时间常控制在10分钟以内，其用量选择0.01wt％。
二硫苏糖醇(DTT)还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构，DTT的还原力受pH值的影响，因为只有脱去质子的硫醇盐负离子(-S–)才具有反应活性，只在偏碱性环境下如pH值大于7才能够发挥还原作用。巯基的pKa为8.3，所以二硫苏糖醇(DTT)的最佳使用性能为pH为8.3。
β-巯基乙醇可以打开蛋白质中存在的二硫键，常被用于保护蛋白质中自由的半胱氨酸巯基之间不会错误形成二硫键。同时β-巯基乙醇能够溶解于水中，并且降低溶液的挥发性。缺点是对空气敏感，易吸潮，需要与乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)配伍使用。
异硫氰酸胍用于变性裂解细胞，并抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍溶液显酸性，4％的水溶液PH值在4.5-7.0之间，与乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na)、二硫苏糖醇(DTT)共同联用，可以改善裂解变性能力。
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)是一种重要络合剂，pH调节剂、阻凝剂，在实验中用于控制反应速度。
十二烷基硫酸钠易溶于水，溶解性易溶于热水，溶于水，在水溶液中偏碱性，pH在7.5-9.5之间，微有特殊气味。十二烷基硫酸与三(2-羧乙基) 膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇配伍性好，具有良好的乳化、发泡、渗透、去污和分散性能，去脂能力很强，因此常被应用在体外诊断试剂中。
引入三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)、十二烷基硫酸钠(SDS)对血清中高半胱氨酸进行处理，三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、β- 巯基乙醇、异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)、十二烷基硫酸钠 (SDS)协同阻止高半胱氨酸的额外亚甲基形成五元环，同时又确保高半胱氨酸结构式稳定，不会自行降解。
具体实施时，所述同型半胱氨酸试剂盒100份/盒可以包含：链霉亲和素包被的磁珠5ml、生物素化的同型半胱氨酸5ml、同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物5ml。每人份可以包含：稀释50μl、链霉亲和素包被的磁珠50μl、生物素化的同型半胱氨酸50μl、同型液半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物50μl。
所述同型半胱氨酸试剂盒还包括校准品、质控品、清洗液、发光底物试剂。校准品为6种不同浓度的同型半胱氨酸(0μmol/L，7.5μmol/L， 15μmol/L，30μmol/L，60μmol/L，150μmol/L)，主要目的是对试剂盒进行定标。质控品为指定浓度(7.5μmol/L，60μmol/L)的同型半胱氨酸，主要目的是质控，作用为用于评估试剂组成的系统当天测试值是否是在控状态。清洗液为常规清洗液，主要作用是清洗全自动免疫化学发光分析仪的管路，清洗磁珠。发光底物试剂主要成分为含有多苯环的发光酶试剂(AMPPD，浓度为0.01wt％)，作用是试剂盒中的试剂会降解发光底物对应苯环，在降解过程中，会产生发光物质。
考虑到悬浮性能，所述磁珠可以为1-5μm的羧基磁珠；为了更好地悬浮，所述羧基磁珠的粒度优选为2μm。如果大于上限值，会影响磁珠的悬浮性；如果小于下限值，会影响磁珠的磁性。
本发明还提供了一种上述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)还原试剂的制备：配制包含0.01-0.55wt％三(2-羧乙基)膦、 0.05-0.08wt％二硫苏糖醇、0.1-0.2mol/Lβ-巯基乙醇、0.01-0.2mol/L异硫氰酸胍、0.02-0.8wt％乙二胺四乙酸二钠、0.01-0.05wt％十二烷基硫酸钠，pH 值为7.4-8.3的溶液；
2)发光酶试剂的制备：将重量比例为(1-5):(0.2-60)的抗同型半胱氨酸单克隆抗体与碱性磷酸酶复合物偶联，得到同型半胱氨酸单克隆抗体- 碱性磷酸酶复合物；
3)磁珠试剂的制备：将重量比例为(1-10)：(0.5-100)的链霉亲和素与磁珠偶联，得到链霉亲和素包被的磁珠；将重量比例为(1-10)：(0.2-50) 的生物素与同型半胱氨酸偶联，得到生物素化的同型半胱氨酸；将链霉亲和素包被的磁珠与生物素化的同型半胱氨酸按(0.1-5):(0.5-10)的体积比例混合，即得所述磁珠试剂。
其中步骤2)中所述发光酶试剂的制备具体包括：
①将碱性磷酸酶用pH值为6.5，90-120mM的MES缓冲液清洗(其目的是洗涤，优选为100mM的MES，离子强度刚刚好，发光信号会更好。若小于下限值或大于上限值会影响发光值)，5000g离心5min，弃上清，再加入pH值为6.5，10-1000mM的MES缓冲液清洗(其目的是沉淀，优选为100mM的MES缓冲液，此时离子强度刚刚好，发光信号会更好；若小于下限值或大于上限值会影响发光值)；
②在步骤①得到的溶液中加入偶联剂，之后加入pH值为6.5，100mM 的MES缓冲液清洗后，500-15000g离心1-25min(考虑到效率和安全性，优选为5000g离心5min，这样即可满足实验要求，若转速太低会导致时间延长，提高转速会影响离心机使用寿命，也会带来危险)，弃上清；所述偶联剂为重量比例是1:(1～5)的碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
③将抗同型半胱氨酸单克隆抗体中加入pH值为8.0的10-500mM碳酸钾缓冲液(优选为50mM，如小于下限则影响PH值，大于上限值则会使抗体受到影响)稀释，稀释后浓度为0.01-30mg/ml(优选为0.1mg/ml，此浓度的抗体损失更小，蛋白纯度高；如果小于下限值会影响后面浓缩步骤，大于上限值则会影响蛋白的纯度)，过纯化柱；
⑤将上述纯化后的抗同型半胱氨酸单克隆抗体，装入透析膜(截留分子为3kd)，透析膜外加入1-200gPEG2000粉末(优选为5g，此透析效果刚好。小于下限值会影响导致水分出不来无法透析，大于上限值会造成透析过大)，浓缩处理至0.1-10mg/mL(优选为1mg/ml，此浓度的抗体效果会更好。小于下限值或大于上限值会产生HOOK效应)；
⑥向步骤②中加入步骤⑤得到的抗同型半胱氨酸单克隆抗体溶液，混匀，25-48℃温育2-48h，500-15000g离心1-25min(优选为37℃温育12h，混匀，5000g离心5min,37℃更接近人体体温，蛋白活性最高，12h及过夜时间不影响工时，且测试发光值较高)，弃上清加入稀释液(浓度10-1000mM 的MES缓冲液，pH值为6.5；优选为100mM的MES缓冲液，此时离子强度刚刚好，发光信号会更好；若小于下限值或大于上限值会影响发光值)；
⑦加入封闭液(1-2wt％的牛血清白蛋白溶液，优选为0.5wt％的牛血清白蛋白溶，此时发光信号更好；如果小于下限值或大于上限值会影响发光值)混匀；
⑧弃上清加入保存液保存，所述保存液的组成为：10～100mM的 Tris-HCl、0.1～2wt％的BSA、0.1～0.5wt％的PC300、0.02-0.5wt％的吐温20、 0.1～2wt％(优选为20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、 0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0，优选后稳定性更好)的NaCl溶液，pH值为7.0～9.0(优选为8.0，稳定性更好)。
其中步骤3)中所述链霉亲和素包被的磁珠的制备具体包括：
①取1-100mL，1-200mg/mL的磁珠溶液(含有磁珠1-200mg)， 500-15000g离心1-25min，去掉上清，加入pH值为4-7，10-100mM的MES 缓冲液1-210ml(优选为10mL，100mg/mL的磁珠溶液(含有磁珠100mg)， 5000g离心5min，去掉上清，加入pH值为6.5，100mM的MES缓冲液10m，优选后使得发光值较高)，放入血液混匀仪上混匀5min，此清洗过程即为磁珠活化过程。
②在步骤①中加入偶联剂，混匀，25-48℃温育2-48h，500-15000g离心1-25min(优选为37℃温育12h，混匀，5000g离心5min,37℃更接近人体体温，蛋白活性最高，12h及过夜时间不影响工时，且测试发光值较高)；所述偶联剂为重量比例是(0.1-5):(0.5-10)的碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，优选为0.5:2，此时发光信号更好；所述碳二亚胺(EDC) 与磁珠微球的重量比例为(0.1-5):(0.5-10)，优选为0.5:2，此时发光信号更好；过多用量的偶联剂会造成原料浪费，过低用量的偶联剂又达不到偶联效果。
③将链霉亲和素使用pH值为8.0，10-500mM的碳酸钾缓冲液(优选为50mM，小于下限值多低影响PH值或大于上限值会使抗体受到影响)复溶，复溶后浓度为0.1-10mg/ml(优选为1mg/ml，此浓度的抗体效果会更好。若小于下限值或大于上限值，则会使测试的发光值很低)，上纯化仪过纯化柱；
④将上述步骤③纯化后的链霉亲和素，装入透析膜(截留孔径为30kd)，透析膜外加入1-200g PEG2000粉末(优选为5g，此透析效果刚好。若小于下限值，则会影响导致水分出不来无法透析；若大于上限值，则会造成透析过大)，PEG2000粉末会析出透析膜内水分，浓缩处理至0.1-20mg/ml(优选为1mg/ml，此浓度抗体效果会更好。若小于下限值或大于上限值，则会使测试的发光值很低)；
⑤将步骤④浓缩的链霉亲和素溶液加入到步骤②中，25-48℃温育 2-48h，500-15000g离心1-25min(优选为37℃温育12h，混匀，5000g离心 5min,37℃更接近人体体温，蛋白活性最高，12h即为过夜时间不影响工时，且测试发光值较高)，弃上清，加入10-1000mM(优选为100mM的MES 缓冲液，此时离子强度刚刚好，发光信号会更好；若小于下限值或大于上限值会影响发光值)，pH值为6.5的MES缓冲液1-20ml(优选为2.5ml，此时离子强度刚刚好，发光信号会更好；若小于下限值清洗不彻底，大于上限会造成浪费)；
⑥加入封闭液(1-2wt％的牛血清白蛋白溶液，优选为0.5wt％的牛血清白蛋白，此时发光信号更好；如果小于下限值或大于上限值，则会影响发光值)混匀偶联，8-24h后，500-15000g离心1-25min(优选为5000g离心 5min，这样可以提高效率及安全性)；
⑦储存：将步骤⑥得到的溶液用移液枪移除上清，并加入保存液，所述保存液的组成为：10～100mM的Tris-HCl、0.1～2wt％的BSA(牛血清白蛋白)、0.1～0.5wt％的PC300、0.02-0.5wt％的吐温20、0.1～2wt％的NaCl 溶液，pH值为7.0～9.0(优选为20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0，优选后稳定性更好)。
其中步骤3)中，所述链霉亲和素与磁珠微球的重量比例为(1～10)： 100，优选为1:10，如果重量比例大于(1～10)：100，也就是说链霉亲和素在此基础上继续增加用量，磁珠微球上的羧基用量已经饱和，造成链霉亲和素原料浪费，从经济成本的角度来说(1～10)：100的重量比例已经满足实验需求。
其中3)中所述生物素化的同型半胱氨酸的制备具体包括：
①用pH值为6.5的10-1000mM MES缓冲液(优选为100mM的MES 缓冲液，此时离子强度刚刚好，发光信号会更好；若小于下限值或大于上限值会影响发光值))10ml洗涤同型半胱氨酸，500-15000g离心1-25min (考虑到效率和安全性，优选为5000g离心5min，这样即可满足实验要求，若转速太低会导致时间延长，提高转速会影响离心机使用寿命，也会带来危险)，弃上清，沉淀，再次用pH值为6.5的10-1000mM MES缓冲液1-10ml 复溶(优选为100mM的MES缓冲液2.5ml，此时离子强度刚刚好，发光信号会更好；若小于下限值清洗不彻底，大于上限会造成浪费)，上述步骤重复多次，使得复溶后浓度为0.02-20mg/mL(优选为1mg/ml，此浓度是偶联的最佳浓度，小于下限，浓度过稀，不利于偶联，大于上限会造成偶联低)；加入MES缓冲液的目的一是为了稀释，二是为了辅助偶联；
②将生物素中加入1-100mM，pH值为7.0-9.0的碳酸钾溶液10ml， 500-15000g离心2-25min(优选为加入100mM，pH值为8.5的碳酸钾溶液 10ml，5000g离心5min，其目的是去除杂质)；去上清，再次加入100mM， pH值为8.5的碳酸钾溶液10ml(由于碳酸钾溶液略显碱性，用它来稀释生物素，使得体系呈弱碱性，利于偶联)；
③将活化后的生物素与浓缩处理的同型半胱氨酸偶联，25-48℃温育 2-48h，混匀，500-15000g离心1-25min(优选为37℃温育12h，混匀，5000g 离心5min,37℃更接近人体体温，蛋白活性最高，12h即为过夜时间不影响工时，且测试发光值较高)，弃上清加入稀释液(pH值为8.5，100mM的碳酸钾缓冲体系)，悬浮；
④终止：加入终止液(1-2wt％的牛血清白蛋白溶液，优选为1wt％的牛血清白蛋白溶液，此时发光信号更好；如果小于下限值或大于上限值，则会影响发光值)终止偶联；
⑤清洗：加入1-10ml，pH值为8.5，10-500mM的碳酸钾缓冲液(优选为2.5ml，pH值为8.5，50mM的碳酸钾缓冲液，如小于下限值则影响pH 值，大于上限值则会使抗体受到影响)清洗；
⑥储存：加入保存液(10～100mM的Tris-HCl、0.1～2wt％的BSA、0.1～0.5 wt％的PC300、0.02-0.5wt％的吐温20、0.1～2wt％的NaCl溶液，pH值为 7.0～9.0；优选为20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、 0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0，优选后稳定性更好)储存。
本发明还提供了一种上述的同型半胱氨酸试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)使用还原试剂处理样本中的同型半胱氨酸，得到游离态的同型半胱氨酸；所述还原剂与样本的体积比例为(0.1-5)：(0.5-10)；优选为1:2，优选后使得测试信号值明显升高；如果小于下限，还原剂用量不足，信号值明显下降；如果大于上限，还原剂用量超标，试剂稳定性降低，同时测试重复性，受到影响；
2)将步骤1)得到的游离态的同型半胱氨酸中加入重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)，得到S-腺苷-同型半胱氨酸(SAH)；所述S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶(rSAHHase)与样本的体积比例为 (0.01-0.5):(0.1-10)；优选为0.02：0.5；优选后使得测试重复性变异系数CV很好；如果小于下限值，则会影响试剂稳定性，如果大于上限值则导致重复性变异系数CV很差。
3)使用稀释液按比例稀释链霉亲和素包被的磁珠；所述稀释液与链霉亲和素包被的磁珠的重量比例为(10-1000):(0.05-1)；优选为1000：0.5，这样优选后使得链霉亲和素-磁珠组成的试剂R1，其浓度为与试剂R2中生物素充分结合的最优浓度，若小于下限值，则链霉亲和素-磁珠浓度过低，发光信号值整体降低；若大于上限值，则会造成链霉亲和素-磁珠试剂浪费；
4)使用稀释液按比例稀释生物素化的同型半胱氨酸；所述稀释液与生物素化的同型半胱氨酸的重量比例为(20-3000):(0.02-10)；优选为3000： 0.5，这样优选后使得生物素化的同型半胱氨酸组成的试剂R2，其浓度为与试剂R1中链霉亲和素-磁珠浓度充分结合的最优浓度，若小于下限值，生物素化的同型半胱氨酸浓度过低，发光信号值整体降低；若大于上限值，则会造成生物素化的同型半胱氨酸浪费。
5)使用稀释液按比例稀释同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物；所述稀释液与同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物的重量比例为(15-4000):(0.06-18)；优选为4000：0.25，这样优选后使得同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物组成的试剂R3，其浓度为与试剂R2中生物素充分结合的最优浓度，若小于下限值，同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物浓度过低，发光信号值整体降低；若大于上限值，则会造成同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物浪费。
6)将上述各种试剂组成一个试剂船，将该试剂船置入全自动化学发光检测分析仪器中测试；其中一个试剂船为一盒试剂，试剂盒的规格为100 人份/盒、50人份/盒。
进一步地，前述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法中，其中所述稀释液的组成为：10～100mM的Tris-HCl、0.1～2wt％的BSA、0.1～0.5wt％的 PC300、0.02-0.5wt％的吐温20、0.1～2wt％的NaCl溶液，pH值为7.0～9.0；优选为20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0，优选后稳定性更好。
由于同型半胱氨酸(HCY)容易形成二硫键，同时血浆中含有自由或非结合HCY(1-2wt％)、同型半胱氨酸-半胱氨酸或同型胱氨酸二聚体 (10-20wt％)或结合蛋白质的HCY(>80wt％)，通过还原试剂及重组的 S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶对血清中的同型半胱氨酸进行两步预处理，使得结合态或二聚化的同型半胱氨酸成为游离的还原态，同时在S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶下转化为S-腺苷-同型半胱氨酸，使得制备磁微粒化学发光同型半胱氨酸(HCY)成为可能；其中两步预处理主要是将二聚体或结合蛋白质的HCY还原成游离的具有还原性的HCY，同时确保游离状态的HCY稳定，不自行聚合，不降解。
以下结合具体实施例进行进一步说明。
实施例1同型半胱氨酸试剂盒的制备
1.1还原试剂的配制
取一个容量为1L的容器，加入约800g的热纯化水(50-60℃)；加入 0.1g的三(2-羧乙基)膦(TCEP)；搅拌至完全溶解；加入0.5g二硫苏糖醇 (DTT)，搅拌至完全溶解；加入10mol/Lβ-巯基乙醇(DTT)10ml，搅拌至完全溶解；加入10mol/L异硫氰酸胍20ml，搅拌至完全溶解；加入8g乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)，搅拌至完全溶解；加入0.5g十二烷基硫酸钠(SDS)，搅拌至完全溶解；用4mol/L氢氧化钠溶液调整溶液pH值至 8.3±0.01；用纯化水定容到1kg，得到含有0.01wt％三(2-羧乙基)膦(TCEP)、 0.05wt％二硫苏糖醇(DTT)、0.1mol/Lβ-巯基乙醇、0.2mol/L异硫氰酸胍、 0.8wt％乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)、0.05wt％十二烷基硫酸钠(SDS)， pH值为8.3的溶液；之后将其用0.22μm的过滤器过滤，以去除杂质和细菌；贮放温度为+4℃。
1.2酶试剂的制备
1)使用还原试剂处理样本中的同型半胱氨酸，所述还原剂与样本的体积比例为1:1，从而获得游离态的同型半胱氨酸；
2)将步骤1)得到的游离态的同型半胱氨酸中加入重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)，转化为S-腺苷-同型半胱氨酸(SAH)；所述重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)与样本的体积比例为1：10。
重组的S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)的用量与步骤 1)的还原剂在0-0.1μmol/L内呈现正相关，大于0.1μmol/L依然有增高趋势，从节约原料角度，0.1μmol/L的原料即可满足实验无需在增加重组的S-腺苷 -同型半胱氨酸水解酶水解酶(rSAHHase)浓度用量。
1.3发光酶试剂的制备
①将碱性磷酸酶用pH值为6.5，100mM的MES缓冲液清洗(其目的是洗涤)，5000g离心5min，弃上清，再加入pH值为6.5，100mM的MES 缓冲液清洗(其目的是沉淀)；
②在步骤①得到的溶液中加入偶联剂，之后加入pH值为6.5，100mM 的MES缓冲液清洗后，5000g离心5min，弃上清；所述偶联剂为重量比例是1:(1～5)的碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
③将抗同型半胱氨酸单克隆抗体中加入pH值为8.0的50mM碳酸钾缓冲液稀释，稀释后浓度为1mg/ml，过纯化柱；
⑤将上述纯化后的抗同型半胱氨酸单克隆抗体，装入透析膜(截留分子为3kd)，透析膜外加入5gPEG20000粉末，浓缩处理至1mg/mL；
⑥向步骤②中加入步骤⑤得到的抗同型半胱氨酸单克隆抗体溶液，37℃温育12h，混匀，5000g离心5min，弃上清加入稀释液(浓度100mM 的MES缓冲液，pH值为6.5)；
⑦加入封闭液(1.5wt％的牛血清白蛋白溶液)混匀；
⑧弃上清加入保存液保存，所述保存液的组成为：20mM的Tris-HCl、 0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl 溶液，pH值为8.0。
1.4磁珠试剂的制备
1.4.1链霉亲和素包被的磁珠的制备：
①取10mL，100mg/mL的羧基磁珠(含有磁珠100mg，粒度为1.5μm)， 5000g离心5min，去掉原有上清，加入pH值为6.5，100mM的MES缓冲液10ml，放入血液混匀仪上混匀5min；
②在①得到的溶液中加入偶联剂，混匀，37℃温育后5000g离心5min；所述偶联剂为重量比是1:2的碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述碳二亚胺(EDC)与磁珠微球的重量比例为1:1。
③将链霉亲和素使用pH值为8.0，50mM的碳酸钾缓冲液复溶，复溶后浓度为1mg/ml，上纯化仪过纯化柱；
④将步骤③纯化后的链霉亲和素，装入透析膜(截留孔径为30kd)，透析膜外加入5gPEG20000粉末，PEG20000粉末会析出透析膜内水分，浓缩处理至10mg/ml；
⑤将步骤④浓缩的链霉亲和素溶液加入到步骤②中，37℃恒温12h， 5000g离心5min，弃上清，加入100Mm,pH值为6.5的MES缓冲液2.5ml；
⑥将步骤⑤得到的溶液中加入1.5wt％的牛血清白蛋白溶液，12h后 5000g离心5min；
⑦储存：将步骤⑥得到的溶液用移液枪移除上清并加入保存液，所述保存液的组成为：20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、 0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0。
1.4.2生物素化的同型半胱氨酸的制备：
①用pH值为6.5的100mM MES缓冲液10ml洗涤同型半胱氨酸， 5000g离心5min，弃上清，沉淀再次用pH值为6.5的100mM MES缓冲液 10ml复溶，复溶后浓度为1mg/mL；
②将生物素试剂中加入100mM，pH值为8.5的碳酸钾溶液10ml，5000g 离心5min(其目的是去除杂质)；去上清，再次加入100mM，pH值为8.5 的碳酸钾溶液10ml(由于碳酸钾溶液略显碱性，使得体系呈弱碱性，有利于偶联)；
③活化后的生物素与浓缩处理的同型半胱氨酸偶联，37℃温育混匀12h 离心(5000g，5min)，弃上清加入稀释液(pH值为8.5，100mM的碳酸钾缓冲体系)，悬浮。
④加入终止液(1wt％的牛血清白蛋白溶液)终止偶联；
⑤加入pH值为8.5的100mM的碳酸钾缓冲液5ml清洗；
⑥加入保存液(20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、 0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0)储存。
1.5使用稀释液按比例稀释链霉亲和素包被的磁珠；所述稀释液与链霉亲和素包被的磁珠的重量比例为500:0.2；
1.6使用稀释液按比例稀释生物素化的同型半胱氨酸；所述稀释液与生物素化的同型半胱氨酸的重量比例为2000:1；
1.7使用稀释液按比例稀释同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物；所述稀释液与同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物的重量比例为3000:0.5；
1.8将上述各种试剂组成一个试剂船。
1.9校准品和质控品的制备：
校准品的制备：用1000ml的量筒量取500ml的保存液(20mM的 Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0)加入玻璃瓶中，之后用加样枪吸取75μmol同型半胱氨酸加入玻璃瓶中，随后将玻璃瓶置于血液混匀仪上室温混匀30min，得到150μmol/L的同型半胱氨酸，将其用稀释液(20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl 溶液，pH值为8.0)配制成另外5种不同浓度的同型半胱氨酸(0μmol/L， 7.5μmol/L，15μmol/L，30μmol/L，60μmol/L)，分装。
质控品的制备：用100ml的量筒，量取100ml的保存液(20mM的 Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0，)加入玻璃瓶中，用加样枪吸取6μmol同型半胱氨酸加入玻璃瓶中，随后将玻璃瓶置于血液混匀仪上室温混匀30min，得到60μmol/L的同型半胱氨酸，将其用稀释液(20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液， pH值为8.0)配制成7.5μmol/L的同型半胱氨酸(60μmol/L)，分装。
1.11清洗液和发光底物试剂的制备：
取一个容量为1L的容器，先加入约800g的热纯化水(50-60℃)；依次加入12.14g的Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、0.5ml，12mol/L的浓盐酸以及2g的吐温20，再次加入200g纯化水，之后将容器置于血液混匀仪上室温混匀30min，得到含有100mMTris，0.2wt％吐温20的溶液，分装。
发光底物试剂购自阿匹斯。
1.12HCY标准曲线的建立
将30μl还原试剂与将60μl校准品混合，37℃孵育3min，加入30μl酶试剂，37℃孵育10min，加入磁珠试剂50μl，再次37℃孵育5min，用清洗液清洗3次，加入发光酶试剂200μl，之后用全自动化学发光免疫分析仪进行测试，记录发光值(RLU)，取平均，得到发光均值，具体数据见表1。根据理论浓度和发光均值可以建立标准曲线。图1是实施例1中建立的标准曲线。
表1实施例1中HCY标准曲线测试发光值结果
Figure 1
实施例2同型半胱氨酸试剂盒的检测
2.1最低检测限
用稀释液(20mM的Tris-HCl、0.12wt％的BSA、0.15wt％的PC300、 0.025wt％的吐温20、0.12wt％的NaCl溶液，pH值为8.0)作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(Ave)和标准差(SD)，得出Ave+2×SD对应的浓度值为最低检测限，结果如下表2所示。从表2中可得到本发明的同型半胱氨酸试剂盒最低可以测到0.23(μmol/L)的低限值样本，比同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)只测试到12(μmol/L)，灵敏度提高近50倍，这说明本发明的同型半胱氨酸试剂盒非常灵敏。
表2校准品稀释液发光值
测试次数 发光值 浓度值
1 51756052 0.11
2 51715947 0.11
3 50581632 0.19
4 52507593 0.05
5 51819772 0.10
6 52304052 0.07
7 51291974 0.14
8 51983931 0.09
9 51401704 0.13
10 52045064 0.09
11 51147751 0.15
12 51279926 0.14
13 50441391 0.20
14 51075896 0.16
15 52285923 0.07
16 50593237 0.19
17 51553052 0.12
18 50601547 0.19
19 50497743 0.20
20 52017783 0.09
Ave 51445099 0.13
2SD 1317023 0.10
检测限:0.23
2.2重复性分析
用低值样本(同型半胱氨酸的浓度为5μmol/L)和中高值样本(同型半胱氨酸的浓度为20μmol/L)，重复测试10次，计算10次检测浓度的平均值 (M)和标准差(SD)，根据公式(2)计算变异系数(CV)，变异系数(CV) 应不大于10.0％。
CV＝SD/M×100％……………………(2)
式中：CV——变异系数；
SD——检测结果的标准差；
M——检测结果的平均值。
表3低值测试重复性测试
Figure BDA0003196689490000211
表4中高值测试重复性
测试次数 发光值 浓度值
1 5528701 19.59
2 5541924 19.55
3 5388369 20.11
4 5450883 19.87
5 5418848 19.99
6 5391873 20.09
7 5582201 19.40
8 5638680 19.21
9 5575463 19.43
10 5599129 19.35
Ave 5511607 19.66
SD 91831 0.33
CV 1.7％ 1.7％
从表3及表4的数据可以看出，用低值样本(5μmol/L)和中高值样本 (20μmol/L)，重复测试10次，计算10次检测浓度的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式(2)计算变异系数(CV)，变异系数(CV)分别为1.6％、 1.7％，均小于10.0％，这说明本发明实施例1的试剂盒符合试剂盒标准YY/T 1258—2015。
2.3线性分析
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，浓度分别为150μmol/L、60μmol/L、30μmol/L、15μmol/L、7.5μmol/L、0.5μmol/L 将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，求偏差CV，结果见表5所示。将三次测试值的平均值和配制的目标浓度(上述稀释的样本浓度)取对数后用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数R。从表5的数据可以看出每个梯度的重复性均小于10％，三次测试值的平均值与配制的目标浓度的偏差均小于10％，其相关系数R2≥0.9900(见图2)。这说明本发明HCY试剂盒的线性范围足够宽，完全满足临床要求。
表5
Figure BDA0003196689490000221
2.4特异性分析
将浓度不低于100mmol/L的L-半胱氨酸、100mmol/L的L-谷胱甘肽，使用本发明实施例1的HCY试剂盒进行直接进行测试，结果如表6所示，从表6中可以看出，测试1-5的测试结果低于该HCY试剂盒的最低检测限水平。这说明本发明实施例1的HCY试剂盒具有特异性。
表6
Figure BDA0003196689490000222
2.5相关性分析
我们收集了50个临床血清样本，采用本发明实施例1的试剂盒进行检测，检测结果与传统的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法，选用罗氏生化仪测试)的检测结果进行了相关回归等统计分析，检测如下表7 所示，分析结果如图3所示。从图3中可以看出，相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y＝0.9864x+0.5378，相关系数为R2＝0.9772，这表明本发明实施例1的HCY试剂盒与传统同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)相关性高，准确性非常一致，符合试剂盒标准YY/T 1258—2015。
表7
测试序号 医院值 测试值 测试序号 医院值 测试值
μmol/L μmol/L μmol/L μmol/L μmol/L
1 6.43 6.93 26 19.29 15.49
2 5.23 6.22 27 13.14 15.74
3 6.22 7.99 28 19.37 18.85
4 8.99 6.54 29 13.87 17.20
5 9.45 10.12 30 4.99 4.56
6 9.54 10.03 31 30.28 33.07
7 6.43 6.09 32 39.09 41.27
8 7.99 8.06 33 59.94 56.83
9 6.78 7.01 34 28.28 21.50
10 9.98 9.32 35 23.05 28.87
11 6.42 5.34 36 26.36 21.78
12 7.74 9.01 37 19.86 20.13
13 7.04 6.06 38 19.23 20.23
14 15.37 15.60 39 20.43 19.67
15 10.92 11.23 40 29.78 30.24
16 15.92 16.78 41 35.23 36.14
17 45.74 46.39 42 48.75 49.34
18 32.56 33.12 43 40.23 41.25
19 40.32 40.17 44 33.23 34.14
20 10.91 14.61 45 32.39 32.28
21 12.9 13.20 46 26.85 26.87
22 11.8 12.07 47 3.6 2.55
23 6.06 7.04 48 20.39 22.29
24 12.28 13.61 49 17.69 18.17
25 24.06 25.17 50 14.15 14.01
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (10)

1.一种同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，包括：还原试剂、酶试剂、发光酶试剂及磁珠试剂，四者的体积比例为(0.5-10)：(0.5-10)：(0.5-10)：(0.5-25)；
其中，所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦0.01-0.55wt％、二硫苏糖醇0.05-0.08wt％、β-巯基乙醇0.1-0.2mol/L、异硫氰酸胍0.01-0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.8wt％、十二烷基硫酸钠0.01-0.05wt％，pH值为7.4-8.3；
所述酶试剂为S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶；
所述发光酶试剂为同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物；
所述磁珠试剂由体积比例为(0.1-5):(0.5-10)的链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的同型半胱氨酸组成。
2.如权利要求1所述的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦0.01wt％、二硫苏糖醇0.05wt％、β-巯基乙醇0.1mol/L、异硫氰酸胍0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠0.8wt％、十二烷基硫酸钠0.05wt％，pH值为8.3。
3.如权利要求1所述的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦0.05wt％、二硫苏糖醇0.05wt％、β-巯基乙醇0.2mol/L、异硫氰酸胍0.1mol/L、乙二胺四乙酸二钠0.2wt％、十二烷基硫酸钠0.25wt％，pH值为8.0。
4.如权利要求1所述的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述还原试剂包含：三(2-羧乙基)膦0.55wt％、二硫苏糖醇0.08wt％、β-巯基乙醇0.1mol/L、异硫氰酸胍0.01mol/L、乙二胺四乙酸二钠0.02wt％、十二烷基硫酸钠0.01wt％，pH值为7.4。
5.如权利要求1所述的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述同型半胱氨酸试剂盒还包括校准品、质控品、发光底物试剂及清洗液。
6.如权利要求1所述的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述磁珠为1-5μm的羧基磁珠。
7.一种权利要求1-6任一项所述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)还原试剂的制备：配制包含0.01-0.55wt％三(2-羧乙基)膦、0.05-0.08wt％二硫苏糖醇、0.1-0.2mol/Lβ-巯基乙醇、0.01-0.2mol/L异硫氰酸胍、0.02-0.8wt％乙二胺四乙酸二钠、0.01-0.05wt％十二烷基硫酸钠，pH值为7.4-8.3的溶液；
2)发光酶试剂的制备：将重量比例为(1-5):(0.2-60)的抗同型半胱氨酸单克隆抗体与碱性磷酸酶复合物偶联，得到同型半胱氨酸单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物；
3)磁珠试剂的制备：将重量比例为(1-10)：(0.5-100)的链霉亲和素与磁珠微球偶联，得到链霉亲和素包被的磁珠；将重量比例为(1-10)：(0.2-50)的生物素与同型半胱氨酸偶联，得到生物素化的同型半胱氨酸；将链霉亲和素包被的磁珠与生物素化的同型半胱氨酸按(0.1-5):(0.5-10)的体积比例混合，即得所述磁珠试剂。
8.如权利要求7所述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述发光酶试剂的制备具体包括：
①碱性磷酸酶活化、离心弃上清，用缓冲液重复清洗；
②加入偶联剂温育后离心，弃上清；
③抗同型半胱氨酸单克隆抗体加入缓冲液过纯化柱；
⑤抗同型半胱氨酸单克隆抗体过透析膜，浓缩；
⑥向步骤②中加入步骤⑤中的抗同型半胱氨酸单克隆抗体，混匀，温育，离心，弃上清加入稀释液；
⑦加入封闭液混匀，清洗离心；
⑧弃上清加入保存液保存。
9.如权利要求7所述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述链霉亲和素包被的磁珠的制备具体包括：
①磁珠活化；
②加入偶联剂，混匀，温育后离心；
③链霉亲和素加入缓冲液过纯化柱；
④链霉亲和素过透析膜，浓缩；
⑤步骤④中的浓缩链霉亲和素加入到步骤②中，温育，混匀后离心，弃上清加入缓冲液；
⑥加入封闭液混匀偶联，8-24h后离心，弃上清加入保存液悬浮；
⑦弃上清加入保存液悬浮储存。
10.如权利要求7所述的同型半胱氨酸试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述生物素化的同型半胱氨酸的制备具体包括：
①将同型半胱氨酸用洗涤缓冲液洗涤，离心，弃上清，重复多次；
②使用稀释液稀释活化生物素；
③步骤②活化后的生物素与步骤①浓缩处理的同型半胱氨酸偶联，温育混匀后离心，弃上清加入稀释液；
④加入终止液终止偶联；
⑤加入缓冲液清洗；
⑥加入保存液储存。
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