CN116359513A - 一种用于检测尿转铁蛋白的试剂盒 - Google Patents
一种用于检测尿转铁蛋白的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于检测尿转铁蛋白的试剂盒，涉及医药生物检测技术领域，该试剂盒包括：试剂1和试剂2；其中，试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、曲拉通X‑100、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂；试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒、牛血清白蛋白。另外，试剂2还包括海藻糖、二氢槲皮素和羟脯氨酸。该试剂盒检测的重复性、均匀度均较优，且线性范围相对较广。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测尿转铁蛋白的试剂盒。
背景技术
转铁蛋白是一种特殊类型的球蛋白，相对分子量约为77000，等电点(PI)为5.6-6.6，它是一种敏感的内脏蛋白，在肝脏内合成。和白蛋白相似，均为带负电荷的小分子循环蛋白。当肾脏发生病变时，可从肾小球中漏出。由于转铁蛋白的等电点较白蛋白高，带有较多的负电荷，而肾小球过滤膜富含硫酸肝素糖蛋白和唾液酸蛋白带有大量负电荷，当转铁蛋白通过滤过膜时，受到的电荷排斥力较小，容易漏出，能反应出肾小球电荷屏障的受损。临床上主要用于铁缺乏症、肝脏等疾病的辅助诊断。
由于尿液中转铁蛋白含量低且干扰因素较多，因此测定困难，目前，现有技术中常用免疫比浊法进行转铁蛋白的检测，免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，该方法稳定性好、敏感性以及精确度较高，结果更为客观、准确。早期的相关案例，如文献：马岳, 夏铁安, 徐国宾. 尿液转铁蛋白免疫比浊法测定[J]. 北京大学学报(医学版), 1996, 02:155-156.即采用了此种方法。
再如，专利CN114047338A公开了一种转铁蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括检测试剂（包括试剂R1和R2），其中，R1包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、聚乙二醇、表面活性剂和水，R2包括第一转铁蛋白胶乳抗体分散液和第二转铁蛋白胶乳抗体分散液，该试剂盒检测具有重复性高、准确度高、稳定性强、涵盖了临床上大部分超高值样本和避免抗原过剩导致的假阴性结果等优势。
而专利CN106053838A则公开了一种测定转铁蛋白的试剂盒及其制备方法，该试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中，试剂R1：缓冲液、表面活性剂、防腐剂、稳定剂，试剂R2：缓冲液、表面活性剂、无机盐离子、防腐剂、转铁蛋白抗体，其溶剂为纯化水；该发明中的试剂盒具有操作方便、准确度高等优点。但该发明中的试剂盒重点检测是血浆中的转铁蛋白，而尿转铁蛋白的含量更低，检测更困难。
针对现有技术存在的尿转铁蛋白检测困难或准确度、精密度、稳定性等相对较低的问题，寻找一种检测重复性、均匀度、线性范围较优的尿转铁蛋白的试剂盒十分必要。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种用于检测尿转铁蛋白的试剂盒，该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度均较优，线性范围相对较广。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种试剂盒，包括：试剂1和试剂2；
所述试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、曲拉通X-100、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂；
所述试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒、牛血清白蛋白。
进一步地，所述试剂1包括：98-105mM三羟甲基氨基甲烷、144-155mM氯化钠、0.8-1.5mL/L曲拉通X-100、4.5-5.4g/L牛血清白蛋白、0.8-1.2mL/L液体生物防腐剂。
优选地，所述试剂1包括：100mM三羟甲基氨基甲烷、150mM氯化钠、1mL/L曲拉通X-100、5g/L牛血清白蛋白、1mL/L液体生物防腐剂。
进一步地，所述试剂2包括：98-105mM三羟甲基氨基甲烷、144-155mM氯化钠、28-32mL/L抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒、4.5-5.4g/L牛血清白蛋白。
优选地，所述试剂2包括：100mM三羟甲基氨基甲烷、150mM氯化钠、30mL/L抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒、5g/L牛血清白蛋白。
进一步地，所述试剂1和试剂2的体积比为3-4:1。
在一些具体的实施方式中，所述试剂盒中试剂1和试剂2的包装规格为：
试剂1:15ml×1，试剂2:5ml×1；
试剂1:30ml×1，试剂2:10ml×1；
试剂1:42ml×1，试剂2:14ml×1；
试剂1:42ml×2，试剂2:14ml×2；
试剂1:60ml×1，试剂2:20ml×1；
试剂1:60ml×2，试剂2:20ml×2；
试剂1:40ml×1，试剂2:10ml×1；
试剂1:40ml×2，试剂2:10ml×2；
试剂1:60ml×1，试剂2:15ml×1；
试剂1:60ml×2，试剂2:15ml×2；
进一步地，所述试剂2还包括海藻糖、二氢槲皮素和羟脯氨酸。
优选地，所述试剂2还包括5-10g/L海藻糖、2-4g/L二氢槲皮素和0.5-2g/L羟脯氨酸。
进一步优选地，所述试剂2还包括6.6g/L海藻糖、3.5g/L二氢槲皮素和1.2g/L羟脯氨酸。
进一步地，所述试剂盒还包括校准品和质控品。
在一些具体的实施方式中，所述试剂盒中校准品和质控品的的包装规格为：
校准品0.5ml×5，1ml×5；质控品0.5ml×2，1ml×2。
进一步地，所述校准品和质控品均包括转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂。
进一步地，所述液体生物防腐剂包括NaN3、苯甲酸钠、Proclin-200、Proclin-300或Proclin500中的一种或多种。优选为Proclin-300。
进一步地，所述抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒的制备方法包括以下步骤：将表面羧基化的聚苯乙烯乳胶颗粒加入至BES缓冲液中，再加入抗人转铁蛋白抗体、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，搅拌反应、离心去上清后，即得抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒。
在一些具体的实施方式中，所述抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒的制备方法包括以下步骤：将重量比为3:1的粒径为90nm和粒径为280mn的表面羧基化的聚苯乙烯乳胶颗粒加入至BES缓冲液中，使得乳胶颗粒的浓度为2%，再加入抗人转铁蛋白抗体、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，42℃条件下搅拌反应10h、离心去上清后，即得抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒。
进一步地，本发明中试剂1和试剂2的储存条件及有效期：
（1）试剂：2～8℃避光密闭储存可稳定18个月，开启后在2～8℃避光保存可稳定30天。
（2）校准品和质控品：2～8℃避光密闭储存可稳定18个月，开启后在2～8℃避光保存可稳定7天。
进一步地，本发明提供的上述的试剂盒能够应用于检测尿转铁蛋白。
本发明所取得的技术效果是：
1.本发明试剂盒中采用胶乳免疫比浊法对尿转铁蛋白进行检测，其中，试剂将抗体锚定在胶乳表面，胶乳表面包被的转铁蛋白抗体与样本中的转铁蛋白抗原结合，形成抗原抗体复合物，产生浊度变化，胶乳试剂可以特异的增大该浊度变化，增大试剂的灵敏度。该浊度变化的高低与样本中转铁蛋白的含量成正比。测定该浊度，与标准样本比较，即能得出样本中转铁蛋白的含量。
2.本发明的试剂盒试剂2中进一步加入海藻糖、二氢槲皮素和羟脯氨酸，三者协同发挥作用，有助于避免乳胶颗粒的凝集，同时也能维持稳定性状态，最终得到的试剂盒具有良好的性能，该试剂盒具有重复性、准确度均较优的特点，且线性范围相对较广，同时，其正确度|En|≤1，均匀性较优。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
值得说明的是，本发明中使用抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒的制备方法包括以下步骤：将重量比为3:1的粒径为90nm和粒径为280mn的表面羧基化的聚苯乙烯乳胶颗粒加入至BES缓冲液中，使得乳胶颗粒的浓度为2%，再加入抗人转铁蛋白抗体、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，42℃条件下搅拌反应10h、离心去上清后，即得抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒。其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表1实施例1试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
实施例2
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表2 实施例2试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
实施例3
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表3 实施例3试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
实施例4
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表4 实施例4试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
实施例5
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表5 实施例5试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
对比例1
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表6 对比例1试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
对比例2
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表7 对比例2试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
对比例3
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表8 对比例3试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
对比例4
一种试剂盒，包括：试剂1、试剂2、校准品和质控品；
表9 对比例4试剂盒中试剂1和试剂2的组成成分
校准品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。校准品的值经量值传递获得。
质控品：转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂（Proclin 300）。质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。
适用仪器
适用于日立7170/7600/7180/008AS/3500、迈瑞BS2000、迪瑞CS600、雅培C16000、东芝TBA120FR/TBA2000FR/TBA-FX8、贝克曼AU5800/AU680/AU2700/DXC800、西门子ADVIA2400/CH930/DIMENSION RXL、罗氏C701/C702 全自动生化分析仪。
样本要求
1、采用新鲜尿液样本，采集后需离心，取上清液。15～25℃保存可稳定7天，2～8℃保存可稳定2个月，-15～-25℃保存可稳定12个月。
2、样本中人白蛋白≤5000mg/L、葡萄糖≤2000mg/dL、肌酐≤44mmol/L、尿素≤900mmol/L、草酸盐≤2.2mmol/L、柠檬酸盐≤10mmol/L、磷酸盐≤40mmol/L对测试结果无明显干扰，超出限度时需进行确认。
检验方法
1、基本参数
1）反应类型：终点法2）温度：37℃
3）主波长：570nm4）次波长：/
5）样本量：5μl6）试剂1（R1）量：150μl
7）试剂2（R2）量：50μl8）反应方向：升反应
2、测定
3、校准
1）建议使用配套校准品进行校准，校准品为液体，可直接使用。校准品用量与样本量一致。
2）校准方法：本产品采用多点校准。
3）校准频率：试剂批号更换后；根据测定结果的需要。
4、质量控制
1）质控品为液体可直接使用。质控品用量与样本量一致。
2）以控制物质（质控品）来监测操作程序。质控结果在控，被认为操作程序正确，结果准确可靠；质控结果超出允许范围时，应采取纠正措施。
5、计算
以校准品的吸光度变化值△A（A校准-A空白）为纵坐标，其相应的浓度C校准为横坐标绘制校准曲线。根据样本的△A（A测定-A空白）在校准曲线上找出对应的样本浓度。
6、检测
试验方法：
重复性：使用各实例的试剂盒重复测试质控品（1mg/L）3次，得到平均值X以及标准差SD，计算变异系数CV=SD/X×100%；
批间差：分别取各实例的三批次试剂盒，每批次试剂盒重复测定质控品（1mg/L）3次，得到平均值X以及标准差SD，计算变异系数CV=SD/X×100%；
线性范围：将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本混合成不少于5个稀释度，对每一浓度样本重复检测3次，记录结果，计算平均值，以稀释度为自变量，根据因变量平均值求得线性回归方程，计算相关系数。
7、结果
（1）重复性
重复性结果统计至下表：
表10各实例试剂盒的重复性结果
（2）批间差
批间差结果统计至下表：
表11各实例试剂盒的批间差结果
（3）线性范围
线性范围结果统计至下表：
表12 各实例试剂盒的相关系数结果
经检测，本发明中的试剂盒在[0.2，60]mg/L范围内，理论浓度与实测浓度的线性相关系数（r）≥0.9900；在[0.2，5]mg/L范围内，线性绝对偏差不超过±1.0mg/L；在（5，60]mg/L范围内，线性相对偏差不超过±15.0%。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种试剂盒，其特征在于：包括：试剂1和试剂2；
所述试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、曲拉通X-100、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂；
所述试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒、牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂1包括：98-105mM三羟甲基氨基甲烷、144-155mM氯化钠、0.8-1.5mL/L曲拉通X-100、4.5-5.4g/L牛血清白蛋白、0.8-1.2mL/L液体生物防腐剂。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂2包括：98-105mM三羟甲基氨基甲烷、144-155mM氯化钠、28-32mL/L抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒、4.5-5.4g/L牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂1和试剂2的体积比为3-4:1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂2还包括海藻糖、二氢槲皮素和羟脯氨酸。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括校准品和质控品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品和质控品均包括转铁蛋白、牛血清白蛋白、液体生物防腐剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述液体生物防腐剂包括NaN3、苯甲酸钠、Proclin-200、Proclin-300或Proclin500中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒的制备方法包括以下步骤：将表面羧基化的聚苯乙烯乳胶颗粒加入至BES缓冲液中，再加入抗人转铁蛋白抗体、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，搅拌反应、离心去上清后，即得抗人转铁蛋白抗体乳胶颗粒。
10.如权利要求1-9任一项所述的试剂盒在检测尿转铁蛋白中的应用。
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