CN104459164B - 一种血清肌酐检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清肌酐检测试剂，属于临床体外检测技术领域。本发明在试剂R1中通过加入γ-Fe2O3纳米粒子增强了过氧化物酶的活性以及对底物的专一性，减少了抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽及胆红素等还原性物质的干扰，同时γ-Fe2O3纳米粒子还作为反应的催化剂，与过氧化物酶共同作用有效地除去了内源性肌酸的干扰。此外，本发明采用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)为色原，试剂更加稳定，分析灵敏度高。试剂R1中还加入了脂肪酶和脂蛋白脂酶等物质，可有效去除脂浊的影响，因而本发明试剂具有更强的抗干扰能力和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及用于临床测定血清中肌酐含量的检测试剂，属于临床体外检测技术领域。
背景技术
血清肌酐(Cr)，也称血肌酐，一般认为是内生血肌酐，内生肌酐是人体肌肉代谢的产物。在肌肉中，肌酸主要通过不可逆的非酶脱水反应缓缓地形成肌酐，再释放到血液中，随尿排泄。因此血肌酐与体内肌肉总量关系密切，不易受饮食影响。肌酐是小分子物质，可通过肾球滤过，在肾小管内很少吸收，每日体内产生的肌酐，几乎全部随尿排出，一般不受尿量影响。临床上检测血肌酐是常用的了解肾功能的主要方法之一，血清肌酐升高意味着肾功能的损害。血清肌酐测定在临床上对于因肾小球高度病变而引起的肾功能不全、肾炎等肾脏疾病以及尿毒症的诊断治疗、观察都是一种必需的临床生化检查项目。
目前，我国临床实验室测定血清肌酐的方法主要有两类，一类是属化学测定法的碱性苦味酸速率法(Jaffe速率法)，另一类是酶学测定法。目前临床上肌酐的测定多采用不去蛋白的Jaffe苦味酸速率法，此方法有一定的局限性，不能排除一些药物如维生素C、头孢类抗菌素及体内一些代谢物质如丙酮酸等对测定产生的干扰，常导致结果出现假阳性增高；此外，样本中高红素及乳糜血的存在，也造成肌酐测定值降低。而酶促动力学法测定肌酐，基本上排除了这类物质的干扰，使肌酐的测定结果更趋于真值。市场上现有的酶法肌酐测定试剂，其抗干扰能力不强、精密度和准确度不高，检测效果不理想。
发明内容
为克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好、准确度高的肌酐酶法检测试剂。
本发明的原理如下：
第一步：去除内源肌酸的干扰
第二步：测定血清肌酐
以第一步反应产生的醌亚胺为空白，仅以第二步产生的醌亚胺计算出肌酸的含量，以此去除内源性肌酸的影响。
本发明所采用的技术方案是：
一种血清肌酐检测试剂，其特征在于：它包括试剂R1、试剂R2；所述试剂R1组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）10-45mmol/L
肌酸酶2-18KU/L
肌氨酸氧化酶6-15KU/L
抗坏血酸氧化酶1-15KU/L
脂肪酶1-10KU/L
脂蛋白脂酶1-10KU/L
胆红素氧化酶1-10KU/L
纳米粒子10-50mmol/L
TOOS0.1-0.6mmol/L
4-氨基安替比林0.1-0.4mmol/L
亚铁氰化钾10-20μmol/L
BSA0.1-3g/L
蔗糖5-20g/L
过氧化物酶1.5-3KU/L
吐温-200.8-1.5g/L
叠氮钠1-3g/L；
试剂R2组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）10-45mmol/L
肌酐酶55-80KU/L
BSA0.5-3g/L
蔗糖5-20g/L
吐温-200.8-1.5g/L
叠氮钠1-3g/L。
所述纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，其粒径大小为3-50nm。
作为本发明的一种优选，所述试剂R1中各组分为：
Tris缓冲液（pH7.8）40mmol/L
肌酸酶16KU/L
肌氨酸氧化酶8KU/L
抗坏血酸氧化酶5KU/L
脂肪酶4KU/L
脂蛋白脂酶5KU/L
胆红素氧化酶3KU/L
纳米粒子40mmol/L
TOOS0.4mmol/L
4-氨基安替比林0.13mmol/L
亚铁氰化钾20μmol/L
BSA1g/L
蔗糖10g/L
过氧化物酶2KU/L
吐温-201g/L
叠氮钠1.5g/L。
所述试剂R2中各组分为：
Tris缓冲液（pH7.8）40mmol/L
肌酐酶60KU/L
BSA1g/L
蔗糖10g/L
吐温-201g/L
叠氮钠1.5g/L。
本发明所述的γ-Fe2O3纳米粒子是采用常规微乳-水热法或超声沉淀法合成。
本发明的有益效果如下：
1）采用两步反应法，在第一步可有效去除血清内源肌酸的干扰。
在试剂R1中通过加入γ-Fe2O3纳米粒子增强了过氧化物酶的活性以及对底物的专一性，减少了抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽及胆红素等还原性物质的干扰，同时γ-Fe2O3纳米粒子还作为反应的催化剂，与过氧化物酶共同作用催化Trinder反应，使得反应进行的更彻底，有效地除去了内源性肌酸的干扰。
2）采用新色源N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，试剂更加稳定，分析灵敏度高。
3）试剂R1中加入的脂肪酶和脂蛋白脂酶等物质，可有效去除脂浊的影响，使本发明试剂具有更强的抗干扰能力和灵敏度。
附图说明
图1是本发明实施例1所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；
图2是本发明实施例2所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；
图3是本发明实施例3所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；
图4是本发明实施例1-3所得试剂与对照组试剂稳定性试验结果图。
具体实施方式
实施例1
一种血清肌酐检测试剂包括试剂R1和试剂R2，采用液体双试剂比色法测试血清中肌酐的含量，其试剂主要成分如下所示：
试剂R1组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）10mmol/L
肌酸酶2KU/L
肌氨酸氧化酶6KU/L
抗坏血酸氧化酶1KU/L
脂肪酶1KU/L
脂蛋白脂酶1KU/L
胆红素氧化酶1KU/L
γ-Fe2O3纳米粒子10mmol/L
TOOS0.1mmol/L
4-氨基安替比林0.1mmol/L
亚铁氰化钾10μmol/L
BSA0.1g/L
蔗糖5g/L
过氧化物酶1.5KU/L
吐温-200.8g/L
叠氮钠1g/L；
试剂R2组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）10mmol/L
肌酐酶55KU/L
BSA0.5g/L
蔗糖5g/L
吐温-200.8g/L
叠氮钠1g/L。
上述试剂R1中γ-Fe2O3纳米粒子粒径在3-20nm。
实施例2
一种血清肌酐检测试剂包括试剂R1和试剂R2，其试剂主要成分如下所示：
试剂R1组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）45mmol/L
肌酸酶18KU/L
肌氨酸氧化酶15KU/L
抗坏血酸氧化酶15KU/L
脂肪酶10KU/L
脂蛋白脂酶10KU/L
胆红素氧化酶10KU/L
纳米粒子50mmol/L
TOOS0.6mmol/L
4-氨基安替比林0.4mmol/L
亚铁氰化钾20μmol/L
BSA3g/L
蔗糖20g/L
过氧化物酶3KU/L
吐温-201.5g/L
叠氮钠3g/L；
试剂R2组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）45mmol/L
肌酐酶80KU/L
BSA3g/L
蔗糖20g/L
吐温-201.5g/L
叠氮钠3g/L。
上述试剂R1中γ-Fe2O3纳米粒子粒径在20-50nm。
实施例3
一种血清肌酐检测试剂包括试剂R1和试剂R2，其试剂主要成分如下所示：
试剂R1组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）40mmol/L
肌酸酶16KU/L
肌氨酸氧化酶8KU/L
抗坏血酸氧化酶5KU/L
脂肪酶4KU/L
脂蛋白脂酶5KU/L
胆红素氧化酶3KU/L
纳米粒子40mmol/L
TOOS0.4mmol/L
4-氨基安替比林0.13mmol/L
亚铁氰化钾20μmol/L
BSA1g/L
蔗糖10g/L
过氧化物酶2KU/L
吐温-201g/L
叠氮钠1.5g/L；
试剂R2组成为：
Tris缓冲液（pH7.8）40mmol/L
肌酐酶60KU/L
BSA1g/L
蔗糖10g/L
吐温-201g/L
叠氮钠1.5g/L。
上述试剂R1中γ-Fe2O3纳米粒子粒径在20-30nm。
本发明描述的肌酐检测试剂的使用方法是：在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如东芝40全自动分析仪等，利用双试剂速率法进行测定。将R1和R2放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、Randox复合校准品（英国朗道实验诊断有限公司）和样本，操作如表1：
表1本发明的血清肌酐检测试剂检测方法
计算：肌酐含量（μmol/L）＝（?A测定/min÷?A标准/min）×C标准。
对本发明实施例1-3制得的试剂分别进行干扰性试验、相关性试验和稳定性对比试验。
干扰性试验：
取新鲜混合血清，分成3等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求，然后分别用本发明实施例1-3所得试剂，与市场常见的肌酐试剂（酶法）、肌酐试剂（Jaffe速率法）同时对比测定血清中肌酐的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。
表2不同实施例试剂抗干扰性能比较
由表2可以看出，本发明的试剂在胆红素≤425μmol/L、血红蛋白≤20g/L、甘油三酯≤11.3mmol/L、抗坏血酸≤1704μmol/L，对测试结果没有明显干扰。而其他两种对照例试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这是由于本发明实施例试剂中通过加入γ-Fe2O3纳米粒子增强了过氧化物酶的活性以及对底物的专一性，减少了抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽及胆红素等还原性物质的干扰，同时γ-Fe2O3纳米粒子还作为反应的催化剂，与过氧化物酶共同作用催化Trinder反应，使得反应进行的更彻底，有效地除去了内源性肌酸的干扰。此外，加入的脂肪酶和脂蛋白脂酶可有效避免脂浊干扰。本发明的试剂抗干扰性能远远优于其他对比试剂。
相关性试验：
根据实施例1-3配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的肌酐测定试剂进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。试验还研究了本发明实施例1-3所得的试剂与对照组试剂检测的相关性曲线，如图1-3所示。
表3实施例3试剂与市场常见并得到认可的肌酐测定试剂盒对比检测结果
检测结果显示，本发明试剂与对照组试剂的相关性较好，相关系数最高可达0.9952，说明了本发明的肌酐肌酐检测试剂具有较好的灵敏度，符合国家食品药品监督管理局的要求。
试剂的稳定性对比试验：
对实施例1-3制得的试剂，均匀分装13组作为试验组试剂，每组的试剂量为R1为20mL，R2为5mL；取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的肌酐测定试剂作为对照组，对照组与试验组同时放置到2-8℃冰箱中保存，每月的同一天取出一组试验组和对照组试剂检测肌酐质控品（靶值为124μmol/L），检测结果如图4所示。
试验结果说明本发明实施例1-3制得的肌酐测定试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的肌酐测定试剂更加稳定。
Claims (3)
1.一种血清肌酐检测试剂，其特征在于：它包括试剂R1、试剂R2；所述试剂R1组成为：
pH7.8的Tris缓冲液10-45mmol/L
肌酸酶2-18KU/L
肌氨酸氧化酶6-15KU/L
抗坏血酸氧化酶1-15KU/L
脂肪酶1-10KU/L
脂蛋白脂酶1-10KU/L
胆红素氧化酶1-10KU/L
纳米粒子10-50mmol/L
TOOS0.1-0.6mmol/L
4-氨基安替比林0.1-0.4mmol/L
亚铁氰化钾10-20μmol/L
BSA0.1-3g/L
蔗糖5-20g/L
过氧化物酶1.5-3KU/L
吐温-200.8-1.5g/L
叠氮钠1-3g/L；
所述纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，其粒径大小为3-50nm；
试剂R2组成为：
pH7.8的Tris缓冲液10-45mmol/L
肌酐酶55-80KU/L
BSA0.5-3g/L
蔗糖5-20g/L
吐温-200.8-1.5g/L
叠氮钠1-3g/L。
2.根据权利要求1所述的血清肌酐检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中各组分为：
pH7.8的Tris缓冲液40mmol/L
肌酸酶16KU/L
肌氨酸氧化酶8KU/L
抗坏血酸氧化酶5KU/L
脂肪酶4KU/L
脂蛋白脂酶5KU/L
胆红素氧化酶3KU/L
纳米粒子40mmol/L
TOOS0.4mmol/L
4-氨基安替比林0.13mmol/L
亚铁氰化钾20μmol/L
BSA1g/L
蔗糖10g/L
过氧化物酶2KU/L
吐温-201g/L
叠氮钠1.5g/L。
3.根据权利要求1所述的血清肌酐检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中各组分为：
pH7.8的Tris缓冲液40mmol/L
肌酐酶60KU/L
BSA1g/L
蔗糖10g/L
吐温-201g/L
叠氮钠1.5g/L。
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