CN111007023B - 一种血清总铁结合力检测试剂盒及其配制方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于临床体外检测试剂技术领域，尤其涉及一种血清总铁结合力检测试剂盒及其配制方法和检测方法，包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4，配制时，先用纯化水分别配制试剂R1、R2、R3、R4的缓冲液，再按照试剂R1、R2、R3、R4中各组分的比例添加其他物质，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH，得到所需总铁结合力的检测试剂盒。本发明的有益效果是：血清标本无需任何处理即可用于自动分析，具有结果准确、灵敏度高、线性范围宽、操作简便快速、测定试剂稳定等特点，可应用于多种品牌开放通道的临床生化分析仪的血清总铁结合力检测试剂盒及检测方法。
Description
技术领域
本发明属于临床体外检测试剂技术领域，尤其涉及一种血清总铁结合力检测试剂盒及其配制方法和检测方法。
背景技术
铁是人体最丰富的必须微量元素之一，是合成红细胞中血红蛋白的主要原料，广泛参与人体内的代谢过程。存在于正常成人体内的铁平均3-4.5g左右，全身所有的铁约70％存在于血红蛋白中少量存在于肌红蛋白中，而各种酶和血浆中运输状态的铁，仅占全身铁的极小部分，缺铁或含铁过多都会引发各种疾病。转铁蛋白又名运铁蛋白是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，供成熟红细胞的生成。血清中只有三分之一的转铁蛋白与铁结合，其余三分之二未结合，转铁蛋白这种潜在的结合铁的能力称为不饱和铁结合力UIBC(Unsaturated Iron Binding Capacity)，血清转铁蛋白可结合全部铁的能力称为血清总铁结合力TIBC(Total Iron BindingCapacity)，等于血清铁与不饱和铁结合力之和。总铁结合力是指血清(浆)中转铁蛋白全部与铁结合后铁的总量，实际上反映的是血中转铁蛋白的水平。其血清总铁结合力增高：见于缺铁性贫血、急性肝炎等。血清总铁结合力降低：见于肝硬变、肾病、尿毒症和血色沉着症。血清铁的测定对诊断血液系统、肝肾疾病、蛋白质缺乏症具有重要意义。
测定血清总铁结合力(total iron-binding capacity，TIBC)的方法较多，氧化铝吸附剂吸附多余的未结合的铁测定TIBC方法，经离心去除吸附剂再显色测定，这些方法标本用量大，操作繁琐，影响结果的因素较多，灵敏度低，耗时，不适宜于自动化分析，其在临床上的推广使用受到限制。传统碳酸镁沉淀法测定血清TIBC需要沉淀、离心、只能手工法操作，前处理过程中影响因素较多，随机误差较大，只适合在实验室开展使用。采用微柱过滤法进行前处理，能在一定程度上减少前处理过程中人为的影响因素，增加了检测成本，只适合在实验室开展使用。铬天青法测定血清总铁结合力，不需吸附和离心去除多余的铁，但该方法的稳定性差，试剂保存期限短，仅仅可稳定三个月。以上总铁结合力检测方法均操作繁琐，精度低，定量能力差，耗时长，样本需要前处理，不能快速检测，不适宜于自动化分析，其在临床上的推广使用受到限制，不能作为临床常规项目开展。
发明内容
为了克服上述现有检测方法的不足，本发明提供一种血清总铁结合力检测试剂盒及其配制方法和检测方法，血清标本无需任何处理即可用于自动分析，具有结果准确、灵敏度高、线性范围宽、操作简便快速、测定试剂稳定等特点，可应用于多种品牌开放通道的临床生化分析仪的血清总铁结合力检测试剂盒及检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种血清总铁结合力检测试剂盒，其特征在于包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4，其中：
试剂R1的组成及各组分的含量为：
试剂R2的组成及各组分的含量为：
试剂R3的组成及各组分的含量为：
试剂R4的组成及各组分的含量为：
优选地，试剂R1的pH为8-10，试剂R2的pH为5-7，试剂R3的PH为8-10，试剂R4的PH为5-7；
优选地，试剂R1与试剂R2的体积比为2～6:1，试剂R3与试剂R4的体积比为2～6:1，进一步优选地，试剂R1与试剂R2最佳体积比为5:1，试剂R3与试剂R4最佳体积比为5:1。
优选地，试剂R1的缓冲液为氢氧化钠和甘氨酸组成的缓冲液或Tris缓冲液，试剂R2缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，试剂R3缓冲液为碳酸氢钠和三羟甲基氨基甲烷组成的缓冲液，或为碳酸钠和碳酸氢钠组成的缓冲液，试剂R4缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液；
优选地，试剂R1和试剂R3的表面活性剂为曲拉通系列或吐温系列的一种或多种；
进一步优选地，试剂R2所用的螯合剂为乙二胺四乙酸二钠或EGTA；
进一步优选地，试剂R3、试剂R4中的抗干扰剂选自硫脲、氨基硫脲、N,N-二甲基硫脲和异硫脲中的一种或多种。
优选地，试剂R2和试剂R4所用的稳定剂选自聚蔗糖系列，BSA，PEG系列中的一种或多种；
优选地，试剂R1的缓冲液组分为氢氧化钠3-4g/L，甘氨酸6-8g/L；试剂R3的缓冲液组分为碳酸氢钠12-13g/L，三羟甲基氨基甲烷或碳酸钠36-37g/L。
一种血清总铁结合力检测试剂盒的配制方法，其特征在于包括以下步骤：先用纯化水分别配制试剂R1、R2、R3、R4的缓冲液，再按照试剂R1、R2、R3、R4中各组分的含量添加其他物质，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH，使得试剂R1的pH为8-10，试剂R2的pH为5-7，试剂R3的PH为8-10，试剂R4的PH为5-7，得到所需总铁结合力的检测试剂盒。
优选地，试剂R1的配制包括如下步骤：
按照试剂R1的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，再按照试剂R1其他组分的含量将盐酸羟胺、表面活性剂、氯化铟依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节PH至8-10。
优选地，试剂R2的配制包括如下步骤：
按照试剂R2的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，再按照试剂R2其他组分的含量将3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5″-二磺酸二钠盐、螯合剂、稳定剂溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5-7。
优选地，试剂R3的配制包括如下步骤：
按照试剂R3的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R3缓冲液，再按照试剂R3其他组分的含量将表面活性剂、抗干扰剂、三氯化铁溶于制得的R3缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至8-10。
优选地，试剂R4的配制包括如下步骤：
按照试剂R4的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R4缓冲液，再按照试剂R4其他组分的含量将抗坏血酸、盐酸羟胺、1-氧代-2-羟基吡啶、抗干扰剂、稳定剂、3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5″-二磺酸二钠盐溶于制得的R4缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5-7。
一种血清总铁结合力的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：Fe的浓度测试
将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R1混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本；加入40μl试剂R2混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本；
步骤2：UIBC的浓度测试
进行UIBC浓度测试时，将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R3混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本，加入40μl试剂R4混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本；
步骤3：待测样本血清总铁结合力TIBC浓度的计算，计算公式为：TIBC＝Fe+UIBC，其中：
式中，△A校准＝A校准-A空白；△A样本＝A样本-A空白；
A校准＝A2校准-A1校准；A样本＝A2样本-A1样本；A空白＝A2空白-A1空白。
优选地，使用全自动生化分析仪测定吸光度，反应方向为正方向，采用两点终点法计算血清总铁结合力TIBC浓度。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的试剂盒及检测方法，使得血清标本无需任何处理即可用于自动分析，具有结果准确、灵敏度高、线性范围宽、操作简便快速、测定试剂稳定等特点，可应用于多种品牌开放通道的临床生化分析仪的总铁结合力的检测试剂盒及检测方法，适合在临床上推广使用。
2、在测得TIBC的同时，还能单独测血清铁含量与血清不饱和铁结合力，可以从多个方面评价贫血和肝病状况，在临床检测上有重大意义。
3、试剂R2和R4中添加了稳定剂，增加了试剂的稳定性，使试剂保存12个月以上仍然稳定。
4、采用两点终点法，反应方向为正反应从开始到结束仅需10分钟，耗时短，操作简单，精度高，定量能力好。
具体实施方式
下面首先介绍一下本发明的试剂盒检测血清中总铁结合力的基本原理。
在酸性条件下，血清中的铁离子与转铁蛋白分离，与还原剂和显色剂作用生成蓝色络合物，此产物在600nm有最大吸收，其吸收强度与血清中铁离子的含量成正比，通过与校准比较可计算出血清铁的含量。在有过量铁离子存在的碱性缓冲液中，血清中未与铁结合的转铁蛋白全部与铁离子结合，剩余的铁离子与还原剂、显色剂作用后生成蓝色络合物(600nm)。通过计算缓冲液中铁离子的减少量就可计算出血清不饱和铁结合力。总铁结合力等于血清铁含量与血清不饱和铁结合力的和。具体反应原理图如下：
(1)试剂R1中加入样本后发生如下反应，可根据下述反应测得血清铁含量Fe。
再加入试剂R2后发生如下反应：
Fe2++Ferene S------------蓝色络合物
(2)试剂R3中加入样本后发生如下反应，可根据下述反应测得血清不饱和铁结合力UIBC。
试剂R3加入样本反应后剩余Fe3+在试剂R4加入后，发生如下反应：
Fe2++Ferene S--------蓝色络合物
总铁结合力(TIBC)的计算：TIBC＝Fe+UIBC
下面介绍一下本发明的具体实施方案。
本发明的总铁结合力检测试剂盒包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4试剂，包括的组分和相应含量如下：
一种血清总铁结合力检测试剂盒，其特征在于包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4，其中：
试剂R1的组成及各组分的含量为：
试剂R2的组成及各组分的含量为：
试剂R3的组成及各组分的含量为：
试剂R4的组成及各组分的含量为：
其中，试剂R1的pH为8-10，试剂R2的pH为5-7，试剂R3的PH为8-10，试剂R4的PH为5-7；
使用时，试剂R1与试剂R2的体积比为2～6:1，试剂R3与试剂R4的体积比为2～6:1，其中试剂R1与试剂R2最佳体积比为5:1，试剂R3与试剂R4最佳体积比为5:1。
作为本发明的优选方案，试剂R1的缓冲液为氢氧化钠和甘氨酸组成的缓冲液或Tris缓冲液，试剂R2缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，试剂R3缓冲液为碳酸氢钠和三羟甲基氨基甲烷组成的缓冲液，或为碳酸钠和碳酸氢钠组成的缓冲液，试剂R4缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液；
试剂R1和试剂R3的表面活性剂为曲拉通系列或吐温系列的一种或多种；
试剂R2所用的螯合剂为乙二胺四乙酸二钠或EGTA；
试剂R3、试剂R4中的抗干扰剂选自硫脲、氨基硫脲、N,N-二甲基硫脲和异硫脲中的一种或多种。
试剂R2和试剂R4所用的稳定剂选自聚蔗糖系列，BSA，PEG系列中的一种或多种；
当本发明中试剂R1的缓冲液使用氢氧化钠和甘氨酸缓冲液时，组分浓度为氢氧化钠3-4g/L，甘氨酸6-8g/L；当试剂R3的缓冲液使用碳酸氢钠与三羟甲基氨基甲烷(或碳酸钠)时，组分浓度为碳酸氢钠12-13g/L，三羟甲基氨基甲烷或碳酸钠36-37g/L。
本发明中，上述血清总铁结合力检测试剂盒的配制方法包括如下步骤：先用纯化水分别配制试剂R1、R2、R3、R4的缓冲液，再按照试剂R1、R2、R3、R4中各组分的含量添加其他物质，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH，使得试剂R1的pH为8-10，试剂R2的pH为5-7，试剂R3的PH为8-10，试剂R4的PH为5-7，得到所需总铁结合力的检测试剂盒。其中：
试剂R1的配制步骤为：按照试剂R1的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，再按照试剂R1其他组分的含量将盐酸羟胺、表面活性剂、氯化铟依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节PH至8-10。
试剂R2的配制步骤为：按照试剂R2的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，再按照试剂R2其他组分的含量将3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5″-二磺酸二钠盐、螯合剂和稳定剂溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5-7。
试剂R3的配制步骤为：按照试剂R3的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R3缓冲液，再按照试剂R3其他组分的含量将表面活性剂、抗干扰剂、三氯化铁溶于制得的R3缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至8-10。
试剂R4的配制步骤为：按照试剂R4的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R4缓冲液，再按照试剂R4其他组分的含量将抗坏血酸、盐酸羟胺、1-氧代-2-羟基吡啶、抗干扰剂、稳定剂、3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5″-二磺酸二钠盐溶于制得的R4缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5-7。
利用上述方法配制的血清总铁结合力的试剂盒检测血清总铁结合力的方法，包括如下步骤：
步骤1：Fe的浓度测试
将校准品、待测样品或纯化水20μl与200μl试剂R1混合，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A1；加入40μl试剂R2混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2，计算吸光度变化△A的平均值；
步骤2：UIBC的浓度测试
将校准品、待测样品或纯化水20μl与200μl试剂R3混合，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A1；加入40μl试剂R4混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2，计算吸光度变化△A的平均值；
步骤3：待测样本血清总铁结合力TIBC浓度的计算，计算公式为：TIBC＝Fe+UIBC，其中：
式中，△A校准＝A校准-A空白；△A样本＝A样本-A空白；
A校准＝A2校准-A1校准；A样本＝A2样本-A1样本；A空白＝A2空白-A1空白。
进行Fe浓度测试时，将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R1混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本，加入40μl试剂R2混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本；
进行UIBC浓度测试时，将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R3混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本，加入40μl试剂R4混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本。
检测过程中，本发明使用全自动生化分析仪测定吸光度，反应方向为正方向，采用两点终点法计算血清总铁结合力TIBC浓度。
本发明不仅可以得到TIBC，而且可以直接测得Fe和UIBC两个指标，在贫血和肝病方面有更好的检测结果，在临床检测上有重大意义。
具体的测试条件如表1所示。
表1
本发明提供的试剂盒及检测方法，使得血清标本无需任何处理即可用于自动分析，具有操作简便快速、结果准确、灵敏度高、线性范围宽、测定试剂稳定等特点。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的讲解说明。
实施1
本发明的总铁结合力的检测试剂盒包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4试剂，包括的成分和相应含量：
试剂R1的组分及各组分含量为：
试剂R1的配制过程为：将氢氧化钠和甘氨酸缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，按照试剂R1组分含量将盐酸羟胺、曲拉通100、氯化铟依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至9.45。
试剂R2的组分及各组分含量为：
试剂R2的配制过程为：将乙酸(冰醋酸)溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将3-(2-吡啶基)-5，6-二(2-呋喃基)-1，2，4-三嗪-5′，5″-二磺酸二钠盐(Ferene S)、乙二胺四乙酸二钠、聚蔗糖400溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5.95。
试剂R3的组分及各组分含量为：
试剂R3的配制过程为：将碳酸氢钠和三羟甲基氨基甲烷溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R3缓冲液，按照试剂R3组分含量将曲拉通100、硫脲、三氯化铁溶于制得的R3缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至8.65。
试剂R4的组分及各组分含量为：
试剂R4的配制过程为：将乙酸溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R4缓冲液，按照试剂R4组分含量将抗坏血酸、盐酸羟胺、1-氧代-2-羟基吡啶(HPO)、硫脲、聚蔗糖400和3-(2-吡啶基)-5，6-二(2-呋喃基)-1，2，4-三嗪-5′，5″-二磺酸二钠盐(Ferene S)溶于制得的R4缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至6.68。
利用上述方法配制的血清总铁结合力的试剂盒对血清总铁结合力进行检测。
步骤1：Fe的浓度测试
将校准品、待测样品或纯化水20μl与200μl试剂R1混合，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A1；加入40μl试剂R2混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2，计算吸光度变化△A的平均值；
步骤2：UIBC的浓度测试
将校准品、待测样品或纯化水20μl与200μl试剂R3混合，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A1；加入40μl试剂R4混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2，计算吸光度变化△A的平均值；
步骤3：待测样本血清总铁结合力TIBC浓度的计算，计算公式为：TIBC＝Fe+UIBC，其中：
式中，△A校准＝A校准-A空白；△A样本＝A样本-A空白；
A校准＝A2校准-A1校准；A样本＝A2样本-A1样本；A空白＝A2空白-A1空白。
进行Fe浓度测试时，将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R1混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本，加入40μl试剂R2混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本。
进行UIBC浓度测试时，将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R3混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本，加入40μl试剂R4混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本。
采用两点终点法，反应方向为正反应从开始到结束仅需10分钟，耗时短，操作简单，精度高，定量能力好。
用本方法和《临床检验操作规程》第四版所推荐的碳酸镁吸附法同时测定了40份血清样本。将实施例1的检测试剂作为实验组，市场上碳酸镁吸附法检测的结果作为对照组进行检测，对40个临床血清样本进行检测，检测结果如表2所示。
表2碳酸镁吸附法与实施例1测定结果对比
由表2可知：《全国临床检验操作规程》第4版中的碳酸镁吸附法和实施例1的相关系数r为0.9926，两者显示了极好的线性相关性，证明实施例1的试剂盒检测结果准确性好。
对实施例1的试剂进行稳定性测试，将实施例1新配制试剂与过效期12个月的实施例1试剂进行稳定性测试，测试结果如表3所示。
表3实施例1试剂稳定性测试结果
由表3可知，该新配制试剂和过效期试剂在测试40个样本时，相对偏差不大于5％，试剂可以稳定保存12个月，可见其稳定性好。
实施2
本发明的血清总铁结合力检测试剂盒包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4试剂，包括的成分和相应含量为：
试剂R1的组分及各组分含量为：
试剂R1的配制过程为：将Tris缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，按照试剂R1组分含量将盐酸羟胺、吐温20、氯化铟依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH为9.10。
试剂R2的组分及各组分含量为：
试剂R2的配制过程为：将乙酸(冰醋酸)溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将3-(2-吡啶基)-5，6-二(2-呋喃基)-1，2，4-三嗪-5′，5″-二磺酸二钠盐(Ferene S)、乙二胺四乙酸二钠、BSA溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH为5.95。
试剂R3的组分及各组分含量为：
试剂R3的配制过程为：将碳酸氢钠和三羟甲基氨基甲烷溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R3缓冲液，按照试剂R3组分含量将吐温20、氨基硫脲、三氯化铁溶于制得的R3缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至8.68。
试剂R4的组分及各组分含量为：
试剂R4的配制过程为：将乙酸(冰醋酸)溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R4缓冲液，按照试剂R4组分含量将抗坏血酸、盐酸羟胺、1-氧代-2-羟基吡啶(HPO)、硫脲、BSA、3-(2-吡啶基)-5，6-二(2-呋喃基)-1，2，4-三嗪-5′，5″-二磺酸二钠盐(Ferene S)溶于制得的R4缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH为6.85。
本发明使用上述血清总铁结合力检测试剂盒来测定血清总铁结合力的方法，具体步骤与实施例1相同。
用本方法和《临床检验操作规程》第四版所推荐的碳酸镁吸附法同时测定了40份血清样本。将实施例2的检测试剂作为实验组，市场上碳酸镁吸附法检测的结果作为对照组进行检测，对40个临床血清样本进行检测，检测结果如表4所示。
表4碳酸镁吸附法与实施例2测定结果对比
由表4可知：碳酸镁吸附法和实施例2的相关系数r为0.9924，两者显示了极好的线性相关性。证明实施例2的试剂盒检测结果准确性很好。
对实施例2的试剂进行稳定性测试，将实施例2新配制试剂与过效期12个月的实施例2试剂进行稳定性测试，测试结果如表5所示。
表5试剂稳定性测试表
由表5可知，使用实施例2新配制的试剂和过效期试剂在测试40个样本时，相对偏差不大于5％，试剂可以稳定保存12个月，可见其稳定性好。
实施3
本发明的总铁结合力的检测试剂盒包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4试剂，包括的成分和相应含量为：
试剂R1的组分及各组分含量为：
试剂R1的配制过程为：将氢氧化钠和甘氨酸缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，按照试剂R1组分含量将盐酸羟胺、曲拉通100、氯化铟依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至9.18。
试剂R2的组分及各组分含量为：
试剂R2的配制过程为：将柠檬酸溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将3-(2-吡啶基)-5，6-二(2-呋喃基)-1，2，4-三嗪-5′，5″-二磺酸二钠盐(Ferene S)、EGTA和BSA溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5.86。
试剂R3的组分及各组分含量为：
试剂R3的配制过程为：将碳酸氢钠和碳酸钠溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R3缓冲液，按照试剂R3组分含量将曲拉通100、硫脲、三氯化铁溶于制得的R3缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至8.42。
试剂R4的组分及各组分含量为：
试剂R4的配制过程为：将乙酸(冰醋酸)溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R4缓冲液，按照试剂R4组分含量将抗坏血酸、盐酸羟胺、1-氧代-2-羟基吡啶(HPO)、硫脲、PEG2000、3-(2-吡啶基)-5，6-二(2-呋喃基)-1，2，4-三嗪-5′，5″-二磺酸二钠盐(Ferene S)溶于制得的R4缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至6.48。
本发明使用上述血清总铁结合力检测试剂盒来测定血清总铁结合力的方法，具体步骤与实施例1相同。
采用两点终点法，反应方向为正反应从开始到结束仅需10分钟，耗时短，操作简单，精度高，定量能力好。
用本方法和《临床检验操作规程》第四版所推荐的碳酸镁吸附法同时测定了40份血清样本。将实施例3的检测试剂作为实验组，市场上碳酸镁吸附法检测的结果作为对照组进行检测，对40个临床血清样本进行检测，检测结果如表6所示。
表6碳酸镁吸附法与实施例3测定结果对比
由表6可知：碳酸镁吸附法和实施例的相关系数r为0.9941，两者显示了极好的线性相关性。证明实施例3的试剂盒检测结果准确性很好。
对实施例3的试剂进行稳定性测试，将实施例3新配制试剂与过效期12个月的实施例3试剂进行稳定性测试，测试结果如表7所示。
表7试剂稳定性测试结果
由表7可知，实施例3新配制试剂和过效期试剂在测试40个样本时，相对偏差不大于5％，试剂可以稳定保存12个月，可见其稳定性好。
以上对本发明的实例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种血清总铁结合力检测试剂盒，其特征在于包括四个独立的试剂R1、R2、R3和R4，其中：
试剂R1的组成及各组分的含量为：
试剂R2的组成及各组分的含量为：
试剂R3的组成及各组分的含量为：
试剂R4的组成及各组分的含量为：
2.根据权利要求1所述的血清总铁结合力检测试剂盒，其特征在于试剂R1的pH为8-10，试剂R2的pH为5-7，试剂R3的PH为8-10，试剂R4的PH为5-7；
试剂R1与试剂R2的体积比为2～6:1，试剂R3与试剂R4的体积比为2～6:1。
3.根据权利要求2所述的血清总铁结合力检测试剂盒，其特征在于试剂R1的缓冲液为氢氧化钠和甘氨酸组成的缓冲液或Tris缓冲液，试剂R2的缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，试剂R3的缓冲液为碳酸氢钠和三羟甲基氨基甲烷组成的缓冲液，或为碳酸钠和碳酸氢钠组成的缓冲液，试剂R4的缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液；
试剂R1和试剂R3的表面活性剂为曲拉通系列或吐温系列的一种或多种；
试剂R2所用的螯合剂为乙二胺四乙酸二钠或EGTA；
试剂R2和试剂R4所用的稳定剂选自聚蔗糖系列，BSA，PEG系列中的一种或多种；
试剂R3、试剂R4中的抗干扰剂选自硫脲、氨基硫脲、N,N-二甲基硫脲和异硫脲中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的血清总铁结合力检测试剂盒，其特征在于试剂R1的缓冲液组分为氢氧化钠3-4g/L，甘氨酸6-8g/L；试剂R3的缓冲液组分为碳酸氢钠12-13g/L，三羟甲基氨基甲烷或碳酸钠36-37g/L。
5.一种权利要求1所述的血清总铁结合力检测试剂盒的配制方法，其特征在于包括以下步骤：先用纯化水分别配制试剂R1、R2、R3、R4的缓冲液，再按照试剂R1、R2、R3、R4中各组分的含量添加其他物质，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH，使得试剂R1的pH为8-10，试剂R2的pH为5-7，试剂R3的PH为8-10，试剂R4的PH为5-7，得到所需总铁结合力的检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的配制方法，其特征在于试剂R1的配制包括如下步骤：
按照试剂R1的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，再按照试剂R1其他组分的含量将盐酸羟胺、表面活性剂、氯化铟依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节PH至8-10。
7.根据权利要求5所述的配制方法，其特征在于试剂R2的配制包括如下步骤：
按照试剂R2的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，再按照试剂R2其他组分的含量将3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5″-二磺酸二钠盐、螯合剂、稳定剂溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5-7。
8.根据权利要求5所述的配制方法，其特征在于试剂R3的配制包括如下步骤：
按照试剂R3的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R3缓冲液，再按照试剂R3其他组分的含量将表面活性剂、抗干扰剂、三氯化铁溶于制得的R3缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至8-10。
9.根据权利要求5所述的配制方法，其特征在于试剂R4的配制包括如下步骤：
按照试剂R4的含量将缓冲液组分溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R4缓冲液，再按照试剂R4其他组分的含量将抗坏血酸、盐酸羟胺、1-氧代-2-羟基吡啶、抗干扰剂、稳定剂、3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5″-二磺酸二钠盐溶于制得的R4缓冲液中，混合均匀后用HCL或者NaOH调节其PH至5-7。
10.一种利用权利要求1所述的血清总铁结合力检测试剂盒的血清总铁结合力检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：Fe的浓度测试
将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R1混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本；加入40μl试剂R2混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本；
步骤2：UIBC的浓度测试
进行UIBC浓度测试时，将校准品、纯化水或待测样本20μl与200μl试剂R3混合，37℃孵育5min后，在主波长600nm处读取其吸光度A1校准、A1空白或A1样本，加入40μl试剂R4混合均匀，37℃孵育5min后在主波长600nm处读取其吸光度A2校准、A2空白或A2样本；
步骤3：待测样本血清总铁结合力TIBC浓度的计算，计算公式为：TIBC＝Fe+UIBC，其中：
式中，△A校准＝A校准-A空白；△A样本＝A样本-A空白；
A校准＝A2校准-A1校准；A样本＝A2样本-A1样本；A空白＝A2空白-A1空白。
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2019
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