CN111624352B - 一种高准确性尿液中ngal检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，属于NGAL检测技术领域。该试剂盒包括试剂1和试剂2，试剂1为反应缓冲液，试剂2为NGAL抗体致敏胶乳溶液，试剂1与试剂2的混合物中含有人白蛋白和人IgG。本发明通过人白蛋白和人IgG的添加可避免尿液样本中不同浓度人白蛋白和人IgG对于NGAL检测结果的干扰，进而提高尿液中NGAL检测的准确性；此外，结合试剂2的增敏处理，可在提高准确性的同时保证检测的高灵敏度。

Description

一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒
技术领域
本发明涉及NGAL检测技术领域，更具体的说是涉及一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是急性肾损伤AKI的最理想标志物之一；丹麦Bioporto公司发现并生产了Elisa和胶乳免疫比浊法的试剂对NGAL进行检测，目前世界上绝大部分的NGAL研究均以Bioporto公司的试剂为研究基础。Bioporto公司授权雅培Abott公司使用其原料开发了化学发光法的NGAL检测试剂，并在中国NMPA获得注册证。
尿液中NGAL的测定因其无创性已成为目前NGAL测定的主要方式；目前国内存在大量的NGAL检测试剂盒以及相关专利称其可解决NGAL测定过程中灵敏度、线性范围、试剂稳定性、准确度等一系列问题，然而其均未能有效解决临床使用中最关键的问题-临床样本测定准确性，即临床样本检测结果与Bioporto一致性问题(相关性良好，绝对数值接近)。
例如，CN201711132885.0中记载，以聚乙二醇六氨为封闭剂可改善胶乳免疫比浊法检测试剂的灵敏度、特异性以及抗体结合胶乳颗粒的稳定性，能够和Bioporto Elisa试剂达到相关系数(R2)0.9334的相关性，相较于其他国内试剂取得了很大进步。然而，此相关系数仍然偏低，通常相关系数要达到0.95以上才能称为相关性良好；并且，J&W试剂和Bioporto绝对数值还有40％左右的偏差。
因此，目前临床急需成本合理，准确性高，即测定尿液NGAL临床样本时，能够和Bioporto或雅培NGAL试剂检测相关性良好，相关系数大于0.95，绝对数值接近(相对偏差15％以内)的试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1为反应缓冲液，试剂2为NGAL抗体致敏胶乳溶液，试剂1与试剂2的混合物中含有人白蛋白和人IgG。
在NGAL检测试剂中，添加人白蛋白和人IgG，可使尿液样本加入试剂反应体系后的人白蛋白和人IgG浓度位于对NGAL测定抑制程度不明显的浓度区域，进而显著改善尿液NGAL测定的准确性。
优选地，试剂1与试剂2的混合物中，人白蛋白终浓度不低于10000/x mg/L，人IgG终浓度不低于2000/x mg/L；其中x为待检测样品在试剂1与试剂2的混合物中的稀释倍数。
优选地，人白蛋白添加于试剂2中，人IgG添加于试剂1中。
优选地，试剂1中除人IgG外，还包括：试剂1缓冲液，电解质，表面活性剂，防腐剂，促凝剂和阻断剂。
优选地，试剂1中除人IgG外，还包括：pH6.8-7.5的100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38-116.88g/L，吐温-205-20mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇60005-15g/L，Scantibody HBR-26阻断剂或菲鹏生物E-015阻断剂2-2.5mL/L。
优选地，试剂2中除人白蛋白外，还包括：试剂2缓冲液，胶乳颗粒，抗体，表面活性剂，防腐剂和封闭剂。
优选地，试剂2中除人白蛋白外，还包括：pH7.6-8.2的50mM Taps-NaOH背景缓冲液，羧基胶乳3g/L，NGAL兔多克隆抗体5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，牛血清白蛋白1g/L；NGAL兔多克隆抗体选用Dako公司货号为OA995、浓度为5mg/mL的NGAL兔多克隆抗体。
优选地，试剂2的制备包括如下步骤：
(1)将抗体与胶乳颗粒共价偶联，先不进行封闭，获得胶乳溶液；
(2)向胶乳溶液中加入尿素，使胶乳溶液中尿素中浓度为10-20mM/L，37℃下120rpm恒温孵育1h，获得胶乳试剂；
(3)将步骤(2)获得的胶乳试剂中50％背景溶液弃去，换为支架溶液；
支架溶液为中部酸性、两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架溶解于支架溶解液中制得；
氨基酸支架结构如式I所示，式中K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X为3-4个自由组合的酸性氨基酸；
Figure BDA0002524934020000021
氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架；
(4)向步骤(3)获得的混合有氨基酸支架的胶乳试剂中滴加50mmol/L的过硫酸钾溶液，于37℃下120rpm恒温孵育30min；
过硫酸钾的摩尔量为步骤(2)中尿素用量的35-50％；
(5)对步骤(4)孵育后的胶乳试剂离心，弃去所有上清，加入封闭清洗液进行封闭清洗，制得试剂2。
事物总是具有两面性，本发明添加人白蛋白和人IgG虽然能够有效解决尿液NGAL测定准确性问题，但也明显的缺陷，样本中高浓度的人白蛋白和人IgG会造成测定结果偏低，本质上是其抑制尿液NGAL测定灵敏度的所致；将人白蛋白和人IgG添加到试剂中，会造成试剂整体灵敏度损失超过40％。因此，还需要在此基础上对试剂进行增敏处理，以弥补试剂中添加人白蛋白和人IgG带来的灵敏度损失。
在实际使用时，可使用上述增敏方法制备试剂2，也可采用其他利于提升试剂灵敏度的方法配合本发明使用，以获得较为理想的尿液NGAL检测试剂盒。
优选地，支架溶解液为100mM/L pH7.5，含0.1％v/v吐温-20的PBS缓冲液；
过硫酸钾溶液为使用支架溶解液对过硫酸钾溶解获得；
封闭清洗液成分包括：pH7.6-8.2的50mM Taps-NaOH背景缓冲液，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，牛血清白蛋白1g/L；并且添加有人白蛋白。
优选地，步骤(5)中，对步骤(4)孵育后的胶乳试剂离心，弃去所有上清，加入封闭清洗液复溶，使胶乳终浓度为1-4g/L，室温混匀2小时，制得试剂2。
进一步优选地，每mg抗体对应0.015mg氨基酸支架。
进一步优选地，酸性氨基酸为天冬氨酸D和/或谷氨酸E。
进一步优选地，X为DDD，EEE，DED，EDE，EDD，DDE，EED，DEE，DDDD，EDDD，DEDD，DDED，DDDE，EEDD，EEED，EEEE，DDEE，DEDE，DEEE，EDEE，EEDE，EDED，DEED或EDDE。
进一步优选地，步骤(3)换液方法为离心、透析、层析柱或超滤换液。
由上述技术方案可知，本发明通过在NGAL检测试剂中添加人白蛋白和人IgG，可避免尿液样本中不同浓度人白蛋白和人IgG对于NGAL检测结果的干扰，进而提高尿液中NGAL检测的准确性；此外，结合试剂2的增敏处理，可在提高准确性的同时保证检测的高灵敏度。
附图说明
图1所示为J&W和Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图2所示为人白蛋白浓度与尿液NGAL测定偏低程度梯度试验结果。
图3所示为人IgG浓度与尿液NGAL测定偏低程度梯度试验结果。
图4所示为实施例2对照组与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图5所示为实施例2实验组1与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图6所示为实施例2实验组2与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图7所示为实施例3对照组2与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图8所示为实施例3实验组3与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图9所示为实施例3实验组4与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图10所示为实施例4对照组3与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图11所示为实施例4实验组5与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
图12所示为实施例4实验组6与Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.现有试剂盒准确性分析
分别使用CN201711132885.0中记载的J&W和Bioporto胶乳比浊试剂对26个尿液临床样本进行检测，结果如表1及图1所示，相关系数R2为0.937，与CN201711132885.0中记载结果接近。
然而，对于NGAL在200ng/mL以上的部分样本而言，J&W试剂与胶乳比浊法的Bioporto试剂相比会出现较多偏低的情况(偏低超过15％)，且浓度越高偏低越多，1000ng/mL以上样本偏低更为严重(偏低超过25％)；其他国内厂家试剂偏差甚至超过40％；因此，检测准确性问题严重限制了国内试剂的临床应用。
表1
Figure BDA0002524934020000051
2.尿液NGAL检测准确性影响因素分析
根据临床心脏手术中AKI发生的尿液NGAL浓度判定，200ng/mL以上的NGAL，已经属于肾小球急性损伤阶段，1000ng/mL以上属于严重损伤，因此初步怀疑，包括J&W试剂在内的国内试剂，在测定尿液NGAL时，会受到某些和肾损伤相关的物质的干扰，这些物质在正常人和轻症患者尿液中含量较低，对国内试剂测定影响较小，而在严重的肾损伤时，这些物质含量高，会造成国内试剂测定偏低。
进一步地，分析肾损伤病人尿液和正常人尿液成分差异，发现尿蛋白，特别是其中含量最高的人白蛋白、人IgG的含量差异非常显著：
正常人尿液中人白蛋白浓度通常小于20mg/L，人IgG浓度小于8mg/L，轻症中该浓度也只会升高2-15倍左右；但严重的肾损伤患者，尿液中人白蛋白可以高达5000-30000mg/L，人IgG浓度可以高达1000-10000mg/L；因此，有理由怀疑高浓度的人白蛋白和人IgG可能会对尿液NGAL测定有影响。
进一步地，进行NGAL样本回收添加试验：
取正常人尿液(NGAL<50ng/mL，尿白蛋白<20mg/L，尿IgG<8mg/L)，使用NGAL纯品添加其中，调整浓度至1000ng/mL，然后分为一式五份，分别命名为对照组，人白蛋白组A，人白蛋白组B，人IgG组C，人IgG组D。
分别使用人血白蛋白注射液(品牌：Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)和人免疫球蛋白注射液(品牌：新兴医药，主要成分为人IgG，浓度50g/L)模拟严重肾损伤尿液样本：两人白蛋白组通过添加人血白蛋白注射液至人白蛋白终浓度5000mg/L(A)和10000mg/L(B)；两人IgG组通过添加人免疫球蛋白注射液至人IgG终浓度1000mg/L(C)和2000mg/L(D)；对照组加入等体积安慰剂纯水模拟实验组的稀释效应。
使用自制NGAL试剂对五组样本进行测定，自制NGAL试剂如下：
试剂1：pH6.8 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38g/L，吐温-20 5mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 5g/L，Scantibody HBR-26阻断剂2.5mL/L。
试剂2：50mM pH7.6 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L。
试剂2采用常规化学偶联法偶联(10mL试剂2为例)：
(1)胶乳清洗：取100g/L浓度(即10％质量/体积浓度)的270nm羧基胶乳300μL(0.03g)，加入到10mL100mM的pH5.0 MES-NaOH缓冲液中稀释，进行22000rpm离心5分钟，去上清，加入10mL 100mM的pH5.0 MES-NaOH缓冲液复溶；
(2)胶乳活化：预先使用100mM的pH5.0 MES-NaOH缓冲液1mL溶解2mg EDC-HCL，并取100μL加入步骤(1)已清洗的胶乳中，混匀30min后22000rpm离心5min去上清，加入Taps-NaOH背景缓冲液10mL复溶；
(3)抗体偶联：向经步骤(2)获得的已活化胶乳溶液中加入50μL NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)，室温混匀2小时后22000rpm 5min离心去上清，加入Taps-NaOH背景缓冲液10mL复溶；
(4)试剂封闭：不进行增敏操作的试剂2，可直接加入吐温-20 60μL(终浓度6mL/L)，procLin-300防腐剂3.5μL(终浓度0.35mL/L)；Bovstar IgG free级牛血清白蛋白10mg(终浓度1g/L)，室温混匀30min即得成品试剂2；增敏操作的按后续实施例详细步骤进行。
使用5μL样本，150μL试剂1，50μL试剂2，660nm波长，18-34读点的参数，在日立7180全自动生化分析仪上检测，各组测定结果如下：
对照组976ng/mL(属于测定误差和安慰剂稀释范围内)，
人白蛋白组A：692ng/mL，
人白蛋白组B：653ng/mL，
人IgG组C：823ng/mL，
人IgG组D：780ng/mL；
由上可知，人白蛋白组和人IgG组明显偏低，且偏低程度与人白蛋白及人IgG浓度呈正相关。
上述实验结果证实了最初假设，尿液中人白蛋白和人IgG浓度高低，会对尿液NGAL测定构成影响。
进一步的，调整样品中人白蛋白以及人IgG浓度，继续使用自制NGAL试剂对人白蛋白以及人IgG浓度与尿液NGAL测定偏低程度进行梯度试验，将人白蛋白或人IgG浓度作为x轴，实际测定结果/对照组结果的比值作为Y轴，结果如表2-3及图2-3所示。
表2
人白蛋白浓度mg/L 偏差比率
20 100％
500 93.44％
1000 81.25％
5000 70.90％
10000 66.91％
20000 66.50％
30000 65.98％
40000 65.57％
表3
人IgG浓度mg/L 偏差比率
8 100％
100 97.85％
200 94.57％
500 90.47％
1000 84.32％
2000 79.92％
3000 78.89％
4000 78.38％
由上述结果可知，当尿液中人白蛋白或人IgG浓度达到一定浓度后(人白蛋白约10000mg/L，人IgG约2000mg/L)，其对尿液NGAL测定结果的抑制程度几乎不变。
由此推断，在NGAL检测试剂中，添加一定比例的人白蛋白和人IgG，使得尿液样本加入试剂反应体系后的人白蛋白和人IgG浓度位于对NGAL测定抑制程度不明显的浓度区域，能够显著改善尿液NGAL测定的准确性。
例如：常规的尿液NGAL测定参数为5μL样本，150μL试剂1(反应缓冲液)，50μL试剂2(NGAL抗体致敏胶乳溶液)；即5μL样本加入到200μL试剂中参与抗原抗体反应，当样本中白蛋白浓度位于≥10000mg/L时，加入样本后的试剂样本混合物中人白蛋白终浓度≥250mg/L；即试剂中白蛋白终浓度≥250mg/L时，测定尿液NGAL受到白蛋白的影响将非常微小。同理，当样本中IgG浓度≥2000mg/L，即加入样本后的试剂样本混合物中IgG浓度≥50mg/L时，测定尿液NGAL受到IgG的影响将非常微小。
故本发明提供一种高准确性的尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载带白(NGAL)检测试剂盒，采用胶乳免疫比浊法，在试剂1(反应缓冲液)与试剂2(NGAL抗体致敏胶乳溶液)混合物中添加人白蛋白和人IgG，以提高检测准确性。
进一步地，试剂1与试剂2的混合物中，人白蛋白终浓度不低于10000/x mg/L，人IgG终浓度不低于2000/x mg/L；其中x为待检测样品在试剂1与试剂2的混合物中的稀释倍数。
例如，对于5μL样本、150μL试剂1、50μL试剂2的混合体系中，可将人白蛋白终浓度设置为250mg/L，同时IgG终浓度设置为50mg/L。
考虑到添加更多的人白蛋白和人IgG并不能获得更好的效果，还会增加试剂成本，此处仅限定成本最低廉的添加量。
例如，检测时使用样本3μL，试剂1160μL，试剂280μL时，根据本发明样本中人白蛋白≥10000mg/L，人IgG≥2000mg/L对尿NGAL测定抑制率变化较小的基本原理，调整试剂1中人IgG浓度为37.5mg/L(试剂1+试剂2混合物中人IgG浓度为25mg/L)，试剂2中人白蛋白浓度为375mg/L(试剂1+试剂2混合物中人白蛋白浓度为125mg/L)；其他参数可以根据本发明基本原理酌情调整。
3.人白蛋白与人IgG添加验证试验
考虑到白蛋白有利于试剂2的稳定性，因此，将人白蛋白添加到试剂2中。
添加人IgG所使用的免疫球蛋白注射液(可能含有微量异嗜性抗体HA)会和试剂2中的NGAL抗体发生微弱交叉反应，造成试剂2不稳定，具体实验如下：
取“2.尿液NGAL检测准确性影响因素分析”中自制NGAL试剂的试剂2三组各10mL：
组1加入人免疫球蛋白注射液40μL(使得试剂2中IgG浓度为200mg/L，即人IgG全部添加于试剂2的方案)；
组2加入10μL人免疫球蛋白注射液，30μL安慰剂纯水(使得试剂2中人IgG浓度为50mg/L，即人IgG平均分配于试剂1和试剂2的方案)；
组3为对照组，仅加入安慰剂40μL纯化水，以平衡三组试验体积稀释误差；
三组试剂2分别进行37℃7天加速：
组1，37℃1天试剂空白(Reagent Blank)升高超过50％，提示试剂开始凝聚，7天时，试剂2已经凝聚沉底；
组2，37℃4天时出现试剂空白升高超过50％，7天时已经出现分层凝聚，沉淀情况不如组1严重；
组3，37℃加速7天未出现任何异常；即证明人IgG中有能够和试剂2交叉反应的物质，推测可能为HA。
因此，将人IgG添加于于试剂1中。
进一步地，验证牛血清白蛋白BSA和人白蛋白的添加对于尿液NGAL测定影响的差异性：
按前述人白蛋白添加试验方案，取正常人尿样调NGAL浓度至1000ng/mL，加入BSA，由于其溶解度相对人白蛋白有差异，因此只能配制到20000mg/L浓度；其次，由于自制NGAL试剂的试剂2中本身含有1000mg/L浓度的BSA，相当于样本中添加试验白蛋白10000mg/L起步；结果如表4所示，样品中添加的BSA浓度对尿液NGAL测定几乎无影响。
表4
BSA浓度mg/L 偏差比率
5000 99.18％
10000 99.18％
20000 98.87％
实施例2
对照组1：
试剂1：pH6.8 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38g/L，吐温-20 5mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 5g/L，Scantibody HBR-26阻断剂2.5mL/L。
试剂2：50mM pH7.6 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L。
试剂2采用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联，未进行增敏处理。
实验组1(添加人IgG和人白蛋白)：
试剂1：pH6.8 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38g/L，吐温-20 5mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 5g/L，Scantibody HBR-26阻断剂2.5mL/L，人IgG 66.7mg/L(人免疫球蛋白注射液，品牌：新兴医药，主要成分为人IgG，浓度50g/L)。
试剂2：50mM pH7.6 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)。
试剂2采用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联，未进行增敏处理。
实验组2(添加人IgG和人白蛋白，试剂2进行增敏处理)：
试剂1：pH6.8 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38g/L，吐温-20 5mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 5g/L，Scantibody HBR-26阻断剂2.5mL/L，人IgG 66.7mg/L(人免疫球蛋白注射液，品牌：新兴医药，主要成分为人IgG，浓度50g/L)。
试剂2：50mM pH7.6 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)。制作步骤如下：
(1)使用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联0.05mL Dako兔抗人NGAL多克隆抗体(5mg/mL)和0.03g Polymicroshperes 270nm羧基胶乳，完成抗体偶联步骤后，获得10mL胶乳溶液；
(2)配制支架溶解液：100mM/L pH7.5，含0.1％v/v吐温-20的PBS缓冲液，室温备用。
配制50mM/L过硫酸钾溶液：使用支架稀释液200mL溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。
配制封闭清洗液：50mM/L pH7.6 Taps-NaOH背景缓冲液，添加吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)，室温备用。
(3)封闭前，向胶乳溶液中加入尿素至终浓度10mM/L，37℃恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育1小时，获得胶乳试剂。
(4)胶乳试剂22000rmp离心5min，去除5mL上清，即换液50％；
取0.1mg中部酸性、两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架，室温溶解于200mL支架溶解液中，制得支架溶液；氨基酸支架结构如式Ⅰ所示，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X序列为EDED(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；
Figure BDA0002524934020000111
取5mL支架溶液加入“换液50％”的胶乳试剂中，即每mg兔多克隆抗体对应0.010mg氨基酸支架。
(5)取步骤(2)中准备的50mM/L过硫酸钾溶液，1mL，加入到步骤(4)混合有氨基酸支架的胶乳试剂中，使得过硫酸钾摩尔量约为步骤(3)中尿素量的50％；37℃恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min。
(6)将步骤(5)中孵育完成支架反应的胶乳溶液于22000rmp离心5min，去所有上清，加入10mL封闭清洗液，复溶，室温混匀2小时制备成试剂2。
上机测试：三组试验均使用5μL样本，150μL试剂1，50μL试剂2，660nm波长，18-34读点的参数；使用相同NGAL定标品，分别利用各组的试剂1配套试剂2，在日立7180全自动生化分析仪上面定标，定标结果如表5所示。使用三组试剂测试50ng/mL的样本各10次，计算精密度CV，比较结果如表6所示；利用各组试剂测试尿液临床样本，与Bioporto胶乳比浊法NGAL试剂平行比对，结果如表7及图4-6所示。
表5
ng/mL 对照组1 实验组1 实验组2
0 35 34 44
50 252 152 331
250 1573 946 1716
500 2632 1585 2982
1200 4835 2933 5265
3000 8215 4937 8933
表6
Figure BDA0002524934020000112
Figure BDA0002524934020000121
表7
Figure BDA0002524934020000122
Figure BDA0002524934020000131
由上述结果可知，对照组与Bioporto试剂尿液临床样本测定结果差异明显，大量样本偏差超过15％，相关性系数仅0.948；采用实验组1和2试剂，与Bioporto偏差均小于15％，且相关性系数>0.99，相关性好，说明本发明试剂盒能够有效解决尿液临床样本测定准确性问题。然而根据定标数据以及精密度数据可知，实验组1试剂会带来灵敏度损失，相较于对照组，实验组1灵敏度下降约40％，测定50ng/mL临界值精密度远高于对照组和实验组2，说明添加人IgG和人白蛋白虽然解决了尿液临床准确性问题，但并非最优方案。实验组2对试剂2进行增敏处理，灵敏度明显提升，测定50ng/mL临界值精密度CV仅1.94％，作为临床用尿液NGAL检测试剂盒效果更佳。
实施例3
对照组2：
试剂1：pH7.5 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液；氯化钠116.88/L，吐温-20 20mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 15g/L，Scantibody HBR-26阻断剂2.5mL/L。
试剂2：50mM pH8.2 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L。
试剂2采用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联，未进行增敏处理。
实验组3(添加人IgG和人白蛋白)：
试剂1：pH7.5 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液；氯化钠116.88/L，吐温-20 20mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇600015g/L，Scantibody HBR-26阻断剂2.5mL/L，人IgG 66.7mg/L(人免疫球蛋白注射液，品牌：新兴医药，主要成分为人IgG，浓度50g/L)。
试剂2：50mM pH8.2 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)。
试剂2采用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联，未进行增敏处理。
实验组4(添加人IgG和人白蛋白，试剂2进行增敏处理)：
试剂1：pH7.5 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液；氯化钠116.88/L，吐温-20 20mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 15g/L，Scantibody HBR-26阻断剂2.5mL/L，人IgG 66.7mg/L(人免疫球蛋白注射液，品牌：新兴医药，主要成分为人IgG，浓度50g/L)。
试剂2：50mM pH8.2 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)。
制作步骤如下：
(1)使用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联0.05mL Dako兔抗人NGAL多克隆抗体(5mg/mL)和0.03g Polymicroshperes 270nm羧基胶乳，完成抗体偶联步骤后获得10mL胶乳溶液；
(2)配制支架溶解液：100mM/L pH7.5，含0.1％v/v吐温-20的PBS缓冲液，室温备用。
配制50mM/L过硫酸钾溶液：使用支架稀释液200mL溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。
配制封闭清洗液：50mM/L pH8.2 Taps-NaOH背景缓冲液，添加吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)，室温备用。
(3)封闭前，向胶乳溶液中加入尿素至终浓度10mM/L，37℃恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育1小时，获得胶乳试剂。
(4)胶乳试剂22000rmp离心5min，去除5mL上清，即换液50％；
取0.1mg中部酸性、两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架，室温溶解于200mL支架溶解液中，制得支架溶液；氨基酸支架结构如式Ⅰ所示，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X序列为EDED(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；
Figure BDA0002524934020000141
       
Figure BDA0002524934020000151
取5mL支架溶液加入“换液50％”的胶乳试剂中，即每mg兔多克隆抗体对应0.010mg氨基酸支架。
(5)取步骤(2)中准备的50mM/L过硫酸钾溶液，1mL，加入到步骤(4)混合有氨基酸支架的胶乳试剂中，使得过硫酸钾摩尔量约为步骤(3)中尿素量的50％；37℃恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min。
(6)将步骤(5)中孵育完成支架反应的胶乳溶液于22000rmp离心5min，去所有上清，加入10mL封闭清洗液，复溶，室温混匀2小时制备成试剂2。
上机测试：三组试验均使用5μL样本，150μL试剂1，50μL试剂2，660nm波长，18-34读点的参数；使用相同NGAL定标品，分别利用各组的试剂1配套试剂2，在日立7180全自动生化分析仪上面定标，定标结果如表8所示。使用三组试剂测试50ng/mL的样本各10次，计算精密度CV，比较结果如表9所示；利用各组试剂测试尿液临床样本，与Bioporto胶乳比浊法NGAL试剂平行比对，结果如表10及图7-9所示。
表8
ng/mL 对照组2 实验组3 实验组4
0 28 29 31
50 225 132 301
250 1412 856 1602
500 2337 1379 2753
1200 4375 2710 4822
3000 7535 4453 8217
表9
Figure BDA0002524934020000152
Figure BDA0002524934020000161
表10
Figure BDA0002524934020000162
Figure BDA0002524934020000171
本实施例中试剂1相对于实施例2提高了盐离子浓度和pH值，虽然大幅度增加了增敏剂吐温-20和聚乙二醇6000用量，但未能弥补灵敏度损失，相比实施例2整体灵敏度低。对照组2与Bioporto试剂尿液临床样本测定结果差异明显，大量样本偏差超过15％，相关性系数仅0.955，由于高盐离子和高pH作用，略优于对照组1；实验组3、4试剂与Bioporto偏差均小于15％，且相关性系数>0.99，相关性好；但相较于对照组2，实验组3灵敏度下降，测定50ng/mL临界值精密度远高于对照组2和实验组4。实验组4对试剂2进行增敏处理，灵敏度明显提升，测定50ng/mL临界值精密度CV仅2.33％，作为临床用尿液NGAL检测试剂盒效果较好。
实施例4
对照组3：
试剂1：pH7.1 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠58.44g/L；吐温-20 12mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 10g/L，菲鹏生物E-015阻断剂2mL/L。
试剂2：50mM pH7.9 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L。
试剂2采用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联，未进行增敏处理。
实验组5(添加人IgG和人白蛋白)：
试剂1：pH7.1 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠58.44g/L；吐温-20 12mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 10g/L，菲鹏生物E-015阻断剂2mL/L，人IgG66.7mg/L(人免疫球蛋白注射液，品牌：新兴医药，主要成分为人IgG，浓度50g/L)。
试剂2：50mM pH7.9 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)。
试剂2采用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联，未进行增敏处理。
实验组6(添加人IgG和人白蛋白，试剂2进行增敏处理)：
试剂1：pH7.1 100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠58.44g/L；吐温-20 12mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇6000 10g/L，菲鹏生物E-015阻断剂2mL/L，人IgG66.7mg/L(人免疫球蛋白注射液，品牌：新兴医药，主要成分为人IgG，浓度50g/L)。
试剂2：50mM pH7.9 Taps-NaOH背景缓冲液，Polymicroshperes 270nm羧基胶乳3g/L，Dako公司NGAL兔多克隆抗体(货号OA995，浓度5mg/mL)5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)。制作步骤如下：
(1)使用同实施例1所述的常规化学偶联法偶联0.05mL Dako兔抗人NGAL多克隆抗体(5mg/mL)和0.03g Polymicroshperes 270nm羧基胶乳，完成抗体偶联步骤后获得10mL胶乳溶液；
(2)配制支架溶解液：100mM/L pH7.5，含0.1％v/v吐温-20的PBS缓冲液，室温备用。
配制50mM/L过硫酸钾溶液：使用支架稀释液200mL溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。
配制封闭清洗液：50mM/L pH7.9 Taps-NaOH背景缓冲液，添加吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，Bovstar IgG free级牛血清白蛋白1g/L，人白蛋白1000mg/L(人血白蛋白注射液，品牌Grifols，主要成分人白蛋白，浓度200g/L)，室温备用。
(3)封闭前，向胶乳溶液中加入尿素至终浓度10mM/L，37℃恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育1小时，获得胶乳试剂。
(4)胶乳试剂22000rmp离心5min，去除5mL上清，即换液50％；
取0.1mg中部酸性、两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架，室温溶解于200mL支架溶解液中，制得支架溶液；氨基酸支架结构如式Ⅰ所示，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X序列为EDED(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；
Figure BDA0002524934020000181
取5mL支架溶液加入“换液50％”的胶乳试剂中，即每mg兔多克隆抗体对应0.010mg氨基酸支架。
(5)取步骤(2)中准备的50mM/L过硫酸钾溶液，1mL，加入到步骤(4)混合有氨基酸支架的胶乳试剂中，使得过硫酸钾摩尔量约为步骤(3)中尿素量的50％；37℃恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min。
(6)将步骤(5)中孵育完成支架反应的胶乳溶液于22000rmp离心5min，去所有上清，加入10mL封闭清洗液，复溶，室温混匀2小时制备成试剂2。
上机测试：三组试验均使用5μL样本，150μL试剂1，50μL试剂2，660nm波长，18-34读点的参数；使用相同NGAL定标品，分别利用各组的试剂1配套试剂2，在日立7180全自动生化分析仪上面定标，定标结果如表11所示。使用三组试剂测试50ng/mL的样本各10次，计算精密度CV，比较结果如表12所示；利用各组试剂测试尿液临床样本，与Bioporto胶乳比浊法NGAL试剂平行比对，结果如表13及图10-12所示。
表11
ng/mL 对照组3 实验组5 实验组6
0 31 30 28
50 241 139 317
250 1483 899 1654
500 2474 1493 2835
1200 4617 2834 5012
3000 7882 4732 8675
表12
Figure BDA0002524934020000191
表13
Figure BDA0002524934020000201
由上述结果可知，对照组3与Bioporto试剂尿液临床样本测定结果差异明显，大量样本偏差超过15％，相关性系数仅0.953；实验组5、6试剂与Bioporto偏差均小于15％，且相关性系数>0.99，相关性好。相较于对照组3，实验组5灵敏度下降，测定50ng/mL临界值精密度远高于对照组3和实验组6，可见添加人IgG和人白蛋白虽然解决了尿液临床准确性问题，但并非最优方案。实验组6对试剂2进行增敏处理，灵敏度明显提升，测定50ng/mL临界值精密度CV仅2.15％，作为临床用尿液NGAL检测试剂盒效果较好。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1为反应缓冲液，所述试剂2为NGAL抗体致敏胶乳溶液，其特征在于，所述试剂1与所述试剂2的混合物中含有人白蛋白和人IgG；
所述试剂1与所述试剂2的混合物中，人白蛋白终浓度不低于10000/x mg/L，人IgG终浓度不低于2000/x mg/L；其中x为待检测样品在所述试剂1与所述试剂2的混合物中的稀释倍数。
2.根据权利要求1所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述人白蛋白添加于所述试剂2中，所述人IgG添加于所述试剂1中。
3.根据权利要求2所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1中除人IgG外，还包括：试剂1缓冲液，电解质，表面活性剂，防腐剂，促凝剂和阻断剂。
4.根据权利要求3所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1中除人IgG外，还包括：pH6.8-7.5的100mM Hepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38-116.88g/L，吐温-205-20mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇60005-15g/L，Scantibody HBR-26阻断剂或菲鹏生物E-015阻断剂2-2.5mL/L。
5.根据权利要求2所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2中除人白蛋白外，还包括：试剂2缓冲液，胶乳颗粒，抗体，表面活性剂，防腐剂和封闭剂。
6.根据权利要求5所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2中除人白蛋白外，还包括：pH7.6-8.2的50mM Taps-NaOH背景缓冲液，羧基胶乳3g/L，NGAL兔多克隆抗体5mL/L，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，牛血清白蛋白1g/L；所述NGAL兔多克隆抗体选用Dako公司货号为OA995、浓度为5mg/mL的NGAL兔多克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2的制备包括如下步骤：
(1)将抗体与胶乳颗粒共价偶联，先不进行封闭，获得胶乳溶液；
(2)向所述胶乳溶液中加入尿素，使胶乳溶液中尿素终浓度为10-20mM/L，37℃下120rpm恒温孵育1h，获得胶乳试剂；
(3)将步骤(2)获得的胶乳试剂中50％背景溶液弃去，换为支架溶液；
所述支架溶液为中部酸性、两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架溶解于支架溶解液中制得；
所述氨基酸支架结构如式I所示，式中K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X为3-4个自由组合的酸性氨基酸；
Figure FDA0004054928650000021
所述氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架；
(4)向步骤(3)获得的混合有氨基酸支架的胶乳试剂中滴加50mmol/L的过硫酸钾溶液，于37℃下120rpm恒温孵育30min；所述过硫酸钾的摩尔量为步骤(2)中尿素用量的35-50％；
(5)对步骤(4)孵育后的胶乳试剂离心，弃去所有上清，加入封闭清洗液进行封闭清洗，制得试剂2。
8.根据权利要求7所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述支架溶解液为100mM/L pH7.5，含0.1％v/v吐温-20的PBS缓冲液；所述过硫酸钾溶液为使用所述支架溶解液对过硫酸钾溶解获得；所述封闭清洗液成分包括：pH7.6-8.2的50mM Taps-NaOH背景缓冲液，吐温-20 6mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，牛血清白蛋白1g/L；并且添加有人白蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述步骤(5)中，对步骤(4)孵育后的胶乳试剂离心，弃去所有上清，加入封闭清洗液复溶，使胶乳终浓度为1-4g/L，室温混匀2小时，制得试剂2。
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