CN113687075B - 一种铜蓝蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种铜蓝蛋白检测试剂盒。该试剂盒由R1试剂和R2试剂组成；所述试剂R1由pH7.0～8.0的5～30mMPB缓冲液、9g/L‑30g/L的无机盐、40‑80g/L促凝剂、0.5～2g/L表面活性剂和0.1‑1g/L的防腐剂组成；所述R2试剂由pH7.0～8.0的5‑100mM缓冲液、9‑30g/L的无机盐、100～500g/L铜蓝蛋白多抗血清、0‑5g/L保护剂、60～80g/L稳定剂和0.1‑1g/L防腐剂组成；所述R2中稳定剂为蔗糖、海藻糖、甘油、葡萄糖的一种或几种。实验表明，本发明所述试剂盒稳定性好、批间差异小、灵敏度高，有利于临床上广泛推广和使用。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种铜蓝蛋白检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CER)又称血蓝蛋白、铜氧化酶，是一种含铜具有氧化酶的α2-球蛋白,相对分子质量为151×103,每个分子含6-7个铜原子,含铜量为0.34％,血清中约95％的铜与α2-球蛋白结合成铜蓝蛋白,起调节铁吸收和运输作用,具有亚铁氧化酶及胺氯化酶活性。它的主要生理作用有转运铜、氧化铁,促进细胞生长和血管生成等作用,而铜是属于人体必需的微量元素之一,具有重要的生物学功能,并与甲状腺素有相互调节作用。它能促进组织胺、血清素等的分解,可以构成机体非特异性抗病能力。一般认为，铜蓝蛋白由肝脏合成，一部分由胆道排泄，尿中含量甚微。铜蓝蛋白的测定对某些肝、胆、肾等疾病的诊断有一定意义。
目前，检测铜蓝蛋白的常用方法是普通免疫比浊法，普通免疫比浊法不仅能满足临床对试剂灵敏度的需求，而且试剂制备操作简单，结果检测准确、快速。但是普通免疫比浊法所用关键原料即多抗血清往往因为一些不可控因素导致不同批次的多抗血清存在差异，从而影响试剂性能。且铜蓝蛋白多抗血清不能在缓冲液中保持长期稳定(18个月)。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种铜蓝蛋白检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒批间差异小、灵敏度高、稳定性好，可用于广泛用于临床应用。
本发明提供一种铜蓝蛋白的检测试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成；
所述试剂R1由pH7.0～8.0的5～30mM PB缓冲液、9g/L-30g/L的无机盐、40-80g/L促凝剂、0.5～2g/L表面活性剂和0.1-1g/L的防腐剂组成；
所述R2试剂由pH7.0～8.0的5-100mM缓冲液、9-30g/L的无机盐、100～500g/L铜蓝蛋白多抗血清、0-5g/L保护剂、60～80g/L稳定剂和0.1-1g/L防腐剂组成；
所述R2中稳定剂为蔗糖、海藻糖、甘油、葡萄糖的一种或几种。
本发明试剂盒基于免疫比浊法测定铜蓝蛋白，检测原理为：
试剂R2和样本中铜蓝蛋白相结合发生凝集反应后，形成抗原抗体免疫复合物，并产生浊度，该浊度的高低与样本中铜蓝蛋白浓度成相关，测定此时的吸光度值，根据校准曲线计算出铜蓝蛋白的含量。
具体地，本发明试剂盒的使用方法包括：
先将试剂R1与待测CER血清样本混匀5分钟，然后加入试剂R2开始反应，其中，按体积比计，试剂R1:试剂R2:样本＝250:50:2；5分钟时比照空白测定初始吸光度A1，然后在10分钟时比照空白测定吸光度A2，计算A2与A1的差值ΔA，根据标准曲线获得待测CER血清样本中CER含量。
一些实施方案中，所述R1试剂和R2试剂中的防腐剂为ProClin 300。
一些实施方案中，所述R1试剂和R2试剂中的无机盐为NaCl和/或KCl。
一些实施方案中，所述R1试剂中：
促凝剂为聚乙二醇6000和/或葡聚糖；
表面活性剂为吐温20和/或吐温80。
本发明中，R1试剂的缓冲液能有效解决试剂批间差问题。一些具体实施例中，R1试剂的缓冲液优选为pH7.4的10mM PB缓冲液。
一些实施方案中，所述R2试剂中，
缓冲液为醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS或Hepes缓冲液中的一种或几种；
无机盐为NaCl和/或KCl；
保护剂为BSA、casein、干酪素的一种或几种。
一些实施方案中，所述铜蓝蛋白多抗血清为羊抗人、兔抗人、马抗人、鼠抗人或其他动物抗人的多抗血清。铜蓝蛋白多抗血清在使用前应进行离心处理，并过滤，从而降低试剂的批间差异，提高了试剂稳定性。
本发明中，无机盐和稳定剂按照特定的配比与其他组分配合，显著改善了试剂的稳定性和批间差异。
具体地，本发明试剂盒由R1试剂和R2试剂组成；
所述试剂R1由pH7.0～8.0的5～30mM PB缓冲液、9g/L-30g/L的氯化钠、40-80g/L聚乙二醇、0.5～2g/L吐温20和0.1-1g/L的ProClin 300组成；
所述R2试剂由pH7.0～8.0的5-100mM TRIS缓冲液或MOPS缓冲液、9-30g/L的氯化钠、100～500g/L铜蓝蛋白多抗血清、0-5g/LBSA、60～80g/L蔗糖和0.1-1g/L ProClin 300组成。
一些具体实施例中，所述试剂盒由R1试剂和R2试剂组成；
所述试剂R1由pH7.4的5～30mM PB缓冲液、9g/L-20g/L的氯化钠、60-70g/L聚乙二醇、0.5-1.5g/L吐温20和0.5-1g/L的ProClin 300组成；
所述R2试剂由pH7.4的10-100mM TRIS缓冲液或MOPS缓冲液、9g/L的氯化钠、150g/L铜蓝蛋白多抗血清、0-5g/L BSA、60～80g/L蔗糖和0.1-1g/LProClin 300组成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用本方法制备的试剂盒检测灵敏度和准确度均能满足临床需求。
(2)本发明提供的配方能消除所用多抗血清不同批次对试剂盒性能造成批间差异。
(3)本发明试剂盒稳定性优。本发明采用免疫比浊法，通过优化反应体系，试剂R2采用多种稳定剂，找到较优配比以提高试剂稳定性；铜蓝蛋白多抗血清采用较优处理方式，明显改善了试剂的稳定性和批间差异。
(4)采用本方法制备的试剂盒可用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，可大规模的开展和推广。
本发明采用创新之处如下：
1)本发明使用10mM PB pH7.0-8.0作为R1缓冲液有效地消除了试剂批间差异。
2)本发明试剂盒R2试剂中加入最优配比的稳定剂且铜蓝蛋白多抗血清采用较优处理方式使其稳定性加强，保存期延长。
附图说明
图1示CER的浓度与测得的ΔA值的对应的散点图；
图2示本发明实施例1的试剂盒与对照CER试剂盒(普通免疫比浊)的相关性分析结果；
图3示本发明实施例2的试剂盒与对照CER试剂盒(普通免疫比浊)的相关性分析结果；
图4示本发明实施例3的试剂盒与对照CER试剂盒(普通免疫比浊)的相关性分析结果；
图5示对照CER试剂盒不同批次的相关性分析结果；
图6示实施例1和实施例2试剂盒的相关性分析结果；
图7示实施例1和实施例3试剂盒的相关性分析结果；
图8示实施例2和实施例3试剂盒的相关性分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种铜蓝蛋白检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明试剂盒的制备
本发明试剂盒基于普通免疫比浊法测定CER，由试剂R1和试剂R2组成，其中，试剂R1中缓冲液为pH7.4的10mM PB缓冲液。试剂R2为蔗糖。但试剂R2的组分采用了3个不同批次的铜蓝蛋白多抗血清(Origene，lot#F00702-01；C14503R-01；C14503-01)，标记为批次1、批次2、批次3。
表1试剂R1的组分
试剂R1的配制步骤为(配制1L)：分别按照表1中实施例1～3的组分浓度，按照上述试剂R1的组分含量，使用纯化水配制PB缓冲液，调节pH，作为R1缓冲液；然后加入对应量的氯化钠、吐温20、聚乙二醇6000和ProClin300，混匀并用氢氧化钠/盐酸调节pH得到试剂R1。
试剂R2的组分如表2所示。
表2试剂R2的组分
试剂R2的配制步骤为(配制1L)：按照上述试剂R2的组分含量，使用纯化水配制缓冲液，调节pH，作为R2保存液；按照上述试剂R2的组分含量，将处理过的铜蓝蛋白多抗血清溶于R2保存液中，搅拌均匀，即得R2试剂；
对比例1-2试剂盒及制备
试剂盒可用于普通免疫比浊法测定CER，包括试剂R1和试剂R2。
表3试剂R1的组分
试剂R1的配制步骤为(配制1L)：分别按照表1中对比例1-2的组分浓度，按照上述试剂R1的组分含量，使用纯化水配制PB缓冲液，调节pH，作为R1缓冲液；然后加入对应量的氯化钠、吐温20、聚乙二醇6000和ProClin300，混匀并用氢氧化钠/盐酸调节pH得到试剂R1。
试剂R2的组分如表4所示
表4试剂R2的组分
试剂R2的配制步骤为(配制1L)：按照上述试剂R2的组分含量，使用纯化水配制缓冲液，调节pH，作为R2保存液；按照上述试剂R2的组分含量，将处理过的铜蓝蛋白多抗血清溶于R2保存液中，搅拌均匀，即得R2试剂。
效果测试例1
效果测试试剂盒：实施例1～3的试剂盒、对照CER试剂盒(普通免疫比浊法)-浙江伊利康生物技术有限公司。
仪器：东芝120生化分析仪。
测试波长：主波长340nm，副波长700nm。
测试方法：终点法，递增性反应。37℃条件下，首先试剂R1与CER的血清样本混匀5分钟，然后加入试剂R2开始反应，其中体积比试剂R1:试剂R2:样本＝250:50:2；5分钟时比照空白测定初始吸光度A1，然后在10分钟时比照空白测定吸光度A2，计算A2与A1的差值ΔA。
1、标准曲线的测定
以实施例1～3和对照CER试剂盒分别逐一测定如表5所示的一系列标准浓度的CER的标准血清样本的ΔA值，而根据一系列CER的浓度和测得的ΔA值可分别拟合出各试剂盒的标准曲线，实施例1-3标准曲线为SPLINE函数。
CER的浓度与测得的ΔA值的对应的散点图如图1所示，由图1可知，实施例1～3相比于对照，在相同的条件下，吸光度变化更加明显，灵敏度更高。
表5标准血清样本的ΔA值测试结果
从图1可看出，本发明提供的配方能保证不同批次的多抗血清原材料的差异不影响试剂盒定标结果。蔗糖和BSA主要起保护多抗血清的作用，即提高试剂稳定性。
2、配制一份铜蓝蛋白浓度为40mg/dL的样本，用实施例1-3、对比例1-2的试剂盒以及对照CER试剂盒对样本重复检测7次，检测结果如表6所示。
表6 2-8℃保存0个月、1个月、3个月、6个月、18个月测定结果
由表6可见，实施例1-3在0个月、1个月、3个月、6个月、18个月测得的铜蓝蛋白浓度均接近真实值，并且测得的变异系数(CV值)均小于2％，对照CER试剂盒在0个月、1个月、3个月、6个月、18个月测得的铜蓝蛋白浓度与真实值(第0个月测值)相比逐渐偏低，且偏低幅度超过10％，比对例1-2在0个月、1个月、3个月、6个月、18个月测得的铜蓝蛋白浓度与真实值(第0个月测值)相比逐渐偏低，且偏低幅度超过10％。
本发明实施例与对比例的区别在于：
①本发明实施例R1均采用5-30mM PB pH7.4缓冲液，而对比例2采用的是40mM PBpH7.4缓冲液。测试结果表明，5-30mM PB pH7.4缓冲液对稳定性有利。
②本发明实施例R2中设置了最优的稳定剂配比，而对比例1中仅有NaCl作为稳定剂，测试结果表明，单稳定剂稳定性要差于双稳定剂稳定性。
③对比例1采用最优10mM PB pH7.4缓冲液，但R2为单稳定剂；对比例2采用最优稳定剂比，但R1为40mM PB pH7.4缓冲液。测试结果表明，只有最优R1配方和最优R2稳定剂比才能带来最优的稳定性结果。
3、采用实施例1-3对样本进行测定，所得铜蓝蛋白的测定值与对照CER试剂盒(普通免疫比浊)测定值进行比较(参见图2-4，并进行回归分析)；实施例1获得相关性r2＝0.9953(y＝0.9566x+0.9253)；显示出实施例1-3与对照CER试剂盒(普通免疫比浊法)具有良好的相关性。
用对照CER试剂盒测出标本的值作为预期浓度值，本发明的试剂盒测定的值作为测定浓度值，共测定若干标本，用这若干标本的3组测定数据做散点图，即本发明涉及的三个附图。
由此可知，本发明实施例1-3采用不同批次多抗血清原料，与对照试剂相比测值相关性较好，不同批次多抗血清原料的批间差异在本发明试剂盒中得到明显改善。
4、选取对照CER试剂盒的2个不同批次(标记为对照试剂盒批次1；对照试剂盒批次2)以及本发明试剂盒(依次为实施例1、实施例2、实施例3)比较测值批间差异，具体结果见图5，图6，图7、图8。
由图5可知，对照CER试剂盒不同批次之间测值存在差异，且相关性较差。由图6、图7、图8可知，本发明试剂盒不同批次之间测值差异基本没有。综上，本发明所提供配方能有效解决CER试剂盒批间差和稳定性问题。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种铜蓝蛋白的检测试剂盒，其特征在于，由R1试剂和R2试剂组成；
所述试剂R1由pH7.4的5~30 mM PB缓冲液、9g/L-20g/L的氯化钠、 60 -70g/L聚乙二醇6000、0.5-1.5g/L吐温20和0.1-1g/L的ProClin 300组成；
所述R2试剂由pH7.4的50mM TRIS缓冲液或MOPS缓冲液、9g/L的氯化钠、150g/L铜蓝蛋白多抗血清、0-5g/L BSA、60~80g/L蔗糖和0.1-1g/L ProClin 300组成。
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