CH642750A5 - Procedimento per la rapida determinazione del ferro nel siero sanguigno e miscela per l'esecuzione del procedimento. - Google Patents
Procedimento per la rapida determinazione del ferro nel siero sanguigno e miscela per l'esecuzione del procedimento. Download PDFInfo
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Description
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la rapida determinazione del ferro nel siero sanguigno e alla miscela per l'esecuzione del procedimento.
Sono conosciuti diversi procedimenti per la determinazione diretta del ferro nel siero sanguigno. Alcuni di questi procedimenti sono basati sulla possibilità di formazione di complessi colorati fra lo ione ferro divalente e un agente complessante come BP (4,7-difenil-l,10-fenantrolina), TPTZ (2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazina) e ferrozina (sale disodico della 3-(2-piridil)-5,6-bis (4-sufofenil)-s-triazina; vedasi L.L. Stookey: Analytical Chemistry, 42, n. 7 779,1970 e di determinare spettrofotometricamente il complesso formatosi.
La lettura specifica afferma che la ferrozina è particolarmente conveniente in quanto forma con il ferro divalente un complesso colorato con assorbanza molto alta (e = 27 100), solubile in acqua e stabile ad un pH fra 3,5 e 11 e preferibilmente fra 4 e 9.
La maggior parte dei procedimenti per la determinazione del ferro nel siero descritti in precedenza (1) la dissociazione del ferro dalla transferrina serica per trattamento con acidi minerali forti in presenza di un agente riducente; (2) la deproteinizzazione del siero mediante precipitazione delle proteine, per esempio, con acido tricloroacetico; (3) la determinazione dello ione ferro bivalente rimanente in soluzione mediante reazione colorimetrica con ferrozina dopo che il pH della soluzione è stato portato ad un valore fra 3 e 6 con un tampone (vedasi P. Carter: Anal. Biochem. 40, 450, 1971).
Altri procedimenti sono noti come metodi «diretti», che non richiedono la precipitazione delle proteine (si veda per esempio J. P. Persijn et altri: Clin. Chim. Acta 35, 91, 1971; J. M. White et al.: Clin. Chem. Voi. 19, n. 5, 526, 1973; R. Ruutu: Clin. Chim. Acta 61, 229, 1975). Questi procedimenti, generalmente richiedono l'uso di tamponi in mi intervallo di pH corrispondente al punto isoelettrico della maggior parte delle proteine del siero e quindi alla loro massima instabilità.
La precipitazione di proteine che interferirebbe fortemente con i risultati analitici è ovviata dall'aggiunta di detergenti. Questi dovrebbero anche dar luogo al distacco del ferro dalla trasferina senza abbassamento del pH.
Comunque la composizione variabile delle proteine dei vari sieri non permette una protezione uniforme e stabile verso la formazione di torbidità in ogni caso. Infatti, le differenze individuali non vengono ovviate dalla lettura del-l'assorbanza iniziale o del bianco in quanto, in parecchi casi, una torbidità imprevedibile può sovrapporsi al complesso colorato. Inoltre il distacco del ferro dalla transferrina può non essere completo e dare luogo a valori troppo bassi.
Per le ragioni esposte sopra il Gruppo degli Esperti sul Ferro del Comitato Internazionale per la Standardizzazione in Ematologia ha rifiutato come procedimenti di riferimento per il ferro nel siero tutti i numerosi procedimenti «diretti» senza precipitazione delle proteine finora proppsti (vedasi E. W. Rice e altri: Clin. Chim. Acta 53, 391, 1974). D'altra parte, la deproteinizzazione del siero rallenta sensibilmente le procedure e costituisce un passaggio critico in quanto i filtrati del siero, dopo precipitazione delle proteine, possono non essere perfettamente chiari; inoltre, si richiede l'uso di un tampone concentrato per sistemare il pH in un intervallo conveniente per la reazione cromogenica e questo può essere una causa di contaminazione da ferro.
La presenza di rame che, in certe condizioni patologiche può raggiungere livelli molto elevati, può interferire fortemente sui procedimenti spettrofotometrici, specialmente su quelli basati sull'uso di ferrozina. (Vedasi Hugh et al.: Clin. Chem. Voi. 17, n. 9, 950,1971; J. R. Duffy et al.: Clin. Biochem. 10, 122, 1977).
La presente invenzione fornisce un procedimento ed una miscela da usarsi nella forma di un corredo diagnostico per la determinazione del ferro nel siero senza necessità di deproteinizzazione e separazione del ferro. Il procedimento e la miscela secondo l'invenzione hanno anche il vantaggio che il distacco del ferro dalla trasferrina è completo essendo ottenuto a un pH basso, in presenza di un agente riducente, in condizioni sperimentali che permettono un completo e rapido sviluppo del complesso colorato senza formazione di torbidità, evitando così l'uso di agenti tensioattivi e di tamponi.
Il procedimento è molto semplice e facilmente automa-tizzabile, esso è caratterizzato dalla parte caratterizzante della rivendicazione 1. La miscela per realizzarlo è caratterizzata dalla parte caratterizzante della rivendicazione 10.
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Il principio essenziale della presente invenzione è il sorprendente trovato che: 1 con l'aggiunta di acido cloridrico al siero per raggiungere un pH di 2,1 o inferiore, non si forma alcuna torbidità e 2 la reazione fra ferrozina e ferro è completa anche a questi pH, permettendo così misure molto esatte del contenuto del ferro nel siero per mezzo di determinazioni colorimetriche. È stato inoltre trovato che la presenza di tiosemicarbazide in queste condizioni elimina ogni interferenza del rame senza influenzare negativamente o complicare sconvenientemente la procedura per la determinazione del ferro.
Secondo il procedimento diretto della presente invenzione, ad un siero contenente ferro da determinarsi si aggiunge acido cloridrico per portare il valore del pH fra 1,6 e 4,0, preferibilmente tra 1,7 e 2,1.
Al campione di siero da esaminarsi si aggiungono inoltre un agente riducente per portare lo ione ferro in forma divalente, ferrozina e tiosemicarbazide. Dopo l'aggiunta di questi reagenti, il campione viene mescolato cautamente e quindi, dopo esser lasciato a temperatura ambiente per 5-20 minuti, si determina colorimetricamente il contenuto in ferro del campione per mezzo del complesso colorato. Di conseguenza, si misura l'assorbanza a 562 nm contro un bianco del reagente, cioè un campione contenente la stessa miscela di cui sopra con l'esclusione della ferrozina. La valutazione del contenuto in ferro viene effettuata per mezzo di una curva standard ottenuta da soluzioni acquose, tamponate allo stesso pH del campione in esame, contenenti i reagenti di cui sopra e una quantità pesata di ferro.
L'acido cloridrico che viene aggiunto al campione di siero per il distacco del ferro dalla transferrina per ottenere il pH desiderato è generalmente in quantità tale che la sua concentrazione nel campione in esame varia da 0,04 mol/1 a 0,15 mol/1, preferibilmente da 0,05 mol/1 a 0,12 mol/1. Come agente riducente si impiega preferibilmente l'acido ascorbico.
Basse concentrazioni come 1,5 mg/ml nel campione in esame sono sufficienti per dar luogo a un completo sviluppo colorimetrico. Nella pratica usuale, si impiegano vantaggiosamente concentrazioni da 5 mg/ml a 10 mg/ml.
II colore aumenta con l'aumentare della concentrazione della ferrozina fino a 0,4 mg/ml nel campione in esame. Comunque si può osservare un completo sviluppo del colore anche a concentrazioni più basse se la lettura viene effettuata almeno 20 minuti dopo la reazione. In pratica, la concentrazione di ferrozina nel campione in esame viene generalmente mantenuta fra circa 0,4 mg/ml e circa 1 mg/ml.
La tensiomicarbazide, anche a concentrazioni molto basse nel campione in esame, previene completamente le interferenze dovute al rame ad un pH nell'intervallo fra 1,7 e 2,1. Nell'intervallo di pH indicato sopra la tiosemicarbazide è più efficace di altri agenti come ad esempio la tieurea e non reagisce col ferro.
Le concentrazioni di tiosemicarbazide che sono solitamente impiegate secondo il modo di realizzare questa invenzione sono generalmente varianti fra 0,5 mg/ml ed 1 mg/ml.
La reazione dei reagenti col siero è generalmente effettuata aggiungendo ad un volume di siero due volumi di una soluzione contenente acido ascorbico, ferrozina e tiosemicarbazide in quantità determinante in acido cloridrico di concentrazione appropriata. Quest'ultima soluzione è preparata prima di effettuare il saggio ed è stabile fino a due ore.
La lettura contro il bianco può anche essere effettuata nella stessa provetta dove viene effettuata la reazione fra i reagenti ed il siero. In questo caso, si aggiunge prima al siero la soluzione dei reagenti escludendo la ferrozina e si effettua una prima lettura a 562 nm per il bianco. Quindi, si aggiunge la ferrozina in quantità sufficiente e si effettua una seconda lettura alla stessa lunghezza d'onda per la determinazione del contenuto del ferro. Questa possibilità di effettuare letture differenziali in una sola provetta riduce sia la quantità di siero sia il numero di operazioni richieste.
In una procedura alternativa, i reagenti solidi possono anche essere aggiunti sotto forma di piccole pastiglie alla miscela di siero ed acido cloridrico. Queste pastiglie possono contenere la quantità richiesta di acido ascorbico e ferrozina o la quantità richiesta di tiosemicarbazide con eccipienti comuni come derivati dei carboidrati e polietilengli-coli ad alto peso molecolare. Il procedimento secondo la presente invenzione fornisce risultati molto soddisfacenti quando vengono effettuati esperimenti su sieri a differente concentrazione per stabilire la riproducibilità.
Inoltre, quando a campioni di siero raccolto vengono aggiunte soluzioni standard di ferro per aumentare la concentrazione nei campioni, il tracciato dei valori dell'assor-banza per le concentrazioni del ferro aggiunto passa attraverso il punto di addizione zero. Così, la concentrazione originale del ferro nel campione può venire determinata per estrapolazione alla ascissa, dando prova della accuratezza del metodo.
L'assorbanza calcolata dagli esperimenti di addizione coincide con quella trovata con le soluzioni di ferro standard. Il procedimento secondo la presente invenzione è stato confrontato con altri procedimenti noti implicanti sia la deproteinizzazione sia il procedimento diretto. L'assorbimento atomico (AA) è stato scelto come procedimento di confronto (dopo accertamento della sua affidabilità mediante esperimenti di riproducibilità e di recupero) perché è indubbiamente libero da intereferenze dovute al rame. Si è determinato il ferro su 26 sieri coprenti un largo intervallo di concentrazioni mediante 1) un procedimento automatizzato a flusso (AT) (B. Zak. et al.: Clin. Vol. 11, n. 6, 641, 1965) che implica il distacco dal ferro dalla transferrina; 2) il procedimento secondo la presente invenzione (DRC; il procedimento di assorbimento atomico (AA) che implica la deproteinizzazione; un procedimento commerciale diretto identificato come DM1 e un procedimento commerciale diretto identificato come DM2. Entrambi questi ultimi due procedimenti sono essenzialmente basati sul procedimento descritto da K. Lauber (Zeit. Klin. Chem. 3, 96, 1965).
I risultati sono riportati nella seguente tabella I.
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TABELLA 1 [ig di ferro per 100 mi di siero
Siero n. AT AA DRC DR 1 DR 2
1 4 10 11 ** 70 ** non leggibile
2 15 17 16 17 20
3 24 34 36 * 45 □ non leggibile
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*: Formazione di torbidità **: Formazione di torbidità in rapido aumento □ : Lieve emolisi
I risultati della tavola I sopra riportata mostrano che c'è un'eccellente correlazione fra il procedimento secondo la presente invenzione e quello dell'assorbimento atomico (AA) in tutto l'intero intervallo di concentrazioni. Per concentrazioni inferiori a 60 |id/dl e superiori a 160 ^g/dl, AT è in una correlazione meno soddisfacente con AA che non il procedimento secondo l'invenzione. Con il corredo DM1 si osserva frequentemente della torbidità che in alcuni casi è responsabile di valori erroneamente alti.
Con il corredo DM2, in alcuni campioni, si sviluppa una torbidità rapidamente crescente che vieta ogni possibilità di lettura; si è anche trovato che una leggera emolisi dà luogo a delle interferenze.
Inoltre, i valori trovati sono solitamente più bassi di quelli ottenuti con gli altri procedimenti.
Descrizione dettagliata del procedimento secondo l'invenzione
Soluzioni:
1) 100 mg di tiosemicarbazide, 1 g di acido ascorbico e 100 mg di ferrozina sono posti in una beuta volumetrica di 100 mi e quindi sciolti con HCl 0,1 molare. La soluzione è portata a volume con HCl 0,1 molare.
2) La stessa soluzione, con l'esclusione della ferrozina, viene preparata per il bianco.
Le soluzioni sono impiegate entro due ore.
3) Per le soluzioni campione, 100 mg di tiosemicarbazide, 1 g di acido ascorbico e 100 mg di ferrozina sono sciolti con un tampone glicina 0,1 molare ad un pH 2,1 e portati ad un volume di 100 mi con lo stesso tampone.
4) I campioni di riferimento per il ferro sono preparati mediante appropriate diluizioni di una soluzione standard di stoccaggio contenente 100 ng/ml di ferro al 99,9%. Le soluzioni di concentrazione desiderata da 25 a 400 jig/dl vengono preparate giornalmente.
Procedura:
A 2 mi della soluzione (I) si aggiunge 1 mi di siero in una provetta; la provetta viene ricoperta con un film di plastica inerte (p.e.: Parafilm®) e la soluzione viene mescolata per inversione. Dopo 5 minuti di riposo, la soluzione viene nuovamente mescolata e dopo ulteriori 5 minuti si legge l'assorbanza a 562 nm contro un bianco preparato per aggiunta di 1 mi di siero a 2 mi di soluzione 2.
Per la curva standard si aggiunge 1 mi delle varie soluzioni ferrose 4 a 2 mi di soluzione 3. Dopo mescolamento, si leggono le relative assorbanze contro il bianco per aggiunta di 2 mi di soluzione I a 1 mi di tampone glicina, poiché tracce di ferro possono essere presenti anche nella più pura glicina. Le assorbanze sono riportate in un grafico contro le concentrazioni standard di ferro.
Quando la reazione è effettuata in una singola provetta, si aggiunge 1 mì di siero a 2 mi di soluzione 2 e si effettua una prima lettura a 562 nm. Quindi, si aggiungono 100 p.1 di una soluzione di ferrozina di 2 g/dl e, dopo miscela-mento per ripetute inversioni e riposo per 10 minuti si effettua una seconda lettura a 562 nm.
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Claims (10)
1. Procedimento per la rapida determinazione del ferro nel siero sanguigno comprendente (a) far reagire il siero sanguigno con ferrozina in presenza di un agente riducente per portare lo ione ferro nella forma bivalente, tiosemi-carbazide ed acido cloridrico ad un pH fra 1,7 e 2,1, senza aggiunta di tamponi e di agenti tensioattivi e (b) determinare colorimetricamente il contenuto in ferro del campione per mezzo del complesso colorato formatosi fra lo ione ferro e la ferrozina rispetto a un bianco dei reagenti.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove l'agente riducente è l'acido ascorbico.
2
RIVENDICAZIONI
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove la concentrazione di acido cloridrico nel campione in esame sottoposto a determinazione colorimetrica varia fra 0,05 mol/1 e 0,12 mol/l.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove la concentrazione della ferrozina nel campione in esame sottoposto a determinazione colorimetrica ammonta da 0,4 mg/ml a 1 mg/ml.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove la concentrazione della tiosemicarbazide nel campione in esame sottoposto a determinazione colorimetrica ammonta da 0,5 mg/ml a 1 mg/ml.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 2 dove la concentrazione dell'acido ascorbico nel campione in esame ammonta ad almeno 1,5 mg/ml.
7. Procedimento secondo le rivendicazioni da 1 a 6, caratterizzato da ciò che il reagente ferrozina viene aggiunto sottoforma di una soluzione concentrata alla miscela di reazione effettuando due letture fotometriche sul campione, una prima e l'altra dopo l'aggiunta di ferrozina.
8. Miscela per l'esecuzione del procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che essa comprende acido cloridrico, acido ascorbico, ferrozina e tiosemicarbazide senza aggiunta di agenti tensioattivi.
9. Miscela secondo la rivendicazione 8, caratterizzata da ciò che la concentrazione dell'acido cloridrico varia da 0,05 mol/11 a 0,12 mol/1, la concentrazione dell'acido ascorbico varia fra 5 mg/ml e 10 mg/ml, la concentrazione di ferrozina varia fra 0,4 mg/ml e 1 mg/ml e la concentrazione di tiosemicarbazide varia fra 0,5 mg/ml e 1 mg/ml.
10. Miscela secondo la rivendicazione 8, caratterizzata da ciò che i reagenti ferrozina e acido ascorbico e la tiosemicarbazide vengono aggiunti alla miscela di siero e acido cloridrico sotto forma di pastiglie.
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