LU81862A1 - Procede et composition pour la determination directe de la teneur en fer du serum sanguin - Google Patents

Description

D. 5o.84o

------g \ g g Z GRAND-DUCHE DE LUXEMBOURG

Brevet N° ..... ...........

du ...7. ^ (gfg Monsieur le Ministre 0¾¾¾ de l'Économie Nationale et des Classes Moyennes

Titre ( -ivre \ ....................

ttdm Service de la Propriété Industrielle

LUXEMBOURG

Uf L '^ii /. ç 3V Γ /;> Demande de Brevet d’invention 7 ' v , J cj - I. Requête

1 î*„eôçiÔtt_dite : R.Ç.C. - sociëta RICERCHE DI CHIMICA CLINICA {U

S.r.1., Via G. Leopardi 2 7, MILAN(Italie),représentée par Monsieur Jacques de Muyser, agissant en qualité de mandataire (2)

dépose ce sePt novembre 19oo soixante dix-neuf (3J

à........15................heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant : ”.....Rrefiédé....et....gQinpoM.itlon.....pQBg....la....dé.t!erg>laatlon.....dÎige-C.te......de....!.«..........(4) teneur... ..en JEer jdu.....sérum sanguin.".............................................................................................................................................

déclare, en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur© est (sont) : ÇERIOTO ......1.1.,......yia....San.....Pip.....X..............................................(5) PADOVA.....{Italie).......................................................................................................................................................................................................................

2. la délégation de pouvoir, datée de .Μ^.Φ.Ρ·............................................... le .....19.79 3. la description en langue........française................................... de l’invention en deux exemplaires ; 4...........J.................... planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 7 novembre .1979 revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande© de (6) ....................................................................déposée© en (7).........Italie................................................................................................

le 8 novembre 1978 No. 29543 A/78 (8) au nom de la posante.............................................................................................................................................................................................(9) élit domicile pour lui telle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg ........................................

Ψ 35,boulevard Royal (10) , sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, — avec ajournement de cette délivrance à ........~................................... mois.

le....Ni^taire...........n..........*...........« Π. Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale * et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : 7 novembre 1979 . * '.-·»> Pr. le Ministre à 15 heures de l’Économie Nationale des Classes Moyennes,

CrOitf 11-¾¾ ? f?'-f ’C/V J» f V A 680OT \«» yi ....... ' ..... ' \?' !.' ~ -------- il \ Μηττ nrônnm firme nriroccc _ ft)\ Tiev· >ior - » oeïoeent er. Wnitnüfp rie» msndrtPrirp — (3) HafP rin ! n. so.s4o

REVENDICATION DE LA PRIORITE DU DEPOT DE LA DEMANDE DE BREVET

i EN ITALIE_ DU 8 novembre 1978 i ; i ( ( V i ; \ Λ Λ >: X \ \ \ I ^ ·· /N, Λ .

j i | i : Mémoire Descriptif I i déposé à l’appui d’une demande de j

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg j formée par: R.C.C. - Societä RICERCHE DI CHIMICA CLINICA S.r.l.

! I* pour; Procédé et composition pour la détermination directe ( de la teneur en fer du sérum sanguin.

! i i ( ° —

La presente invention concerne un procédé et ]es compositions y relatives pour la détermination directe de la teneur en fer du sérum sanguin.

! On connaît plusieurs procédés pour la détermi nation directe de la teneur en fer du sérum sanguin. Cer--, tains de ces procédés sont basés sur la possibilité de former | des complexes colorés entre l'ion fer bivalent et des agents ; complexants tels que la 4,7-diphényl-1,10-phénantroline, la 2,4,6-tris-(2-pyridyl)-s-triazine et la ferrozine sel diso-. dique de la 3-(2-pyridyl)-5,6-bis-(4-sulfophényl)-s-triazine ; voir L.L. Stookey : "Analytical Chemistry", 4_2, N° 7, 779, 1970/, la détermination du complexe formé ayant lieu par voie spectrophotométrique. La littérature spécifique stipule que la ferrozine est particulièrement appropriée du fait qu’elle forme, avec le fer bivalent, un complexe coloré d’une très haute capacité d’absorption (£ = 27.100), soluble dans l'eau et stable à un pH compris entre 3,5 et 11, de préférence, entre 4 et 9.

i

La plupart des procédés de détermination de la j . teneur en fer du sérum qui ont été décrits dans la technique i antérieure,nécessitent : (1) la dissociation du fer de la ; Λ.

* transferrine du sérum par traitement avec des acides minéraux » forts en présence d'un agent réducteur, (2) la déprotéinisa-tion du sérum par précipitation de protéines, par exemple, | avec l'acide trichloracêtique, (5) la détermination de l'ion fer bivalent subsistant dans la solution par une réaction chromogène avec la ferrozine après avoir porté le pH de la solution à une valeur se situant entre 3 et 6 avec un tampon (voir P. Carter : "Anal. Biochem." 40, 450, 1971).

~ - — D'autres procédés sont connus sous le nom de I, "procédés directs", lesquels ne nécessitent pas une préci- t‘ • pitation des protéines (voir, par exemple, J.P. Persijn et i al., "Clin. Chim. Acta" 3_5, 91, 1971 ; J.M. White et al.

"Clin. Chem." Vol. 19, N° 5, 526, 1973 ; R. Ruutu : ' "Clin. Chim. Acta" (Π, 229, 1975).

i' i ” En règle générale, ces procédés impliquent l'utilisation de tampons à un pH se situant dans un intervalle correspondant au point isoélectrique de la plupart des protéines du sérum et, par conséquent, à leur maximum d'instabilité. On évite la précipitation de protéines i (ce qui perturberait fortement les résultats analytiques) i ;i î par l'addition de détergents. Ces derniers doivent égale- ment assurer la séparation entre le fer et la transferrine sans abaisser le pH. Toutefois, du fait que les différents sérums ont des compositions variables en protéines, on ne ! peut assurer une protection stable et uniforme contre la formation d'un trouble dans chaque cas. En effet, on n’évite pas les différences individuelles par la lecture f de la capacité d'absorption initiale du témoin car, dans i j plusieurs cas, un trouble imprévisible peut venir se super- jj * . poser au complexe coloré. De plus, la libération du fer ‘ hors de la transferrine peut ne pas être complète, donnant ] ainsi erronément de faibles valeurs. Pour les raisons invoquées ci-dessus, les experts chargés de la détermination

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| de la teneur en fer et faisant partie du Comité Internationa] j.

de Normalisation en Hématologie ont rejeté,comme procédés i« . de référence pour la détermination de la teneur en fer du i: sérum, tous les nombreux "procédés directs" sans précipitatic Ç de protéines, connus jusqu'à présent (voir E.W. Rice et al., ii| "Clin. Chim." Acta" 53, 391 , 1974).

iï - 4 - D'autre part, la déprotéinisation du sérum rend le procédé beaucoup plus long et constitue une étape critique puisqu'aussi bien, après précipitation des protéines, les filtrats de sérums peuvent ne pas être parfaitement clairs De plus, un tampon concentré est nécessaire pour régler le pH dans un intervalle approprié pour la réaction chromogène, ce qui peut être une source de contamination du fer. La présence du cuivre qui, dans certaines conditions pathologiques, peut atteindre des valeurs très élevées, peut gêner fortement les procédés spectrophotomêtriques, en particulier, ceux basés sur l'utilisation de la ferrozine (voir Hugh et al., "Clin. Chem.", volume 17, n° 9, 950, 1971 ; J.R. Duffy et al., "Clin. Biochem." K), 122, 1977).

La présente invention fournit un procédé et des compositions que l'on utilise sous forme d'une trousse de diagnostic en vue de déterminer la teneur en fer du sérum sans devoir procéder à une dëprotëinisation et à une séparation du fer. Le procédé et les compositions suivant la présente invention offrent également un avantage du fait que l'on obtient une libération complète du fer hors de la trans-ferrinc à un faible pH sans devoir ajouter des tampons, en présence d'un agent réducteur et dans des conditions expérimentales permettant un développement complet et rapide du complexe coloré,sans aucun trouble, évitant ainsi l'utilisation d'agents tensio-actifs. Ce procédé est très simple et peut être aisément automatisé.

La présente invention est basée sur la découverte surprenante selon laquelle : (1) en ajoutant de l'acide chlorhydrique au sérum pour atteindre un pH de 2,1 ou moins, il ne se produit aucun trouble, (2) la réaction entre la ferrozine et le fer est complète même â ce pH. permettant - s - du sérum par des déterminations colorimétriques.

De plus, on a trouvé que la présence de thio-semicarbazides dans ces conditions permettait d'éviter toute interférence par le cuivre sans exercer une influence négative et sans compliquer de manière intempestive le procédé de détermination de la teneur en fer.

• Suivant le procédé direct de la présente inven- i t j tion, à un sérum dont on doit déterminer la teneur en fer, i ! - on ajoute de l'acide chlorhydrique pour porter le pH à une : , valeur comprise entre 1,6 et 4, de préférence, entre 1,7 et | 2,1. A l'échantillon de sérum devant être soumis à l'essai, | on ajoute également un agent réducteur (en vue d’amener l'ion i · i, fer à l'état bivalent), de la ferrozine et du thiosemicarba- i | zide. Au terme de l'addition de ces réactifs, on mélange soigneusement l'échantillon puis, après l'avoir laissé ; reposer à la température ambiante pendant une période de | 5 à 20 minutes, on détermine la teneur en fer de 1'échanti11o] par voie colorimétrique au moyen du complexe coloré.

En conséquence, on mesure la capacité d'absorption à 562 nm vis-à-vis d'un témoin réactif, c'est-à-dire ' un échantillon contenant le même mélange que celui indiqué »

ci-dessus, à l'exclusion de la ferrozine. On effectue l'évaluation de la teneur en fer au moyen d'une courbe type tracée à partir de solutions aqueuses tamponnées au même pH

que l'échantillon d'essai et contenant les réactifs ci-dessus i I - ainsi qu'une quantité pesée de fer. L'acide chlorhydrique que l'on ajoute à l'échantillon de sérum en vue de libérer le fer de la transferrine et atteindre le pH désiré, est généralement utilisé en une quantité telle que sa concentra-S tion dans l'échantillon d'essai se situe entre 0,04 et 0,15 1 mole/litre, de préférence, entre 0,05 et 0,12 mole/litre.

- (> - » J réducteur. Des concentrations aussi basses que 1,5 mg/ml | dans l'échantillon d'essai sont suffisantes pour donner i lieu au développement chromogène complet. Dans la pratique habituelle, on adopte avantageusement des concentrations se situant entre 5 et 10 mg/ml. La coloration s’intensifie lorsqu'on augmente la concentration en ferrozine jusqu'à 0,4 mg/ml dans l'échantillon d'essai. Toutefois, on peut ! également observer un développement chromogène complet à des concentrations inférieures si la lecture est pratiquée au moins 20 minutes après la réaction.

ï Pour des applications pratiques, la concentra- | tion de ferrozine dans l'échantillon d'essai est généralement maintenue entre environ 0,4 et environ 1 mg/ml.

Même à de très basses concentrations dans l'échantillon d'essai, le thiosemicarbazide inhibe totalement | l'interférence provoquée par le cuivre à un pH se situant entre 1,7 et 2,1. A un pH se situant dans l'intervalle ci-dessus, le thiosemicarbazide est plus efficace que d'au- i !' très réactifs tels que la thiourée ; par ailleurs, il ne i*i réagit pas avec le fer. Suivant une forme de réalisation ; de l'invention, le thiosemicarbazide est habituellement ! ‘ utilisé en concentrations se situant généralement entre 0,5 et 1 mg/ml.

; La réaction des réactifs avec le sérum est ! généralement effectuée en ajoutant, à un volume de sérum, lt! | deux volumes d'une solution contenant de l'acide ascorbique, | de la ferrozine et du thiosemicarbazide (dans les quantités f ! ' déterminées) dans du HCl d'une concentration appropriée.

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On prépare cette dernière solution avant d'effectuer l'essai „ et elle reste stable pendant une période allant jusqu'à i 2 heures.

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On peut également effectuer la lecture vis- à-vis du témoin dans 3a même cuvette que celle dans la- ! quelle a lieu la réaction entre les réactifs et le sérum.

Ht ji Dans ce cas, on ajoute tout d'abord, au sérum, la solution ;'i des réactifs, à l'exclusion de la ferrozine et l'on pratique ; une première lecture à 562 nm pour le témoin. Ensuite, on 1 ajoute la ferrozine en une quantité suffisante et l'on pra tique une deuxième lecture à la même longueur d’onde en vue de déterminer la teneur en fer. Cette possibilité de pratiquer des lectures différentielles dans une seule cuvette |ij réduit à la fois la quantité de sérum et le nombre d'opérations requises. En variante, au mélange du sérum et de l'acide i ; chlorhydrique, on peut également ajouter les réactifs solides i sous forme de petits comprimés. Ces comprimés peuvent con- ί tenir la quantité requise d'acide ascorbique et de ferrozine i ! ou la quantité requise de thiosemicarbazide avec des exci- i i pients ordinaires tels que des dérivés de carbohydrates et l· des polyéthylène-glycols à poids moléculaire élevé. Le pro- ! cédé de 1 a présente invention donne des résultats très satis faisants lorsque des essais de détermination de reproductibilité sont effectués sur des sérums à des concentrations 4 différentes. De plus, lorsqu'on ajoute des solutions types de fer à des échantillons de sérums rassemblés afin d'en augmenter les concentrations, le diagramme des valeurs relatives à la capacité d'absorption pour les concentrations de fer ajouté passe par le point d’addition zéro. Dès lors, ! on peut déterminer la concentration initiale en fer de l'échantillon par extrapolation en abscisse, ce qui démontre la précision du procédé. La capacité d'absorption calculée d'après les essais d'addition coïncide avec celle trouvée : au moyen de solutions types de fer. On a comparé le procédé 1 - 8 - portant à la fois une déprotéinisation et un procédé direct. Comme procédé de comparaison, on a choisi l'absorption atomique (AA) (après en avoir déterminé la fiabilité par des essais de reproductibilité et de récupération) car, sans aucun doute, cette méthode ne donne pas lieu à une interfê-, rence par le cuivre. On a déterminé la teneur en fer de 26 sérums couvrant une large gamme de concentrations par : (1) un procédé d'écoulement automatisé (AT) (B. Zak et al., *' "Clin." volume 11, n° 6, 641, 1965) comportant la séparation entre le fer et la transferrine, une dialyse et la formation d'un complexe avec la ferrozine ; (2) le procédé de la présente invention (DRC) ; le procédé d'absorption atomique (AA) comportant une déprotéinisation ; un procédé direct commercial désigné par DM1 et un procédé direct commercial désigné ; par DM2. Ces deux derniers procédés sont essentiellement basés sur celui décrit par K. Lauber ("Zeit.Klin. Chem.", 3, 96, 1965).

Les résultats obtenus sont repris dans le j tableau ci-après.

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TABLEAU

Sérum ,ug de fer par 100 ml de sérum n° _

AT AA DRC DR 1 DR Z

1 4 10 11 xx 70 xx illisibl 2 15 17 16 17 20 3 24 34 36 x 45 (H| illisibl 4 33 48 50 45 40 5 40 40 39 x 45 35 6 44 45 44 45 45 7 51 52 52 39 48 8 55 55 55 50 40 9 59 60 58 55 50 10 66 70 75 55 53 H 73 72 72 67 60 12 79 70 66 78 75 13 82 84 83 72 60 14 87 88 87 83 70 15 91 93 97 83 75 16 94 90 92 89 75 ! ί 17 98 96 98 xx133 100 ; 18 108 110 108 105 85 19 120 125 128 x128 110 20 128 127 126 122 112 21 140 140 138 xx200 125 22 150 145 145 134 125 ! 23 163 155 152 xx172 140 * ; 24 180 175 180 167 155 | ' 25 213 210 217 194 175 ! 26 241 238 239 228 225 x Formation d’un trouble xx Formation d’un trouble croissant rapidement - 10 - I , - Les résultats du tableau démontrent qu'il y a j une excellente corrélation entre le procédé de la présente i invention et le procédé d'absorption atomique (AA) pour toute | jj la gamme de concentrations. Pour des concentrations infé- rieures à 60/Ug/dl et supérieures ä 160^/ug/dl, le procédé

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d'écoulement automatisé est dans une corrélation moins sa- ! « h: I" tisfaisante avec l'absorption atomique que le procédé de la présente invention. Avec la trousse du procédé DM1, on h observe fréquemment la formation d'un trouble qui, dans i certains cas, est responsable de hautes valeurs erronées.

' Avec la trousse du procédé DM2, dans certains échantillons, j il se forme un trouble croissant très rapidement et ; empêchant toute lecture, tandis que l'on observe même une i j légère hémolyse donnant lieu à des interférences. De plus, j les valeurs trouvées sont habituellement inférieures à celles i ; observées avec les autres procédés.

Description détaillée du procédé de l'invention Solutions : ! 1) On dépose 100 mg de thiosemicarbazide, 1 g i! *; d'acide ascorbique et 100 mg de ferrozine dans un ballon •ft % 1 volumétrique de 100 ml, puis on les dissout avec du HCl N 0,1M. On complète le volume de la solution avec du HCl 0,1M.

; 2) Pour le témoin, on prépare la même solution à l'exclusion de la ferrozine.

:r 1*1 On utilise les solutions dans les deux heures.

[ ;· [ j . 3) Pour des solutions types de travail, on { i- Λ * ♦ · » i; dissout 100 mg de thiosemicarbazide, 1 g d'acide ascorbique !*= et 100 mg de ferrozine avec un tampon de glycine 0,1M a un |î! pH de 2,1 et on complète le volume ä 100 ml avec le même tampon.

; 4) On prépare des échantillons types de traite- - 11 - type contenant 100 yjg/ml de fer à 99,9¾. On prépare quotidiennement des solutions aux concentrations désirées de 25 à 400 yug/dl.

Procédé : A 2 ml de la solution (1), on ajoute 1 ml de sérum dans une cuvette ; on recouvre cette dernière d’une pellicule inerte en matière plastique (par exemple : "Parafilm", marque commerciale déposée) et l'on mélange la * solution par inversion. Après l'avoir laissé reposer pendant 5 minutes, on mélange à nouveau la solution et, après 5 minutes supplémentaires, on lit la capacité d'absorption à 562 nm vis-à-vis d'un témoin préparé en ajoutant 1 ml de sérum à 2 ml de la solution (2).

Pour la courbe type, à 2 ml de la solution (3), on ajoute 1 ml des différentes solutions de fer (4). Après mélange, on lit les capacités d’absorption relatives vis-à-vis du témoin en ajoutant 2 ml de la solution (1) à 1 ml de tampon de glycine, car des traces de fer peuvent également être présentes dans la glycine la plus pure. On trace un diagramme des capacités d'absorption vis-à-vis des concentrations types de fer.

Lorsqu'on effectue la réaction dans une seule cuvette, on ajoute 1 ml de sérum à 2 ml de la solution (2) et l'on pratique une première lecture à 562 nm. Ensuite, on ajoute 100 ^ul d'une solution de 2 g de ferrozine/dl et, après mélange par des inversions répétées et en laissant reposer pendant 10 minutes, on pratique une deuxième lecture à 562‘ nm.

Claims (13)

1. Procédé direct pour la détermination de la teneur en fer du sérum sanguin, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes qui consistent à : (a) faire réagir le sérum sanguin avec de la ferrozine en présence d'un agent réducteur pour amener l'ion fer à l'état bivalent, du thiosemicarbazide « et de l'acide chlorhydrique à un pH compris entre 1,7 et 2,1 sans aucune addition de tampons et d'agents tensio-actifs, et (b) déterminer, par colorimétrie, la teneur en fer de l'échantillon au moyen du complexe coloré formé entre l'ion * fer et la ferrozine, vis-à-vis d'un témoin réactif.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent réducteur est l'acide ascorbique.

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration d'acide chlorhydrique dans l'échantillon d'essai soumis à la mesure colorimétrique se situe entre 0,05 mole/litre et 0,12 mole/litre.

4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de ferrozine dans l'échantillon d'essai soumis à la détermination colorimétrique se situe entre 0,4 et 1 mg/ml.

5. Procédé suivant la revendication 1, carac térisé en ce que la concentration du thiosemicarbazide dans l'échantillon d'essai soumis à la détermination colorimétriqu< ; se situe entre 0,5 et 1 mg/ml. f

6. Procédé suivant la revendication 2, carac- b térisé en ce que la concentration de l'acide ascorbique dans l'échantillon d'essai est d'au moins 1,5 mg/ml.

7. Composition réactive pour la détermination de la teneur en fer du sérum sanguin, caractérisée en ce qu'elle comprend de la ferrozine, du thiosemicarbazide et de - 17 - « r

8. Composition réactive suivant la revendication 8, en solution dans l’acide chlorhydrique.

9. Trousse pour la détermination colorimétri-que de la teneur en fer du sérum sanguin sans précipitation de protéines, caractérisée en ce que le mélange des réactifs . „ pour la détermination colorimétrique comprend de l’acide chlorhydrique, de l’acide ascorbique, de la ferrozine et du ît thiosemicarbazide sans nécessiter l'addition d’agents tensio- • actifs. t

- 10. Trousse suivant la revendication 9, carac térisée en ce qu’on prépare le mélange des réactifs de telle sorte que, dans l’échantillon d’essai soumis à la mesure colorimétrique, la concentration de l'acide chlorhydrique se situe entre 0,05 et 0,12 mole/litre, la concentration d'acide ascorbique, entre 5 mg et 10 mg/ml, la concentration de ferrozine, entre 0,4 et 1 mg/ml et la concentration de thiosemicarbazide, entre 0,5 et 1 mg/ml.

11. Trousse suivant la revendication 10, caractérisée en ce que la ferrozine réactive est ajoutée sous forme d'une solution concentrée au mélange réactionnel, tandis que l’on pratique deux lectures photométriques sur « „ * l'échantillon, l'une avant l’addition de la ferrozine et l’autre, après cette addition.

12. Trousse suivant la revendication 9, carac térisée en ce que les réactifs, ä savoir la ferrozine, l'acii ascorbique et le thiosemicarbazide sont ajoutés sous forme de comprimés au mélange de sérum et d'acide chlorhydrique. i!

‘ 13. Comprimé utilisé dans la trousse de ^ l'exemple 12, caractérisé en ce qu'il contient de la ferro- if zine et de l'acide ascorbique avec un support inerte. «