JP3400991B2 - グリコヘモグロビンの迅速測定 - Google Patents

グリコヘモグロビンの迅速測定

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 グリコヘモグロビンは、ヘモグロビン分子に各種の糖類
（最も一般的にはグルコース）が結合して生成される一
連のヘモグロビン少量成分を意味する一般的用語であ
る。糖尿病の観点からしてこれらヘモグロビン少量成分
のうち最も重要なものは、ヘモグロビンＡ1cである。こ
れは、ヘモグロビンＡの一方もしくは両方のβ鎖におけ
るＮ−末端アミノ酸残基バリンにグルコースが結合して
形成される［Goldstein, D.E. 等、Clin. Chem．32:B64
-B70, 1986］。
【０００２】ヒト赤血球はグルコースを自由に透過しう
る。各赤血球内には、グリコヘモグロビンがヘモグロビ
ンＡ（天然の正常型）から周囲グルコース濃度に比例し
た割合で形成される。この反応は自発的であって酵素触
媒を要しないものの、充分に遅く、このため赤血球の寿
命（１２０日）の間にはヘモグロビンのごく一部が修飾
されるだけで、かつこれは不可逆性である。その結果、
グリコヘモグロビンは過去の血糖値の加重「移動」平均
の尺度となり、より最近の血糖値がより大きく影響する
［Singer等,Ann.Clin. Biochem. 26:213-219, 1989］。
【０００３】グリコヘモグロビンのレベル上昇は真性糖
尿病に関連することが知られている。非糖尿病患者では
グリコヘモグロビンは全ヘモグロビンの約５％のレベル
にて存在するのに対し、糖尿病患者はこの量の２〜４倍
を示す。グリコヘモグロビンレベルは血糖値の短期変動
には比較的影響を受けず、糖尿病患者における血糖管理
の状態を比較的正確に反映する。その結果は、過去１〜
３ケ月にわたる期間平均血糖濃度を示す。グリコヘモグ
ロビン測定は糖尿病患者におけるグルコース不耐性程度
の評価 および真性糖尿病の管理に使用される［Leste
r, Ann. Clin. Biochem. 26:213-219, 1989; Kennedy
等, Br.Med. Bull. 45: 174-190,1989; Flueckiger等,
J. Chromatogr. 429:279-292, 1988; Goldstein, 等, C
lin. Chem.32:B64-70, 1986; Mortensen, Dan. Med. Bu
ll. 32:309-328, 1985; Goldstein等, CRC Crit. Rev.
Clin. Lab. Sci. 21:187-228, 1984, Peacock, J. Cli
n. Pathol. 37: 841-851, 1984; Miedema等, Ann. Cli
n. Biochem. 21:2-15, 1984;Mayer等, Clin. Chem. Act
a 127:147-184, 1983; Gabbay, Med. Clin. North Am.
66:1309-1315, 1982 」。
【０００４】グリコヘモクロビンを、ヘモグロビンＡ1c
もしくはヘモグロビンＡ１として或いは全グリコヘモグ
ロビンとして測定するには種々の方法がある（イオン交
換クロマトグラフィー、チオバルビツール酸法、等電点
照準法および親和性クロマトグラフ分析）［Cole, R.A.
等, Metabolism 27:289-301, 1978; Nathan,D.M. Clin.
Chem. 27:1261-1263, 1981; Moore, J.C.等, Ann.Cli
n. Biochem. 23:85-91,1986 ］。イオン交換クロマトグ
ラフィーにおいて、ヘモグロビンＡ1cを含めて多くのグ
リコヘモグロビン物質は中性ｐＨにてヘモグロビンＡｃ
よりも陽帯電が低く、陰帯電樹脂にあまり結合しない
［Rosenthal, P.K. 等, Am. J. Clin. Pathol. 75:45-4
9, 1981;米国特許第4,407,961 号、米国特許第4,649,12
2 号］。ヘモグロビンＡ1cをヘモグロビンＡ1a+bフラク
ションから分離する幾つかの方法が記載されている［Go
ldstein, D.E. 等, Diabetes 31:70-78, 1982; Maquar
t，F.X.等, Clin. Chim. Acta 108:329-332，1980; Jon
es, M.D．等, Hemoglobin 2:53-58, 1978; Clarke, J.
T.等，Diabete Metabol. 5:293-296, 1979; Davis, J.
E. 等, Diabetes 27:102-107, 1978; Cole, R.A. 等, M
etabolism 27:289-301, 1978;米国特許第4,389,491; Bi
o-Rad Laboratories,Hemoglobin A1c Micro Column Tes
t Instruction Manual, March 1990］。しかしながら、
これら方法にはいろいろの欠点を有する。これら方法の
多くは２種の緩衝液を用い、その第１緩衝液は特異結合
した物質を脱着させないように未結合物質をイオン交換
樹脂から溶出させる。異なるｐＨもしくはイオン強度で
用いられ或いは競合抑制剤を含有する第２緩衝液が、特
異結合した物質を溶出させるのに必要とされる。温度、
ｐＨ、イオン強度およびカラム寸法が試験結果に影響を
及ぼす［Simon, M. 等, Diabetes 29:467-474, 1980; S
chellekens, A.P.M.等, Clin. Chem. 27:94-99, 1981;
Castagnola, M.等, J. Chromatogr. 272:51-65, 198
3］。さらに、これら方法は幾つかの異なる工程および
数個の容器を必要とし、殆どの方法は自動化されず、或
いは半自動化されるに過ぎない。
【０００５】用いる方法に応じ、これら分析法の他の限
界は可逆性の中間グリコ型「プレ−ヘモグロビン−
Ａ1c」を含むことであり、これは分析を行う前に除去す
る必要がある［Goldstein, D.E. 等，Diabetes 31:70-7
8, 1982; Bunn, H.F. Diabetes 30:613-617,1981; Nath
an, D.M. Clin. Chem ．27:1261-1263, 1981; Mayer,
T.K. 等, Clin. Chim. Acta 127:147-184, 1983; Healt
h and Public Policy Committee, American College of
Physicians Ann. Intern Med. 101:710-713,1984;Nath
an, D.M. Clin. Chem. 27:1261-1263, 1981 ］。高レベ
ルの胎児ヘモグロビン、鎌状ヘモグロビンおよび他の希
な状態がこの分析を阻害しうる［Niejadlik,D.C. 等, J
AMA 224:1734-1736, 1973］。
【０００６】グリコヘモグロビンを測定する他の方法
は、グリコヘモグロビンと結合する特異的親和性もしく
は結合剤を使用する。次の特許、すなわち米国特許第4,
200,435号；第4,260,516号；第4,274,978号；第4,255,3
85号；および第4,438,204号において、グリコヘモグロ
ビンは親和性法またはヘモグロビンのアロステリック特
性を用いて測定される。ドイツ特許第159569号には、親
和性試薬として糖結合性蛋白が記載されている。
【０００７】他の親和性結合法は、グリコヘモグロビン
とボロン酸（boronic acid）誘導体との間の特異的な錯
体形成に基づいている［Middle等, Biochem. J. 209:77
1-779, 1983; Klenk等, Clin. Chem. 28:2088-2094, 19
82; Little等, Clin. Chem.32:358-360, 1986、米国特
許第4,269,605号；米国特許第4,861,728号；英国特許出
願第2 206 411A号；Isolab, Inc. Technical Publicati
on:GlycAffintm GHb,1986; Forrest,R.D.等, Clin. Che
m. 34:145-148, 1988］。親和性結合法はＨｂＡの他に
グリコヘモグロビン類も検出するが、これらはたとえば
イオン交換クロマトグラフィーのようなＨｂＡ1cに対し
一層特異的な方法に対し比例関係にある［Little等, Cl
in. Chem. 32:358-360, 1986］。グリコヘモグロビンに
関するイオン交換分析および比色分析と同様に、親和性
法も限界を有する。これら限界の１つは、２種の異なる
緩衝液を必要とすることである。第１緩衝液は、ｃｉｓ
−ジオール基を持たない非グリコフラクションを溶出さ
せる。グリコヘモグロビンが多い結合フラクションは、
たとえば糖アルコールのようなカラムからグリコヘモグ
ロビンを排除する置換剤を含有した第２緩衝液で溶出さ
れる。さらに流速およびカラムの寸法も、親和性試薬に
結合するヘモグロビンの量を制限する。
【０００８】標準曲線を作成し分析精度を決定するため
の、グリコヘモグロビン分析に用いるのに適した安定な
グリココシル化標準または較正手段もしくは対照につい
ては種々の意見がある［Goldstein, D.E. 等, Clin. Ch
em. 32,10B:B64-B70, 1986;Franzini, C.等, G. Ital.
Chim. Clin.9:187-192, 1984 ］。これら対照の中に
は、保存料を添加した赤血球の溶血物に過ぎないものも
ある［東独特許第150543号；米国特許第3519572号；英
国特許第934461号］。これら物質はしばしば凍結乾燥さ
れ、使用地の実験室で再編成されて数日間〜数週間にわ
たり使用される［Bio-Rad Laboratories, Hemoglobin A
1c Micro Column Test Instruction Manual, March 199
0 ］。このようにしたときの物質の安定性は充分に説明
されていない。シアノメテモグロビン；オキシヘモグロ
ビン−ポリヒドロキシ化合物；および一酸化炭素型のヘ
モグロビンを用いて、安定なヘモグロビン標準を形成す
るよう試みた人もいる［ドイツ特許第3311458号；ヨー
ロッパ特許第72440号；およびMosca, A. 等, J. Clin.
Chem. Clin. Biochem. 23:361-364, 1985］。現地で作
成される対照（一般に正常および糖尿病の試料から作成
した全血もしくは充填赤血球の溶血物）を用いることに
より、多くの実験室は分析精度を管理している［Goldst
ein, D.E. Diabetes 31:70-78, 1982; Cole, R.A. 等 M
etabolism 27:289-301, 1978; Simon, M. 等，Clin. Ch
em. 28:195-198, 1982; Parker，K.M.等,Clin. Chem. 2
7:669-672, 1981］。これらの対照は、安定性を保つよ
う精密に制御された条件下で貯蔵せねばならない［Wali
nder, O. Clin. Chem. 28:96-99 (1982)］。
【０００９】実施が容易であり、阻害を受けず、かつた
とえばｐＨおよび温度のような実験変動因子に対し比較
的敏感でないグリコヘモグロビン分析については、引き
続き要求がある。さらに、この種の分析に用いるための
安定な標準および対照、並びに標準の作成方法も期待さ
れている。
【００１０】発明の要点 本発明に関する技術は、検出すべき基質結合性物質と基
質非結合性物質とを含有する試料において、基質結合性
物質の比率もしくは濃度を検出すると共に定量する方法
に関するものである。より詳細には本発明は、検出すべ
き基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料
において、基質結合性物質の比率もしくは濃度を検出す
ると共に定量する迅速法に関するものである。
【００１１】本発明に関する技術によれば、基質結合性
物質と基質非結合性物質とを含有する試料の吸光度を測
定し、特異的結合剤もしくは親和性剤を付着させた固体
基質を添加する。結合反応における基本的成分は試料
と、結合剤を付着させた固体基質と、結合反応に適合性
の緩衝溶液とである。
【００１２】結合反応の後、試料の吸光度を適する検出
装置を用いて測定する。試料の量もしくは相対活性は、
固体基質により結合された結合性物質の量に逆相関す
る。
【００１３】したがって本発明に関する技術の一態様
は、基質結合性物質を含有すると思われる試料における
この基質結合性物質の存在および量を決定する方法に関
し、この方法は基質結合性物質と基質非結合性物質とを
含有する試料の初期吸光度を測定し、結合性物質に対し
特異的な結合剤を付着させた固体支持体に基質結合性物
質を結合させ、基質結合性物質が除去され或いは減少し
た試料の吸光度を測定し、次いで基質結合性物質の比率
を計算することを含む。
【００１４】本発明に関する技術の好適態様は、グリコ
ヘモグロビンと非グリコヘモグロビンとの両者を含有す
る試料において、グリコヘモグロビンの相対量を決定す
る方法に関する。グリコヘモグロビンを特異的に結合す
る結合剤もしくは親和剤を固体基質に付着させ、これを
混合すると共に粒子を試験溶液から分離するようにした
容器に仕込む。２回の吸光度測定を試験溶液につき行う
が、１回目は試薬／希釈剤と試験溶液との混合直後に行
い、さらに他方の吸光度測定はグリコヘモグロビンが固
体基質に実質的に結合した後に行う。分析の化学的原理
は、３−アミノフェニルボロン酸に対するｃｉｓ−ジオ
ール化合物の親和性結合に基づいている。全グリコヘモ
グロビンとヘモグロビンＡ1cとの間には直線的関係があ
るので、％ヘモグロビンＡ1cに相当する単位の基準化お
よび記録が可能となる。
【００１５】本発明は、グリコヘモグロビンの測定に用
いるための安定な液体グリコおよび非グリコヘモグロビ
ン溶液の製造方法に関するものである。
【００１６】さらに他の態様において本発明は、グリコ
ヘモグロビンの測定に用いるためのキットに関するもの
である。
【００１７】さらに他の態様において本発明に関する技
術は、糖尿病患者の診断および管理に際し有用なグリコ
ヘモグロビン比率の決定方法を提供する。
【００１８】図面の説明 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および多くの利点
は添付図面を参照する以下の詳細な説明から一層よく理
解されるであろう。
【００１９】図１は本発明に関する技術の好適実施例に
用いる試験パックの図解の平面図である。試験パックの
詳細については、多孔質フィルタを含むよう改変した米
国特許第4,883,763号に記載されている。図２は、アボ
ット・ビジョン（登録商標）分析器にて決定された牛ア
ジド−メト−ヘモグロビン検量手段を用いるグリコヘモ
グロビンの標準曲線である。図３はグルコース濃度の関
数としての牛ヘモグロビンのインビトログリコ化におけ
る経時的試験である。図４は４５℃にて２４時間のスト
レスにより示したシアノ硼水素化ナトリウムでの還元に
よるグリコ牛アジド−メト−ヘモグロビンの安定化を示
す。図５はグリコ化されかつ還元されたヘモグロビンと
グリコ化されずかつ還元されないヘモグロビンとの比較
安定性を示す。図６は−２０℃および２〜８℃で貯蔵し
たグリコ牛アジド−メト−ヘモグロビン検量物質の長期
安定性を示す。検量手段Ａ＝４．４〜５．０％グリコヘ
モグロビン（ＨｂＡ1c）；検定手段Ｂ＝１２．４〜１
４．０％ＨｂＡ1c；検定手段Ｃ＝２０．７〜２３．３％
ＨｂＡ1c。図７は本発明に関する技術による方法とＨＰ
ＬＣ−グリコＨｂ法との間の相関関係を示す。相関係数
（ＣＣ）＝０．９７９。図８は本発明に関する技術によ
る方法とイソラブＧｌｙｃ−Ａｆｆｉｎヘモグロビン分
析との間の相関関係を示す。相関係数（ＣＣ）＝０．９
９１。
【００２０】発明の詳細な説明 本発明に関する技術により解決された主たる問題は、２
回の吸光度測定が必要とされる方法の自動化であった。
１回目の測定は試料における結合性物質および非結合性
物質の合計濃度に比例するものであり、他方は結合反応
の後の結合もしくは遊離のいずれかのフラクションに比
例するものである。両測定を単一の試験溶液から単一の
試験容器内で行いたいという点に困難の原因がある。こ
れは、自蔵の試薬容器を用い、慣用のカラムクロマトグ
ラフ分離または緩衝液の変更なしに、好ましくは自動化
装置で行うことができる。
【００２１】本発明に関する技術の一態様は、試料にお
ける基質結合性物質と基質非結合性物質との全体に対す
る基質結合性物質の比を決定するための連続法（好まし
くは自動化法）を提供し、この方法は試料を固体基質と
混合し、基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有す
る試料の初期吸光度を測定し、基質結合性物質が除去さ
れた試料の吸光度を測定し、次いで基質結合性物質の比
を計算することからなっている。固体基質は、基質結合
性物質のための結合剤を付着させた粒子で構成すること
ができる。これら粒子は吸光度の測定に際し試料から分
離される。これは数種の手段によって行うことができ、
その１つは試料と粒子との混合物をこれら粒子を保持す
る多孔質フィルタに通すことである。
【００２２】基質結合性物質は、結合剤に対し親和性を
有する任意の分子とすることができる。この種の結合性
物質は炭水化物、蛋白質、核酸、脂質などを包含する。
結合性物質は動物、植物、細菌、酵母、原生動物、ウィ
ルス、組換産生させた物質などから誘導することもでき
る。試料から基質結合性物質を除去したとき、試料に測
定可能な変化が生じ、これをたとえば分光光度計、蛍光
度計などの装置によって検出することができる。好まし
くは、測定可能な変化は分光光度計を用いて測定される
ような試料の光学密度変化である。基質結合性物質が試
料から除去され或いは部分的に除去されたことを検出す
るには、増幅システムを必要とすることが容易に了解さ
れよう。この種の増幅システムは当業界にて公知であ
り、酵素：基質系などを包含する。
【００２３】本発明に関する技術の一態様は、グリコお
よび非グリコヘモグロビンを含有する試料におけるグリ
コヘモグロビンの比もしくは比率を決定する方法を提供
し、この方法はグリコおよび非グリコヘモグロビンを遊
離させるよう試料を処理し、次いで固体基質をグリコヘ
モグロビンと固体基質との間の錯体形成を行う条件下で
試料と接触させ、次いで試料の全ヘモグロビン含有量に
関連する初期吸光度を測定し、グリコヘモグロビンを固
体基質に結合させることによりこのグリコヘモグロビン
を試料から分離し、次いでグリコヘモグロビンが除去さ
れ或いはグリコヘモグロビンが著しく減少した試料の吸
光度を測定することからなっている。本発明に関する技
術の方法は、たとえばＲＮＡ、オリゴヌクレオチドのよ
うな他のｃｉｓ−ジオールを含有する物質、たとえば
Ｄ，Ｌ−ドーパ、エピネフリン、ノルエピネフリンなど
を包含するカテコールのような小生理分子、たとえばク
エン酸、乳酸などのα−ヒドロキシカルボン酸、および
たとえばアルブミンなどの他のグリコ蛋白質を検出する
ため用いることができる。必要な１，２−ｃｉｓ−ジオ
ール構造を持たない物質でも、しばしばポリオールで容
易に誘導でき、これを次いでジヒドロキシボリル成分に
結合できる。たとえば大抵のヌクレオチドおよび核酸
は、０．５ＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）にて２５
℃で２時間にわたり過剰のソルビトールおよび１−エチ
ル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド（ＥＤＣ）で処理して末端ホスフェートを介しソルビ
トールに結合させることができる［生化学分離における
ボロネートリガンド、パブリケーション５０１、アミコ
ン・コーポレーション社、１９８１］。通常はボロネー
トに結合しないデオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡ
を、ポリオール誘導化に関し３′もしくは５′末端ホス
フェートが利用できれば、緊密結合されることができ
る。誘導化したリガンドは、所望ならばホスホジエステ
ラーゼでの処理によりもとの形態に戻すこともできる。
ソルビトールの代わりにメチル−グルカミンを用いて、
化学切断しうる基を形成させることができる。或いは、
非ｃｉｓ−ジオール含有分子をジヒドロキシボリル成分
に結合させることもでき、これにはｃｉｓ−ジオール含
有分子を結合剤として用い、ただしｃｉｓ−ジオール含
有分子は非ｃｉｓ−ジオール含有分子に対し親和性を有
するものとする。この種のｃｉｓ−ジオールおよび非ｃ
ｉｓ−ジオール結合対の例は次のものを包含する：メチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシド：コンカナバリンＡ；Ｎ
ＡＤ（Ｐ）＋：グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ；ＡＴＰ：ヘキソキナーゼなど。
【００２４】グリコヘモグロビンを測定するための本発
明に関する技術は、グリコヘモグロビンを固体支持体か
ら溶出させることを必要としない迅速連続システムで前
記グリコヘモグロビンを測定する点において従来技術と
は相違する。また本発明に関する技術は分析に際し緩衝
液の交換を必要としない。好ましくは、システムは自動
化させる。
【００２５】さらに本発明は、グリコヘモグロビンを測
定する分析で検量手段および対照として使用するため
の、明瞭に規定された安定なグリコ標準およびこれら標
準の作成方法をも提供する。
【００２６】本発明に関する技術の原理は小アガロース
ビーズに固定化させた３−アミノフェニルボロン酸に対
するグリコヘモグロビンの親和性結合に基づいており、
５５３／６２８ｎｍにて二色吸光度を介して測定する。
全ヘモグロビン濃度に比例する初期吸光度測定を、試料
と試薬および希釈剤との混合の後に行う。グリコヘモグ
ロビン（たとえばＨｂＡ1c）の同一平面ｃｉｓ−ジオー
ル基と固定化３−アミノフェニルボロン酸との間の錯体
形成が、希釈試料をボロネートアガロースと反復混合す
る際に生ずる。この結果、グリコヘモグロビンが希釈試
料から除去される。［合計−グリコヘモグロビン］の濃
度に比例する最終吸光度測定により結合Ｈｂ％の計算が
可能となり、これを用意した検量曲線を用いて基準化Ｈ
ｂＡ1c％に変換する。
【００２７】第１工程として、試料（好ましくはグリコ
ヘモグロビンを含有すると思われる試料、特に好ましく
は全血試料）を得ねばならない。次の試料、すなわちヘ
パリンもしくはＥＤＴＡを用いて凝固防止した全血が好
適である。しかしながら、クエン酸ナトリウムおよび弗
化ナトリウム中に集めた試料も使用することができる。
血液試料におけるグリコヘモグロビンを測定するに先立
ち、赤血球を溶解させる必要がある。赤血球の溶解によ
り、グリコヘモグロビンと非グリコヘモグロビンとの両
者が細胞から放出される。一般的な陽イオン型（たとえ
ば臭化セチルトリメチルアンモニウム）；陰イオン型
（たとえばドデシル硫酸ナトリウムおよびデオキシコリ
ン酸ナトリウム）；並びに中性 （たとえばサポニンお
よびオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）活性
剤が、赤血球を溶解させるのに有用である。約０．０２
５〜０．５容量％の濃度範囲における中性活性剤が好適
である。機械的破壊、たとえば超音波処理および低張性
溶解も赤血球からヘモグロビンを遊離させるのに効果的
な方法である。
【００２８】試薬の長期貯蔵安定性を得るには、少量の
微生物防止剤を系に添加することが望ましく、これは溶
剤、抗生物質および毒を包含する。他の生化学物質（た
とえばグリコヘモグロビンの測定におけるＫＣＮ）を溶
血した血液試料に導入することもできる。
【００２９】次いで、試料をグリコヘモグロビンに対し
特異的な結合剤もしくは親和剤で処理して、グリコヘモ
グロビンを非グリコヘモグロビンから分離させる。１つ
の方法においては、グリコおよび非グリコヘモグロビン
を含有する溶血した赤血球の試料を、ジヒドロキシボリ
ル成分が結合された固体基質と接触させる。他の具体例
においては、固体支持体に、たとえばＨｂＡ1cに対し特
異的に結合する抗体またはＨｂＡ1cに特異的に結合する
レクチンのような異なる結合剤もしくは親和剤を結合さ
せる。
【００３０】固定支持体はビーズ、樹脂などの形態とす
ることができる。特に好適な具体例においては、固体支
持体を個々の粒子または微粒子の形態とする。これら粒
子は天然もしくは合成ポリマー物質で構成することがで
き、所望に応じこれらを架橋させてもさせなくても良
く、或いは化学的に改変することもできる。好ましくは
ポリマーはたとえばポリアクリルアミドのように親水性
であり、或いはたとえば登録商標ウルトラゲルとして販
売されるようなアガロースポリアクリルアミド共重合体
またはアガロース或いはたとえばセルロース、セルロー
ス誘導体、澱粉、デキストランおよび架橋デキストラン
のような遊離ヒドロキシル基を有するポリマー、たとえ
ば登録商標セファデックス、セファロースおよびセファ
クリルとして販売されるものである。粒子の直径は広範
囲に変化しうるが、４０〜２００μｍの粒子が好適であ
る。
【００３１】この性質を有する粒子は結合剤もしくは親
和剤を付着させるための固定基質として役立ち、容器内
で容易に使用することができる。容器は、グリコヘモグ
ロビンと固定支持体との間の結合を生ぜしめると共に吸
光度を測定するものである。好適容器は、粒子を試験溶
液と混合しうると共に粒子を吸光度測定に際し溶液から
分離しうる容器である。最も好適な容器は、米国特許第
4,883,763号（参考のためここに引用する）に記載され
たような固相分析装置もしくは試料処理カードの改良型
である。混合リブ領域における円筒穴部は多孔質フィル
タ挿入物を収容する。フィルタ挿入物はアガロース粒子
がキュベット内に侵入するのを防ぐと共に、希釈試料が
流過するアガロース充填ベットの形成を可能にする。試
薬および希釈剤を二重（ピール）カップに精密に充填す
る。希釈比は約１：６０である。希釈比は、この分析が
質量／容積濃度を測定するものでないため重要でない。
【００３２】この固相分析装置を用い、装置内に入れた
粒子にグリコヘモグロビン用の特異的結合剤を固定化さ
せる。粒子が保持されかつ固定化される。試料を固体基
質と混合し、グリコヘモグロビンを捕獲すると共に粒子
上の試薬によって粒子上へ保持する。非グリコヘモグロ
ビンは試薬により結合されず、したがって溶液中に遊離
状態で留まる。
【００３３】グリコヘモグロビンに特異的な結合剤は、
米国特許第4,269,605号（参考のためここに引用する）
に記載されたようなジヒドロキシボリル成分で構成する
ことができる。この成分は好ましくはフェニルもしくは
置換フェニルボロン酸、硼酸または他のボロン酸、たと
えばエタンボロン酸および１−プロパンボロン酸などで
ある。結合剤は機械的、物理的もしくは化学的手段によ
り固体基質に結合させることができる。好ましくは、リ
ガンドを直接共有結合によりマトリックスに結合させ
る。結合剤は、その後の反応に際し脱着してボロン酸ヒ
ドロキシルに遊離しないように、基質に結合させるべき
である。好適方法において、親和性樹脂は、ｍ−アミノ
フェニルボロン酸を１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）用いて活性
化されたカルボキシメチル−アガロースビーズ（ＣＭ−
セファロース（登録商標）、ファルマシア社）と反応さ
せて作成される。反応条件は、グリコヘモグロビン（Ｇ
Ｈｂ）の特異的結合を最大化させると共に非グリコヘモ
グロビンの非特異的結合を最少化させるべく、適切な置
換度を有する生成物を生ずるよう選択される。選択した
ジヒドロキシボリル成分とは無関係に、グリコヘモグロ
ビンの糖部分は所望の分離を達成するようジヒドロキシ
ボリル成分に結合しうることが必要である。
【００３４】代案として特異的結合剤は、被覆され、固
定化され或いは粒子に共有結合される抗体で構成するこ
ともできる。免疫化および回収工程により抗血清を得る
方法は一般に当業界で知られている。抗体はモノクロー
ナル抗体とすることもでき、その手順も当業界で知られ
ている。ＨｂＡ1cに対するモノクローナル抗体の例はノ
ーレス等に係る米国特許第4,727,036号に記載されてい
る。
【００３５】被覆し、固定化し或いは粒子に対し共有結
合しうる他の特異的結合剤は、糖成分に対し特異的な試
薬を包含する。これらはコンカナバリンＡ、スクシニル
−コンＡおよびビシア・ファバなどを包含するα−Ｄ−
グルコースに対し特異性を有するレクチン類を包含す
る。他のレクチンおよびその炭水化物特異性も周知され
ており、遊離レクチンまたは固体支持体に結合したレク
チン、たとえばセファロース（登録商標）−レクチンと
して入手できる。他の炭水化物特異性支持体はアルミナ
ゲル、燐酸カルシウムゲル、炭酸マグネシウム、珪酸マ
グネシウム、シリカゲルを包含する。
【００３６】試料におけるグリコおよび非グリコヘモグ
ロビンは、溶液の光学密度（吸光度）を測定する装置、
好ましくは３４０〜６３３ｎｍの波長範囲における吸光
度を測定しうる分光光度計を用いて分析的に検出および
定量される。好適具体例の装置は、ヨーロッパ特許第0
160 901 B1号（参考のため、その開示をここに引用す
る）に記載された自動化アボット・ビジョン（登録商
標）アナライザである。
【００３７】自動化分析装置は、二次元遠心分離の原理
を用いて血漿を細胞から分離すると共に試験パック内で
流体を測定しかつ混合する。試験の開始に際し、回転板
により発生した遠心力（１８００ｒｐｍの回転板速度）
により試験パック内の各試薬を１個もしくはそれ以上の
試薬測定用もしくは保持用チャンバに移動させる。同時
に、試料を毛細管もしくは試料穴部から血液分離室まで
移動させる。凝固防止されかつ溶血された全血試料の場
合、遠心力により溶解した赤血球ストロマを沈降させ
て、ヘモグロビン含有試料をチャンバの上部に残す。次
いで試験パックホルダーによる一連の回転が生ずると共
に、回転板が回転し続ける。
【００３８】試験パックホルダーは試験パックを反時計
方向に９０°回転させて、緩衝試薬および希釈剤緩衝液
を反応室中へ注入させると共に試料の１部を図１に示し
たように試料保持室に注入させる。次いで試験パックホ
ルダーは時計方向に９０°回転して、試薬および希釈剤
の液体成分をキュベット中へ移動させると共に試料を測
定室に移動させる。次いで試験パックホルダーは反時計
方向に９０°回転して、測定された試料を反応室中へ移
動させ、ここで固体試薬ならびにキュベットから流出す
る試薬および希釈剤の液体成分と混合する。試験パック
ホルダーの時計方向における最後の９０°回転は希釈試
料をキュベットに移動させ、ここで光学系が初期測定お
よび試料と試薬との複数回の回転後における最終測定に
つき５５３〜６２８ｎｍにて光学密度を測定する。アボ
ット・ビジョン（登録商標）・アナライザの詳細につい
てはアボット・ビジョン（登録商標）・アナライザ・マ
ニュアル、第１３．７頁に記載されている。同様な仕様
を有する他の自動化分析装置も上記方法に使用すること
ができる。
【００３９】緩衝剤 ｐＨは、ボレート成分の親和性カラムに対するｃｉｓ−
ジオール化合物の結合に影響を及ぼすことが知られてい
る。緩衝液のｐＨが高い（９．６より大）とヘモグロビ
ンの結合および安定性が低下するのに対し、低ｐＨ値で
は非特異性結合が増大する。非特異性結合は、陰帯電し
たボロネート成分およびフェニル環により導入された疎
水性成分に関連するイオン効果を包含する。分析に使用
する緩衝剤を考慮する際、たとえばトリス［トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン］のような複数ヒドロキ
シル基を有する緩衝剤はボロネート成分に結合するため
避けるべきである。ソルビトール、セリン、エタノール
アミンおよび硼酸も避けるべきである。生成されるボレ
ート−ジオール錯体を強化するよう作用する緩衝剤が好
ましい。この試験システムに適する緩衝剤は約７．５〜
１１．０の範囲のｐＫａを有する緩衝剤である。この範
囲の緩衝剤は当業界にて公知である。分析に際し３７℃
にて約７．８〜９．６のｐＨ範囲、より好ましくは約
８．５〜９．２、特に好ましくは９〜９．２の範囲にｐ
Ｈを維持するには、約８．５〜９．２のｐＫａを有する
緩衝剤がより好適である。アミンは錯体を強化するよう
作用し、したがってたとえばグリシン、モルホリン、Ｈ
ＥＰＥＳのような緩衝剤またはたとえばアンモニウム塩
もしくはピペリジンのような添加剤が結合を促進するの
に有利である。好適具体例においてｐＨを維持するよう
使用される緩衝剤は、２−アミノエチルスルホン酸（タ
ウリン）であって、２０〜５０ｍＭ（好ましくは２５ｍ
Ｍ）の濃度にて９．０６のｐＫａを有する。
【００４０】Middle, F.A.等, Biochem. J. 209:771-77
9 (1983)および「生化学分離におけるボロネートリガン
ド、出版物５０１、アミコン・コーポレーション社（１
９８１）」は、二価陽イオン、主としてＭｇＣｌ２から
誘導されたＭｇ2+を用いて、陰帯電した固定化ボロネー
トと陰帯電したリガンドとの間の斥力を解消することを
記載している。本発明に関する技術もこの目的でＭｇ2+
を使用する。しかしながら、本発明に関する技術は好ま
しくはＭｇＣｌ２の代りにＭｇＳＯ４を用いて、発明を
最適に操作しうる。ＭｇＳＯ４の好適濃度は約１０〜５
００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ、特に好ま
しくは約１００〜１５０ｍＭである。ヘモグロビンは３
７℃および高められたｐＨではあまり安定でない。塩化
物の存在下で分析を実施すれば、ボロネートアガロース
の不存在下で約８％の吸光度低下が生ずる。これは、試
験パックのプラスチック表面に対する沈殿と吸着との組
合せに起因する。吸光度の８％低下という値は、溶液か
らのヘモグロビンの非特異的損失がない正常なグリコヘ
モグロビンレベルを有する試料につき予想される信号の
約２倍にもなる。換言すれば、バックグラウンドが信号
の大きさの約２倍である。ＭｇＣｌ２の代りにＭｇＳＯ
４を使用すれば、この損失は約３％まで減少することが
判明した。
【００４１】ゼラチン（魚鱗）およびポリビニルピロリ
ドン（ＰＶＰ）を緩衝剤に混入すると、さらにヘモグロ
ビンが安定化された。
【００４２】ＭｇＳＯ４と組合せて、これは損失を約１
％まで減少させる。この実験からのデータを第１表に示
す。たとえばカゼイン、他の原料からのゼラチン、アル
ブミンなどの他の蛋白質安定剤および水溶性ポリマーも
同様な結果を与えると予想することができる。
【００４３】
【表１】
【００４４】分析 分析の目的で、既知量の固体基質（１０〜２００μｌの
範囲、典型的には６５μｌ）を乾燥錠剤もしくは湿潤懸
濁物のいずれかとして適量の緩衝溶液と共に供給する。
緩衝溶液は、反応のｐＨを血液試料の添加に際し約８．
５〜９．２の範囲の一定値に維持するのに適したｐＫａ
を有する２０〜５０ｍＭの化合物を含有する。約１０〜
５００ｍＭ、より好ましくは約５０〜２００ｍＭ、特に
好ましくは約１００〜１５０ｍＭの一定濃度で緩衝剤に
Ｍｇ++塩を添加して、固体基質におけるＧＨｂとボロネ
ートとの間の静電反発力を解消する。ヘモグロビン沈殿
を防止する蛋白質安定剤および抗微生物保存料も緩衝剤
に含ませることができる。分析温度は約２４〜３９℃、
より好ましくは約３０〜３７℃の範囲であり、約３７℃
の温度が最も好適である。
【００４５】血液試料を先ず最初にヘパリンで処理し
て、凝血を防止すると共にサポニンで処理して赤血球を
溶解させる。次いで、試料を遠心分離すると共に試料の
１部を樹脂および緩衝剤とざっと混合する。希釈した試
料を樹脂から分離し、希釈試料の初期吸光度を得る。次
いで、希釈試料を激しく樹脂と、グリコヘモグロビンが
ほとんど固体基質に結合するまで混合する。樹脂を取出
し、最終吸光度の測定を行う。吸光度データを処理し
て、結合したヘモグロビンの相対量もしくは比率を計算
する。グリコヘモグロビンの比率は、結合ヘモグロビン
対グリコヘモグロビン％の標準曲線から決定される。標
準曲線は、既知比率のグリコヘモグロビンの検量試料を
用いて同じ手順により作成される。既知％のグリコヘモ
グロビンの対照を用いて、標準曲線の正確性を定期的に
試験し或いは確認する。
【００４６】グリコヘモグロビンのデータ整理 標準曲線を作成すると共に、この曲線から未知試料を測
定するには、分析器によって次の工程を行う。全ヘモグ
ロビン濃度に比例する初期吸光度測定値（Ａｉ）と（合
計−非結合）ヘモグロビンに比例する最終吸光度測定値
（Ａｆ）とを測定して記憶する。結合ヘモグロビン％
（％Ｂ）の測定値を次式： ％Ｂ＝１００×（Ａｉ−Ａｆ）／Ａｉ を用いて計算する。この結合％を次の２つの作用につき
補正せねばならない：１．或る程度の結合が初期測定の
前に生ずる。２．平衡に達する前に最終測定を行う。そ
の結果、測定した結合％は全ヘモグロビン濃度により影
響を受ける。測定結合％はヘモグロビン濃度の減少と共
に増大する。したがって補正結合％（％Ｄ）は、一対の
定数（ＥおよびＩ）と初期吸光度測定値（Ａｉ）とを用
い、測定結合％を調整して得られる： ％Ｄ＝％Ｂ−Ｅ×（Ａｉ−Ｉ） ここで、Ｉは約１３ｇ／ｄｌの濃度における「正常」ヘ
モグロビンの試料につき得られる初期吸光度測定値に等
しい。このパラメータは実際の測定波長、試験パックに
おける希釈度、および試験パックにおけるキュベットの
路長に依存する。Ｉに関する２つの異なる数値の一方
を、試料が検量手段／対照であるか或いは患者の試料で
あるかに応じて選択する。希釈度および路長は試験パッ
クの製造に際し調節される。実際の測定波長は装置毎に
若干変化する。したがって、Ｉに関する独特の対を各装
置に用いる。Ｅは、結合％をヘモグロビン濃度の関数と
して決定すると共にグリコ化％を一定に維持して実験的
に求めた恒数である。Ｅに関する２つの異なる数値の一
方は、試料が検量手段／対照であるか或いは患者の試料
であるかに応じて選択される。
【００４７】直線的標準曲線は、％ＨｂＡ1cの所定の数
値を用いて検量手段につき％Ｄと％ＨｂＡ1cとの回帰分
析から計算される： ％ＨｂＡ1c＝（ｍ×％Ｄ）＋Ｂ ［式中、ｍは傾斜であり、ＢはＹ軸切片である］。
【００４８】例：標準曲線： ％ＨｂＡ1c＝（０．８７４１×％Ｄ）＋０．９９６ Ｅ＝7.7 ×10-4 Ｉ＝1500
【００４９】
【表２】
【００５０】標準曲線を図２にプロットする。このデー
タを用いた換算法によれば、大幅に変化するヘモグロビ
ン濃度の試料に対しても％ＨｂＡ1cの正確な測定を可能
にする。１つの有力な利点は、限定容積の試料（たとえ
ばネオナタール）を希釈してもまだ精密に分析しうる点
である。
【００５１】検量試料／対照 グリコヘモグロビン分析に使用するためのグリコヘモグ
ロビン検量試料および／または対照は、好ましくはヒト
もしくは動物の血液から作成された液体材料である。１
具体例において、グリコヘモグロビン材料は牛赤血球か
ら作成される。グリコヘモグロビン検量試料は好ましく
は低レベル、中レベルおよび高レベルのグリコアジド−
メト−ヘモグロビン（実施例３）を好ましくは還元型に
て約５〜９、より好ましくは６〜８のｐＨの緩衝溶液中
に含有する。検量試料に含有されるグリコヘモグロビン
材料のレベルは、全グリコヘモグロビン（ＴＧＨｂ）の
比率またはヘモグロビン（ＨｂＡ1c）の比率のいずれか
により示すことができ、これは試料中のヘモグロビンの
全量に対するグリコヘモグロビンもしくはヘモグロビン
Ａ1cの量である。低水準の検量試料は約０〜１０％ＴＧ
Ｈｂ即ち０〜８％ＨｂＡ1c、より好ましくは約２〜７％
ＴＧＨｂ即ち３〜６％ＨｂＡ1c、特に好ましくは４〜５
％ＴＧＨｂ即ちＨｂＡ1cの範囲である。中水準の検量試
料は約１０〜２７％ＴＧＨｂ即ち８〜１６％ＨｂＡ1c、
より好ましくは１３〜２１％ＴＧＨｂ即ち１０〜１５％
ＨｂＡ1c、特に好ましくは約１５〜１８％ＴＧＨｂ即ち
１１〜１３％ＨｂＡ1cの範囲とすることができる。高水
準の検量試料は約２２〜４４％ＴＧＨｂ即ち１６〜３０
％ＨｂＡ1c、より好ましくは２６〜３６％ＴＧＨｂ即ち
１８〜２５％ＨｂＡ1c、特に好ましくは約２７〜３０％
ＴＧＨｂ即ち１９〜２１％ＨｂＡ1cの範囲とすることが
できる。低、中および高水準の検量試料は、４５％ＴＧ
Ｈｂ即ち３０％ＨｂＡ1cよりも大きな、より好ましくは
約４５〜６０％ＴＧＨｂ即ち３０〜４０％ＨｂＡ1cのグ
リコ％範囲におけるグリコヘモグロビン材料の保存溶液
と、非グリコ還元ヘモグロビン溶液との混合物から処方
することができる。非グリコヘモグロビン溶液はごく少
量であればグリコ化物を含むことができる。
【００５２】検量試料および対照の安定性は、約８℃も
しくはそれ以下で貯蔵する際には約１０ケ月より大、よ
り好ましくは１０〜１４ケ月の範囲、特に好ましくは少
なくとも１４ケ月の安定性を有すべきである。
【００５３】対照は検量試料と同様に作成される。対照
レベルは、好ましくはグリコヘモグロビンの正常（４〜
６％ＨｂＡ1c）および高められた（８％ＨｂＡ1cより
大）生理的レベルを反映するように選択される。
【００５４】本発明の１具体例において、安定なヘモグ
ロビン溶液はアジド−メト−ヘモグロビンから作成され
る。アジド−メト−ヘモグロビンは、洗浄した赤血球か
ら低張性衝撃により放出された脂質フリーのヘモグロビ
ンから作成することができる。赤血球の原料はヒトまた
は動物（好ましくは哺乳動物）であり、より好ましくは
牛赤血球である。ヘモグロビンは、たとえばフェリシア
ン化カリウム、硝酸ナトリウムなどの酸化剤によりメト
−ヘモグロビンまで酸化される。次いでメト−ヘモグロ
ビンをアジド塩（たとえばナトリウムアジドなど）と接
触させアジド−メト−ヘモグロビンまで変換する。
【００５５】赤血球におけるヘモグロビンは、非酵素過
程によりグルコースの存在下でグリコ化される。先ず最
初に、易可逆性反応がグルコースとヘモグロビンβ鎖の
Ｎ−末端バリンとの間で生じて、不安定なアルジミン即
ちシッフ塩基を生成する。この迅速な平衡に続いて遅い
アマドリ転位が生じ、ヘモグロビンＡ1cの安定なケトア
ミン結合を形成する。ヘモグロビンＡ1cの測定は長期糖
尿病管理の有用な指標である。
【００５６】本発明の具体例において、安定なグリコヘ
モグロビン溶液はアジド−メト−ヘモグロビンから作成
される。非酵素的ヘモグロビン反応を、安定な液体グリ
コヘモグロビン検量試料および対照材料のインビトロ合
成につき用いた。ヒトもしくは牛赤血球からのアジド−
メト−ヘモグロビンを好ましくは３７℃にて数日間にわ
たり種々の濃度のグルコースと共に培養した。グルコー
ス分子はアミン基と、シッフ塩基物質をヘモグロビン上
で形成する。未反応グルコースを除去した後、不安定な
シッフ塩基物質を緩和な還元剤（たとえばシアノ硼水素
化ナトリウム）での還元、たとえばパラジウムなどの触
媒の存在下における接触水素化、硼水素化ナトリウムな
どでの還元によって安定化させた。還元の完結は、高め
られた温度（たとえば約４５℃）にて還元グリコアジド
−メト−ヘモグロビンを熱処理（heat-stressing）して
試験することができる。還元副生物をゲル濾過もしくは
透析によって除去した。
【００５７】グリコヘモグロビンを生成させるべくアジ
ド−メト−ヘモグロビンに添加するグルコースの濃度は
約５０〜１０００ｍＭ、好ましくは約１００〜５００ｍ
Ｍ、特に好ましくは約１５０〜３００ｍＭの範囲であ
る。グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンと共に約
１〜１０日間にわたり或いは所望のグリコ化％に達する
まで培養する。
【００５８】さらに他の具体例においては、シアノ基を
アジドの基の代りに使用することができる。シアノ−メ
ト−ヘモグロビンおよび還元グリコシアノ−メト−ヘモ
グロビンも安定なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビ
ン溶液を形成する。アジド−メト−ヘモグロビンおよび
還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンの作成方法を用
いて、シアノ−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコシ
アノ−メト−ヘモグロビンを作成することができる。た
とえばシアン化ナトリウムのようなシアン化物が、この
作成方法でアジド塩の代りに使用される。
【００５９】さらに他の具体例においてはカルボニル基
をアジド基の代りに使用することもできる。カルボニル
−ヘモグロビンおよび還元グリコカルボニル−ヘモグロ
ビンも安定なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビン溶
液を形成する。カルボニル−ヘモグロビンの作成方法
は、一酸化炭素ガスをオキシ−ヘモグロビン溶液中にグ
リコ化の前に吹込むことを含む。この場合、フェリシア
ン化カリウムまたは他の酸化剤は必要とされない。何故
なら、オキシ−ヘモグロビンはカルボニルヘモグロビン
成形のための好適先駆体になるからである。一酸化炭素
の吹込み過程に際し発泡を最小化するには消泡剤が必要
とされる。得られるカルボニル−ヘモグロビン物質は、
アジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト−ヘ
モグロビンと同様にグリコ化されて処理される。
【００６０】キット さらに本発明は、試料（好ましくはグリコおよび非グリ
コヘモグロビンを含有する血液試料）のグリコヘモグロ
ビン含有量を分析する際に使用するための試験キットを
も包含する。この試験キットは次の各成分を含む：
（１）約６〜８（好ましくは７．７）のｐＨを有し、グ
リコヘモグロビンのための結合剤（好ましくはジヒドロ
キシボリル成分、より好ましくは３−アミノフェニルボ
ロン酸を付着させた粒子の懸濁物とＭｇ2+源とを含有す
る緩衝試薬溶液、および（２）反応混合物のｐＨを３７
℃にて約７．８〜９．６、より好ましくは８．５〜９．
５、特に好ましくは９〜９．２の範囲に維持しうると共
に、緩衝剤が約７．５〜１１、好ましくは８．５〜９．
２のｐＫａを有する希釈剤緩衝溶液。試験に用いる粒子
材料および結合剤に応じ、試験キット成分は別々に或い
は組合せて供給することができ、或いは予備混合して単
一溶液混合物として供給することもできる。
【００６１】他の具体例において、親和性粒子は抗−グ
リコヘモグロビン抗体またはレクチンを結合剤として付
着させる。
【００６２】より好ましくは、緩衝試薬溶液はジヒドロ
キシボリル誘導粒子と約１０〜５００ｍＭのＭｇＳ
Ｏ４、特に好ましくは約１００〜１５０ｍＭのＭｇＳＯ
４を含有する。緩衝試薬溶液はさらに抗微生物剤および
／または保存料、たとえばゲンタマイシン、ナトリウム
アジドなどをも含有することができる。
【００６３】特に好ましくは緩衝試薬溶液は、８．４ｍ
ＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）と１５０ｍＭのＭｇＳ
Ｏ４と０．４ｇ／リットルのゲンタマイシン硫酸塩と
０．０５％のナトリウムアジドとを含有する緩衝試薬溶
液（ｐＨ７．７）における、３−アミノフェニルボロン
酸誘導アガロースビーズ粒子の懸濁物を含有する。より
好ましくは希釈緩衝剤溶液はさらにたとえばゼラチン、
アルブミン、カゼインなど、好ましくは魚鱗ゼラチンの
ような蛋白質安定剤を約０．５〜５％、より好ましくは
１〜２％、特に好ましくは１．６５％の濃度で含有する
と共に、たとえばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｋ
値９０）のような水溶性ポリマーを約０．５〜５％、よ
り好ましくは１〜２％、特に好ましくは１．６５％の濃
度で含有し、さらにたとえばゲンタマイシンおよびナト
リウムアジドのような抗微生物剤および保存料をも含有
する。好ましくは、約６５μｌの沈降した水和ビーズを
含有する約１９０μｌの緩衝試薬溶液を、約４〜７μｌ
の試料につき用いる。
【００６４】緩衝試薬溶液および希釈剤緩衝溶液は別々
に、或いは２種の試薬として組合せ或いは単一の試薬と
して、より好ましくは２種の試薬として包装することが
できる。好適具体例において、緩衝試薬および希釈剤緩
衝液は、たとえば試験パックのような形式で供給され
る。好ましくは各試験パックは次のものを含有する：
８．４ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）と１５０ｍＭ
のＭｇＳＯ４と０．４ｇ／リットルのゲンタマイシン硫
酸塩と０．０５％のナトリウムアジドとを含有する緩衝
溶液（ｐＨ７．７）における、３−アミノフェニルボロ
ン酸誘導アガロースビーズ粒子（３．５ｍｇ、乾燥重
量）の懸濁物を含有する約１９０μｌの緩衝試薬。希釈
剤緩衝液は、次の濃度にて安定剤と抗微生物剤とを含有
する約１４０μｌの緩衝溶液（ｐＨ９．６）である：９
４．２ｍＭのタウリン（２−アミノエチルスルホン
酸）、１．６５％の魚鱗ゼラチン、１．６５％のポリビ
ニルピロリドン（Ｋ値９０）、０．４ｇ／リットルのゲ
ンタマイシン硫酸塩および０．０５％のナトリウムアジ
ド。
【００６５】ボロネート誘導アガロースは、最終分析条
件下で用いる際に、高ｐＨでは凝集する傾向を有する。
これは材料の取扱および分配を困難にする。この問題を
解決するには、試薬系を試験パック内の封止２−室装置
に設ける。１室は低ｐＨの緩衝液（緩衝試薬）における
ボロネート−アガロースを含有し、他室は希釈剤緩衝溶
液を含有する。２個の分室の内容物を分析を行う時点で
のみ合し、この時点でボロネートアガロースのｐＨを最
終分析ｐＨまで上昇させる。当業者は、各成分を個々に
或いは組合せて順次にまたは同時に試料へ添加しうるこ
とを認識するであろう。好適具体例において、緩衝試薬
溶液および希釈剤緩衝溶液は試料へ同時に添加される。
他の好適具体例においては、希釈剤を試料に添加した後
に緩衝試薬溶液を添加する。
【００６６】好ましくは、キットはさらに第３の分離し
た成分として、たとえば乾燥サポニンを含有する毛細管
のような試料用の溶解剤をも含む。
【００６７】検量試料および対照は、別々に包装して或
いはキット内にまとめて或いは試験キットで供給するこ
とができる。検量試料は、好ましくは約０〜８％、８〜
１６％および１６〜３０％ＨｂＡ1cの範囲内のグリコ化
レベルを有する還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン
を含有する。比較は、好ましくは正常および異常な患者
範囲におけるグリコ化レベルを持った還元グリコアジド
−メト−ヘモグロビンを含有する。
【００６８】
【実施例】実施例１ ボロネートアガロースの作成 アガロース、すなわちファルマシア社からのＣＭセファ
ロース（登録商標）ＣＬ６Ｂを蒸留水で洗浄した後、１
００ｍＭのＭＥＳ（２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン
酸）緩衝液（ｐＨ４．７）で洗浄した。アガロースを５
０％固形分まで懸濁させ、次いで減圧下に０℃まで冷却
した。６６ｍＭのｍＡＰＢＡ（３−アミノフェニルボロ
ン酸）を作成し、減圧下に０℃まで冷却し、次いでアガ
ロースに添加した。８００ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩）を作成し、反応混合物に添加した。この混合物を
減圧下に０℃にて１時間にわたり反応させ、次いで４Ｍ
の酢酸ナトリウムにより反応停止させた。ｍＡＰＢＡ誘
導化アガロースを順次に１００ｍＭ酢酸と５０ｍＭＮａ
ＯＨ／１Ｍ ＮａＣｌと１００ｍＭ酢酸と５０ｍＭＮａ
ＯＨ／１Ｍ ＮａＣｌと次いで蒸留水とで洗浄した。洗
浄したｍＡＰＢＡ誘導化アガロースを次いでＨＥＰＥＳ
緩衝液で洗浄し、約５５％固形分まで懸濁させた。最終
混合物のｐＨを検査し、必要に応じ７．７のｐＨに調整
した。検量操作を実施例２における方法にしたがい空試
験パックにおける上記粒子を用いて行い、検量曲線を作
成した。正確な検量曲線を得るため、粒子の固形物％を
希釈または粒子の添加によって調整することができる。
【００６９】実施例２ アボット・ビジョン試験パックおよびアボット・ビジョ
ン分析装置を用いるグリコＨｂ法 図１に示したようなビジョン試験パックを冷蔵庫から取
出す。試験パックを室温にて最小３０分間にわたり加温
させる。乾燥サポニンおよびヘパリンが充填されかつ試
料を含有する毛細管を試験パックの毛細管スロットに挿
入する。検量試料と対照とを、試験パックの検量試料お
よび対照穴部に直接に滴下装置を用いて加える。試験パ
ックを分析装置に入れ、「操作」ボタンを押す。
【００７０】次いで分析器は次の工程を自動的に行う：
【００７１】
【表３】
【００７２】実施例３ 検量試料および対照材料作成 Ａ．アジド−メト−ヘモグロビン（牛）の作成 １．牛赤血球から血漿を２０ｍＭの等張燐酸塩緩衝塩水
で洗浄除去した。 ２．赤血球細胞を、０．０１Ｍの燐酸塩緩衝液を用い凍
結／解凍することにより低張性衝撃によって溶解させ
る。 ３．ヘモグロビンを１９．５ｇ／ｄｌ Ｈｂまで分子量
１０，０００のカットオフのフィルタによる限外濾過で
濃縮した。ｐＨを２Ｎ ＮａＯＨにより７．２〜７．８
に調整した。 ４．Ｈｂ溶液における脂質を４０ｇ／Ｌのエアロシル３
８０（バン・ウォータース社）により抽出した。この混
合物を４℃にて１〜１８時間攪拌した。混合物を４℃に
て４２００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離し、ヘモ
グロビンを回収して濾過した。ヘモグロビンを２０ｍＭ
の燐酸塩緩衝塩水に対し分子量１０，０００のフィルタ
を用いて透析濾過した。 ５．ヘモグロビンを１．３×モル過剰のフェリシアン化
カリウムを用いて２〜８℃で３０〜４０分間にわたりメ
ト−ヘモグロビンまで酸化させた。 ６．メト−ヘモグロビンを、３×モル過剰のナトリウム
アジドを添加して２〜８℃で１５〜３０分間にわたりア
ジド−メト−ヘモグロビンまで変換させた。 ７．この材料を分子量１０，０００のカットオフフィル
タにより透析濾過した。溶液のｐＨを７．３〜７．５に
調整し、抗微生物剤を添加した。 ８．濃度を約１９．５ｇ／ｄｌヘモグロビンに調整し
た。 ９．この材料を滅菌濾過し、２〜８℃にて貯蔵した。
【００７３】Ｂ．グリコヘモグロビン保存溶液の作成 １．無水グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンに添
加し、２〜８℃で３０分間混合して２５０ｍＭのグルコ
ース最終濃度を得た。 ２．この溶液を、３０〜４０％のグリコ化レベルに達す
るまで３７℃にて保温した。 ３．溶液を分子量１０，０００のフィルタにより２〜８
℃にて２０ｍＭ燐酸塩緩衝塩水に対し透析して、未反応
グルコース（≦５ｍｇ／ｄｌ）を除去した。 ４．グリコヘモグロビンを分子量１０，０００〜３０，
０００のカットオフフィルタを用いる透析濾過により約
１９．５ｇ／ｄｌまで濃縮した。 ５．ヘモグロビン／グルコースアダクトを、１０×モル
過剰のシアノ硼水素化ナトリウムを２〜８℃で添加する
還元によって安定化させた。 ６．還元の完結を、４５℃にて材料を熱処理することに
より試験した。必要に応じ、工程５を反復した。 ７．ヘモグロビンを燐酸塩緩衝液で透析した。 ８．ヘモグロビン濃度を１９．５ｇ／ｄｌに調整した。 ９．ｐＨを７．４に調整し、溶液を滅菌濾過すると共に
２〜８℃で貯蔵した。
【００７４】Ｃ．非グリコヘモグロビン保存溶液の作成 この溶液は、グルコースを添加しない以外はグリコヘモ
グロビン保存溶液と同様に作成した。
【００７５】Ｄ．グリコおよび非グリコ保存溶液の混合
物を作成することにより最終的な検量試料および対照溶
液を作成した。
【００７６】実施例４ ヘモグロビンをグリコ化する方法の最適化 非酵素的ヘモグロビン反応を用いて、液状の安定グリコ
ヘモグロビン検量試料もしくは対照のインビトロ合成に
関する方法を開発した。実施例３における方法にしたが
い牛赤血球から作成した新鮮または凍結のアジド−メト
−ヘモグロビンを３７℃にて種々の時間にわたり２５０
ｍＭのグルコース（１００ｍｌの１９．５ｇ／ｄｌ ア
ジド−メト−ヘモグロビンに対し、４．５３ｇのグルコ
ース）と共に培養した。未反応グルコースをゲル濾過に
よって除去し、グリコアジド−メト−ヘモグロビンを過
剰のシアノ硼水素化ナトリウムで還元した。還元の副生
物を２０ｍＭ燐酸塩緩衝塩水に対する透析によって除去
し、全グリコヘモグロビン％をＩｓｏ−ｌａｂ Ｇｌｙ
ｃ−Ａｆｆｉｎ親和性カラム法によって分析した。結果
を第３表に示す。
【００７７】
【表４】
【００７８】
【表５】
【００７９】ヒトヘモグロビンを同様にグリコ化し、結
果を第４表に示す。凍結貯蔵したヒトヘモグロビンを用
い、６３％の最大全グリコ化％が約１４４時間後に観察
され、その時点でヒトヘモグロビンは凝集し始めた（第
４表）。
【００８０】全グリコ化％に対するグルコース濃度と牛
ヘモグロビンとの経時比較は、グリコ化法における２つ
の重要な因子を示した（図３）。第１に最大グリコ化％
はグルコース濃度の増加と共に増大し、第２にグリコ化
％の速度はより高いグルコース濃度にて加速された。両
因子はグリコ化過程を最適化するのに貢献する。
【００８１】２４時間にわたる４５℃での熱処理がシア
ノ硼水素化ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）の効果を示す
有効な指標であることを証明するため、高レベルの検量
試料を４５℃にて種々の濃度のＮａＣＮＢＨ３と共に保
温した。種々の量のＮａＣＮＢＨ３を検量試料における
ヘム濃度に基づき高レベルの検量試料に添加して、第５
表に示す最終濃度を得た。各溶液を２つの部分に分割
し、一方を４５℃にて２４時間保温し、他方を２〜８℃
で貯蔵した。この実験からのデータを第５表および図４
に示す。この実験は、適量で存在する場合のグリコヘモ
グロビンの安定化に関するＮａＣＮＢＨ３還元の効果お
よびＮａＣＮＢＨ３還元のためのモニターもしくは対照
として使用する４５℃熱処理の効果を示す。
【００８２】
【表６】
【００８３】グリコ牛アジド−メト−ヘモグロビンのシ
アノ硼水素化ナ トリウム還元が非グリコ非還元アジド
−メト−ヘモグロビンの安定性と比較してヘモグロビン
（Ｈｂ）の安定性を増大させることを証明するため、グ
リコ化された還元試料につき約１７．５ｇ／ｄｌ Ｈｂ
および非グリコ非還元試料につき１８．１ｇ／ｄｌの濃
度における各１部を４５℃にて保温し、同じ濃度の対照
を２〜８℃にて貯蔵した。それぞれの試料を所定の時間
間隔で３４日間にわたり定期的に採取し、ヘモグロビン
濃度を測定した。第６表および図５における結果は、グ
リコ化された還元牛アジド−メト−ヘモグロビンが非グ
リコ非還元型よりも安定であることを示す。
【００８４】還元型のグリコ牛アジド−メト−ヘモグロ
ビン検量手段の長期間安定性を−２０℃および２〜８℃
での保温によって測定した。各標準の１部を全部で３０
９日間にわたりＨｂＡ1c％につき毎日試験した。第７表
および図６における結果は、検量手段が−２０℃もしく
は２〜８℃のいずれかにおける長時間の貯蔵につき安定
であることを示す。悪作用は認められなかった。
【００８５】
【表７】
【００８６】
【表８】
【００８７】実施例５ 予想値 本発明の方法を用い、グリコヘモグロビン基準範囲は
４．１〜５．７標準化％ＨｂＡ1cであることが決定され
た。この範囲は１０１名の明かに健康な個人（女性４１
名、男性６０名）を試験して確認された。基準範囲は特
定の患者集団に応じて変化することがある。
【００８８】実施例６ 再現性 本発明に関する技術による方法の再現性を、１つの分析
装置を用いて５日間にわたり４反復で２レベルのグリコ
ヘモグロビン比較をフィールド試験することにより決定
した。総平均および変動係数（％ＣＶ）を変動分析から
計算した。全％ＣＶは日内変化及び日間変化に基づくも
のの合計である。
【００８９】
【表９】
【００９０】実施例７ 精度 ％グリコＨｂ試験を決定するための本発明に関する技術
方法の精度を、この試験とＨＰＬＣグリコヘモグロビン
分析またはＩｓｏｌａｂ Ｇｌｙｃ Ａｆｆｉｎ分析
（親和性による全グリコヘモグロビン）との比較により
ヒト全血液試料のフィールド試験にて決定した。％グリ
コヘモグロビンを測定するための本発明による方法とグ
リコヘモグロビンのＨＰＬＣ法との間の相関試験を行っ
た。
【００９１】グリコヘモグロビンを測定する本発明に関
する技術の方法を病院環境で行い、４．５〜１３．３％
のグリコヘモグロビン値の範囲にわたる５１人のヒト全
血試料を用いて病院で行った。それらの結果を、ＨＰＬ
Ｃグリコヘモグロビン法を用いて得られた結果と相関さ
せた。
【００９２】全試料を現場にて単一試料で分析した。ビ
ジョン・グリコＨｂシステムとＨＰＬＣグリコヘモグロ
ビンシステムとの相関関係を図７に示す。直線回帰分析
は次の結果を与えた： 比較：ビジョン・グリコＨｂ（Ｙ軸）対ＨＰＬＣグリコ
ヘモグロビン（Ｘ軸） 試料数＝５１ 傾斜＝０．９８ 切片＝０．３３ 相関係数＝０．９８３ 偏り＝０．２ Ｓｄ線＝０．４ Ｓｄ差＝０．４ ｔ＝０．４０ 統計的または臨床的な有意差は観察されなかった。
【００９３】グリコヘモグロビン対Ｉｓｏｌａｂ Ｇｌ
ｙｃＡｆｆｉｎ試験につき本発明の方法を用いて、次の
相関関係が観察された： Ｎ＝５１ 傾斜＝０．６５２ 切片＝１．４０ 相関係数＝０．９９１ 偏り＝−１．６ Ｓｄ線＝０．３ Ｓｄ差＝１．３ 対ｔ＝−８．９７ 非対ｔ＝−２．６９ これらデータを図８にプロットする。
【００９４】実施例８ 妨害 下記の一般的に処方した薬剤を本発明の方法に対する妨
害につき、添加物質を含有する全血試料を試験して検査
した。所定濃度における次の物質は、特定レベルのＨｂ
Ａ1cを含有する試料に対し１０％未満の妨害を示した： 試験物質 濃 度 %HbA 1c 内生物質 ビリルビン 30mg／dl 4.7 グルコース 800mg／dl 4.5 トリグリセリド 1300mg／dl 4.8 タイプＩＩ糖尿病につき処方した薬剤 クロルプロパミド 75mg／dl 5.5 グリピジド 50mg／dl 5.5 グリブリド 50mg／dl 5.5 トルブタミド 100mg／dl 5.8
【００９５】次の物質は、示した試料濃度にて本発明に
関する技術の方法を有意には妨害しなかった。有意の妨
害とは、正常範囲の試料につき試験結果にて１０％より
大きい差をもたらすものとして規定される。
【００９６】 一般的処方薬剤 試験した濃度 アセトアミノフェン（タイレノール） 30mg／dl アセチルサリチル酸（アスピリン） 50ml／dl アスコルビン酸（ビタミンＣ） 10mg／dl カフェイン 6mg／dl セホキシチン 2.5mg／dl シメチジン（タガメット） 7.5mg／dl Ｌ−ドーパ 10mg／dl エピネフリン（アドレナリン） 0.1mg／dl ハイドロクロルチアジド 5mg／dl イソニアジド 2.5mg／dl ペニシリンＧ 1000単位／dl フェニトイン（ジランチン） 8mg／dl サリチル酸 40mg／dl テオフィリン 8mg／dl ワルファリン（クマジン） 10mg／dl
【００９７】実施例９ ヘモグロビン変種（異常ヘモグロビン） グリコヘモグロビンの親和性結合法は、ヘモグロビン変
種による最小の妨害を示す［Middle, F.A.等, Biochem.
J. 209:771-779, 1983; Abraham, E.C.等, J.Lab. Cli
n. Med. 102:187-197, 1983; Talwar, D.等, Clin. Che
m. Acta 128:61-67, 1983; Yatscoff, R.W.等, Clin. C
hem. 29:543-545, 1983］。ヘモグロビンＦ（胎児）、
ＳおよびＣは、本発明に関する技術に記載した試験を妨
害しないことが判明した。同様に、他の変種も妨害しな
いと思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に関する技術の好適実施例に用いる試験
パックの図解の平面図である。試験パックの詳細につい
ては、多孔質フィルタを含むよう改変した米国特許第4,
883,763号に記載されている。
【図２】アボット・ビジョン（登録商標）分析器にて本
発明に関する技術の方法により決定された牛アジド−メ
ト−ヘモグロビン検量手段を用いるグリコヘモグロビン
の標準曲線である。
【図３】グルコース濃度の関数としての牛ヘモグロビン
のインビトログリコ化における経時的試験である。
【図４】４５℃にて２４時間のストレスにより示したシ
アノ硼水素化ナトリウムでの還元によるグリコ牛アジド
−メト−ヘモグロビンの安定化を示す。
【図５】グリコ化されかつ還元されたヘモグロビンとグ
リコ化されずかつ還元されないヘモグロビンとの比較安
定性を示す。
【図６】図６は−２０℃および２〜８℃で貯蔵したグリ
コ牛アジド−メト−ヘモグロビン検量物質の長期安定性
を示す。検量手段Ａ＝４．４〜５．０％グリコヘモグロ
ビン（ＨｂＡ1c）；検定手段Ｂ＝１２．４〜１４．０％
ＨｂＡ1c；検定手段Ｃ＝２０．７〜２３．３％Ｈｂ
Ａ1c。
【図７】本発明による方法とＨＰＬＣ−グリコＨｂ法と
の間の相関関係を示す。相関係数（ＣＣ）＝０．９７
９。
【図８】本発明に関する技術による方法とイソラブＧｌ
ｙｃ−Ａｆｆｉｎヘモグロビン分析との間の相関関係を
示す。相関係数（ＣＣ）＝０．９９１。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バーバラ・ジエイ・イングランド アメリカ合衆国、ウイスコンシン・ 53211、ミルウオーキー、イースト・ケ ンウツド・ブウルバード・1808 (72)発明者 メアリー・ジエイ・アニーノ アメリカ合衆国、イリノイ・60004、ア ーリントン・ハイツ、ノース・ハイラン ド・アベニユー・2616 (56)参考文献 特開 昭59−183370（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/72

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 グリコヘモグロビンの分析にて検量試料
    もしくは対照として有用である安定なグリコヘモグロビ
    ン溶液を作成するに際し： ａ．赤血球を洗浄し； ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ； ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し； ｄ．ヘモグロビンをメト−ヘモグロビンまで酸化し； ｅ．メト−ヘモグロビンをアジド−メト−ヘモグロビン
    まで変換し； ｆ．グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンに添加し
    てグリコアジド−メト−ヘモグロビンを生成させること
    を特徴とする安定なグリコヘモグロビン溶液の作成方
    法。
  2. 【請求項２】 赤血球が哺乳動物赤血球である請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】 メト−ヘモグロビンを、ナトリウムアジ
    ドを用いてアジド−メト−ヘモグロビンまで変換する請
    求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 グリコアジド−メト−ヘモグロビンを還
    元剤により還元することをさらに含む請求項１に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 還元の完結を、昇温熱処理試験により試
    験する請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 グリコヘモグロビンの分析にて検量試料
    もしくは対照として有用である安定なグリコヘモグロビ
    ン溶液を作成するに際し： ａ．赤血球を洗浄し； ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ； ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し； ｄ．ヘモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換
    し； ｅ．グルコースをカルボニル−ヘモグロビンに添加して
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを生成させることを特
    徴とする安定なグリコヘモグロビン溶液の作成方法。
  7. 【請求項７】 グリコカルボニル−ヘモグロビンを還元
    剤により還元することをさらに含む請求項６に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 グリコヘモグロビンの分析にて検量試料
    もしくは対照として有用である安定な非グリコヘモグロ
    ビン溶液を作成するに際し： ａ．赤血球を洗浄し； ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ； ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し； ｄ．オキシ−ヘモグロビンをカルボニル−ヘモグロビン
    まで変換し、またはヘモグロビンをメト−ヘモグロビン
    まで酸化し； ｅ．メト−ヘモグロビンをアジド−メト−ヘモグロビン
    まで変換することを特徴とする安定な非グリコヘモグロ
    ビン溶液の作成方法。
  9. 【請求項９】 グリコヘモグロビンの分析にて検量試料
    もしくは対照として有用である安定な非グリコヘモグロ
    ビン溶液を作成するに際し： ａ．赤血球を洗浄し； ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ； ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し； ｄ．ヘモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換
    することを特徴とする安定な非グリコヘモグロビン溶液
    の作成方法。
  10. 【請求項１０】 グリコアジド−メト−ヘモグロビンま
    たはグリコカルボニル−ヘモグロビンからなることを特
    徴とするグリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしく
    は対照として有用である安定なグリコヘモグロビン溶
    液。
  11. 【請求項１１】 還元グリコアジド−メト−ヘモグロビ
    ンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンからなる
    ことを特徴とするグリコヘモグロビンの分析にて検量試
    料もしくは対照として有用である安定なグリコヘモグロ
    ビン溶液。
  12. 【請求項１２】 アジド−メト−ヘモグロビンまたはカ
    ルボニル−ヘモグロビンからなることを特徴とするグリ
    コヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として
    有用である安定な非グリコヘモグロビン溶液。
  13. 【請求項１３】 試料におけるグリコヘモグロビンの相
    対量を測定する方法に使用するための別々に包装された
    安定なグリコヘモグロビン標準のキットにおいて： ａ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し０〜１０％の範囲内で測定可能な全グリ
    コヘモグロビンと共に含有する溶液と； ｂ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し１０〜２７％の範囲内で測定可能な全グ
    リコヘモグロビンと共に含有する溶液と； ｃ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し２２〜４４％の範囲内で測定可能な全グ
    リコヘモグロビンと共に含有する溶液と； ｄ．アジド−メト−ヘモグロビンまたはカルボニル−ヘ
    モグロビンの溶液とからなることを特徴とするキット。
  14. 【請求項１４】 各成分が： ａ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し２〜７％の範囲内で測定可能な全グリコ
    ヘモグロビンと共に含有する溶液と； ｂ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し１３〜２１％の範囲内で測定可能な全グ
    リコヘモグロビンと共に含有する溶液と； ｃ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し２６〜３６％の範囲内で測定可能な全グ
    リコヘモグロビンと共に含有する溶液と； ｄ．アジド−メト−ヘモグロビンまたはカルボニル−ヘ
    モグロビンの溶液とからなる請求項１３に記載のキッ
    ト。
  15. 【請求項１５】 試料におけるグリコヘモグロビンの相
    対量を測定する方法に使用するための安定なグリコヘモ
    グロビン標準のキットにおいて： ａ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し４〜６％の範囲内で測定可能な比率のヘ
    モグロビンＡ1cと共に含有する溶液と； ｂ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンまたは還元
    グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビ
    ン含有量に対し８％より高い測定可能な比率のヘモグロ
    ビンＡ1cと共に含有する溶液とからなることを特徴とす
    るキット。
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