JPH06508690A - グリコヘモグロビンの迅速測定 - Google Patents
グリコヘモグロビンの迅速測定Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
グリコヘモグロビンは、ヘモグロビン分子に各種の糖類(最も一般的にはグルコ
ース)が結合して生成される一連のヘモグロビン少量成分を意味する一般的用語
である。糖尿病の観点からしてこれらヘモグロビン少量成分のうち最も重要なも
のは、ヘモグロビンA である。これは、ヘモグロビンAの一方もしC
くは両方のβ鎖におけるN−末端アミノ酸残基バリンにグルコースが結合して形
成される[Gollslein、 +1.E、等、Cl1n、 Chew。
32:Be4−870. 1986コ 。
ヒト赤血球はグルコースを自由に透過しつる。各赤血球内には、グリコヘモグロ
ビンがヘモグロビンA(天然の正常型)から周囲グルコース1度に比例した割合
で形成される。この反応は自発的であって酵素触媒を要しないものの、充分に遅
く、このため赤血球の寿命(120日)の間にはヘモグロビンのごく一部が修飾
されるだけで、かつこれは不可逆性である。その結果、グリコヘモグロビンは過
去の血糖値の加重「移動」平均の日間となり、より最近の血糖値がより大きく影
響する[5in(B+等、^nn、cIin、Bioches、26:213−
219. 1989]。
グリコヘモグロビンのレベル上昇は真性糖尿病に関連することが知られている。
非糖尿病患者ではグリコヘモグロビンは全ヘモグロビンの約5%のレベルにて存
在するのに対し、糖尿病患者はこの量の2〜4倍を示す。グリコヘモグロビンレ
ベルは血糖値の短期変動には比較的影響を受けず、糖尿病患者における血糖管理
の状態を比較的正確に反映する。その結果は、過去1〜3ケ月にわたる期間平均
血糖濃度を示す。グリコヘモグロビン測定は糖尿病患者におけるグルコース不耐
性程度の評価および真性糖尿病の管理に使用される[L@tler、^nn、
Cl1n。
Biochem、 26:2N−219,198L KennedF等、 B+
、Med、 Be1l、45:174−190.19g9; FInecktg
e+等、1. Chrom*logr、429:279−292゜19118;
Goldslein、等、Cl1n、Ch■、32+B64−70. 198
6;L+ten+en、 Den、 Med、 Bull、32:309−32
8. 19115; Goldslein等、CRCC’+i1.’ Rzw、
Cl1n、Ltb、Sci、21:187−221 1984゜Peacock
、1.Cl1n、P*1ho1. 37: 841−851. 1984: M
izdelI等。
^nn、Cl1n、Biochet 21:2−15+ 1984: MBe+
等、Cl1n、Chew^cl* !27:147−184. 1983; G
1bbt7.’ Med、Cl1n、North ^−66:1309−131
5. 1982 J。
グリコヘモグロビンを、ヘモグロビンAltもしくはヘモグロビンA1として或
いは全グリコヘモグロビンとして測定するには種々の方法がある(イオン交換ク
ロマトグラフィー、チオバルビッール酸法、等電点照準法および親和性クロマト
グラフ分析) [Co1(R,A等、 Met昌bo1口園27:289−30
1. 1978; Nl1hIn。
D、M、 Cl1n、 Chl、 27:l261−1263. 190; I
Ioo+e、1.C,等、 luu+。
Cl1n、Biocht+i、 N:8S−91,19N ] 、イオン交換ク
ロマトグラフィーにおいて、ヘモグロビンAlcを含めて多くのグリコヘモグロ
ビン物質は中性pHにてヘモグロビンACよりも陽帯電が低く、陰帯電樹脂にあ
まり結合しない[Roseffilhsl、 P、に、等。
Am 1. C1口 Pt1ho1.75:45−49. 1981;米国特許
第4.407.961号、米国特許第4.649゜122号]。ヘモグロビンA
ltをヘモグロビンA11bフラクンランから分離する幾つかの方法が記載され
ている[Gollslein、D、E 等、 [li*bele+ 31ニア[
1−711982;M@qu*rl、 F、L等、Cl1n、 Chis、Ac
ts 10!l:329−332. 1980;Inn?+、 M、D、等、H
emoglobin 2:53−58. 1978; Clt+ke、1.T9
等。
110belt MeNbol、5:293−296. 1979; DIti
3 1.E、等。
D目btls+ 27:IO2−107,1978; Cafe、R,A。等、
Mel*boliss 27:289−301. 1978.米国特許第4.
3N、491: Bio−RId Lsbor1o+ie+。
tlemoglobin A、c Mie+o Colwmn Te51 11
1+wclio@ M*nwsl。
M++ch 1990]。しながら、これら方法にはいろいろの欠点を有する。
これら方法の多くは2種の緩衝液を用い、その第1緩衝液は特異結合した物質を
脱着させないように未結合物質をイオン交換樹脂から溶出させる。異なるpt(
もしくはイオン強度で用いられ或いは競合抑制剤を含有する第2緩衝液が、特異
結合した物質を溶出させるのに必要とされる。温度、pH1イオン強度およびカ
ラム寸法が試験結果に影響を及ぼす[SimoIl、 M。
等、Di@beles 29+467−474. 1980; 5chelle
ke++3 ^、 P、 M、等1CIin、 Chew、 27+94−99
. 1981; Ctsll(nol、 M、等、J。
Ch+o11o(r。272:51−65. 19113] 。さらに、これら
方法は幾つかの異なる工程および数個の容器を必要とし、殆どの方法は自動化さ
れず、或いは半自動化されるに過ぎない。
用いる方法に応じ、これら分析法の他の限界は可逆性の中間グリコ型[プレーヘ
モグロビン−AIc’を含むことであり、これは分析を行う前に除去する必要が
ある[Goldsleie、 D、E、等。
Digbele+ 31+70−711. 19g2; B■n、 H,F、D
目btltt 30:6N−617゜1981: N暑lh*n、 D、M、
Cl1n、 Chew 、 27:12611263. 19111;MBtr
、T、K 等、 Cl1p、 Chis、 Acts 127+14?−184
,1983;Hetllh tnd Pablic Po1icy Co*mi
目te、American Co11Bs olFby+icign+ Ann
、Intern Med、101ニア10−03、L9[14; Ntlhs+
+。
11、M、 C11I1. Chet 27:1Hl−103,1981] 。
高レしルの胎児ヘモグロビン、鎌状ヘモグロビンおよび他の希な状態がこの分析
を阻害しうる[N1ei*dlik、D、C等、JAM^224:1734−1
736゜1973]。
グリコヘモグロビンを測定する他の方法は、グリコヘモグロビンと結合する特異
的親和性もしくは結合剤を使用する。次の特許、すなわち米国特許第4.200
.435号;第4.260.516号;第1.274.9’lR号;第4.25
5.3115号;および第4.438.2114号において、グリコヘモグロビ
ンは親和性法またはヘモグロビンのアロステリック特性を用いて測定される。ド
イツ特許第159569号には、親和性試薬として糖結合性蛋白が記載されてい
る。
他のWlF[]性結合法は、グリコヘモグロビンとポロン酸(botOnic
rcid)誘導体との間の特異的な錯体形成に基づいている [Mid+lle
等、Bioehtt 1. 209ニア71−779. 1983; Klen
k等。
Cl1n、 Chem、 H:2HL2G94.1982;い目1を等、 Cl
1n、 Chew 。
32::l5LH11,1986、米国特許第4.269.605号;米国特許
第1、861.728号、英国特許出願第2206411^号; 1sol*b
、Inc。
Tschnic*l Pwblic*口on:Glマc^山n” GHb、Ha
G;Foutsl。
獣θ等、 Cl口、 Cbts、 34:目S−148,19811゜親和性結
合法は11 b Aの他にグリコヘモグロビン類も検出するが、これらはたとえ
ばイオン交換クロマトグラフィーのような11bA、、に対し一層特異的な方法
に対し比例関係にある[Li1lle等、 Cl1LChet 32:35+1
−360. 1986] 。グリコヘモグロビンに関するイオン交換分析および
比色分析と同様に、親和性法も限界を有する。
これら限界の1つは、2種の異なる緩衝液を必要とすることである。第1緩衝液
は、cis−ジオール基を持たない非グリコフラクションを溶出させる。グリコ
ヘモグロビンが多い結合フラクションは、たとえば糖アルコールのようなカラム
からグリコヘモグロビンを排除する置換剤を含有した第2緩衝液で溶出される。
さらに流速およびカラムの寸法も、親和性試薬に結合するヘモグロビンの量を制
限する。
標準曲線を作成し分析精度を決定するための、グリコヘモグロビン分析に用いる
のに適した安定なグリコフシル化標準または較正手段もしくは対照については種
々の意見がある[Gold+1ein、D、E、等、Cl1n、Che++、3
2,108:864−870. 19116;Frrntini、 C,等、
G、 Ntl、 Chin、 Cl1n、9:187192. 1984 ]
。
これら対照の中には、保存料を添加した赤血球の溶血物に過ぎないものもある[
東独特許第150543号;米国特許第3519572号;英国特許第9344
61号]。これら物質はしばしば凍結乾燥され、使用地の実験室で再編成されて
数日間〜数週間にわたり使用される [l1io−Rld Lxbo+*lo+
ie+、Hemoglobin^le Micro Co1atnTe+l I
n5t「+1ction Mtn■l、 MI+ch 1990 ] o この
ようにしたときの物質の安定性は充分に説明されていない。シアノメテモグロビ
ン、オキシヘモグロビン−ポリヒドロキシ化合物;および−酸化炭素型のヘモグ
ロビンを用いて、安定なヘモグロビン標準を形成するよう試みた人もいる[ドイ
ツ特許第3311458号;ヨーロッパ特許第72440号;およびMo @C
I、A 等、]、Cl1nCheffi、 Cl1n、Biochem、 23
:361−364. 1985] o現地で作成される対照(一般に正常および
糖尿病の試料から作成した全血もしくは充填赤血球の溶血物)を用いることによ
り、多くの実験室は分析精度を管理している[Goldslein、 D、E、
D口bele+ 31ニア(1−78,1982: Co1e、R八 等Me
1gbo1口m 27:289−301. 1978:Simon、 M 等、
Cl1n、Chen+、28:195−198. 1982; P1+ker
、 K、M等、Cl1n、 CheM、27:f+69−672. 1981]
。これらの対照は、安定性を保つよう精密に制御された条件下で貯蔵せねばな
らない[Llinde+、 O,Cl1n、 Chew、 28:96−99
(19B2)] 。
実施が容易であり、阻害を受けず、かつたとえばpHおよび温度のような実験変
動因子に対し比較的敏感でないグリコヘモグロビン分析については、引き続き要
求がある。さらに、この種の分析に用いるための安定な標準および対照、並びに
標準の作成方法も期待されている。
発明の要点
本発明は、検出すべき基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料にお
いて、基質結合性物質の比率もしくは濃度を検出すると共に定量する方法に関す
るものである。より詳細には本発明は、検出すべき基質結合性物質と基質非結合
性物質とを含有する試料において、基質結合性物質の比率もしくは濃度を検出す
ると共に定量する迅速法に関するものである。
本発明によれば、基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料の吸光度
を測定し、特異的結合剤もしくは親和性剤を付着させた固体基質を添加する。結
合反応における基本的成分は試料と、結合剤を付着させた固体基質と、結合反応
に適合性の緩衝溶液とである。
結合反応の後、試料の吸光度を適する検出装置を用いて測定する。試料の量もし
くは相対活性は、固体基質により結合された結合性物質の量に逆相関する。
したがって本発明の一態様は、基質結合性物質を含有すると思われる試料におけ
るこの基質結合性物質の存在および量を決定する方法に関し、この方法は基質結
合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料の初期吸光度を測定し、結合性物
質に対し特異的な結合剤を付着させた固体支持体に基質結合性物質を結合させ、
基質結合性物質が除去され或いは減少した試料の吸光度を測定し、次いで基質結
合性物質の比率を計算することを含む。
本発明の好適態様は、グリコヘモグロビンと非グリコへモグロビンとの両者を含
有する試料において、グリコヘモグロビンの相対量を決定する方法に関する。グ
リコヘモグロビンを特異的に結合する結合剤もしくは親和剤を固体基質に付着さ
せ、これを混合すると共に粒子を試験溶液から分離するようにした容器に仕込む
。2回の吸光度測定を試験溶液につき行うが、1回目は試薬、希釈剤と試験溶液
との混合直後に行い、さらに他方の吸光度測定はグリコヘモグロビンが固体基質
に実質的に結合した後に行う。分析の化学的原理は、3−アミノフェニルボロン
酸に対するcis−ジオール化合物の親和性結合に基づいている。全グリコヘモ
グロビンとヘモグロビンA1cとの間には直線的関係があるので、%ヘモグロビ
ンへ−こ相当する単位の基準化および記録が可能となる。
本発明の他の態様は、グリコヘモグロビンの測定に用いるための安定な液体グリ
コおよび非グリコヘモグロビン溶液の製造方法に関するものである。
さらに他の態様において本発明は、グリコヘモグロビンの測定に用いるためのキ
ットに関するものである。
さらに他の態様において本発明は、糖尿病患者の診断および管理に際し有用なグ
リコヘモグロビン比率の決定方法を提供する。
図面の説明
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および多くの利点は添付図面を参照する以
下の詳細な説明から一層よく理解されるであろう。
第1図は本発明の好適実施例に用いる試験パックの図解の平面図である。試験パ
ックの詳細については、多孔質フィルタを含むよう改変した米国特許第4.88
3.763号に記載されている。
第2図は、アボット・ビジョン(登録商標)分析器にて本発明の方法により決定
された牛アジドーメトーヘモグロビン検量手段を用いるグリコヘモグロビンの標
準曲線である。
第3図はグルコース濃度の関数としての牛ヘモグロビンのインビトログリフ化に
おける経時的試験である。
第4図は45℃にて24時間のストレスにより示したシアノ硼水素化ナトリウム
での還元によるグリコ牛アジドーメトーヘモグロビンの安定化を示す。
第5図はグリコ化されかつ還元されたヘモグロビンとグリコ化されずかつ還元さ
れないヘモグロビンとの比較安定性を示す。
第6図は一20℃および2〜8℃で貯蔵したグリコ牛アジドーメトーヘモグロビ
ン検量物質の長期安定性を示す。検鍛f段A=4.4〜5.096グリコヘモグ
ロビン(I(bA、ρ ;検定手段B=12.4〜14.0%HbA、c;検定
手段C=20.7〜23.39611bA、、。
第7図は本発明による方法とHP L C−グリコHb法との間の相関関係を示
す。相関係数(CC)=0.979゜第8図は本発明による方法とイソラブGl
yc−Af f inヘモグロビン分析との間の相関関係を示す。相関係数(C
C)=0. 991゜
本発明により解決された主たる問題は、2回の吸光度測定が必要とされる方法の
自動化であった。1回目の測定は試料における結合性物質および非結合性物質の
合計濃度に比例するものであり、他方は結合反応の後の結合もしくは遊離のいず
れかのフラクションに比例するものである。両側室を単一の試験溶液から単一の
試験容器内で行いたいという点に困難の原因がある。
これは、自蔵の試薬容器を用い、慣用のカラムクロマトグラフ分離または緩衝液
の変更なしに、好ましくは自動化装置で行うことができる。
本発明の一態様は、試料における基質結合性物質と基質非結合性物質との全体に
対する基質結合性物質の比を決定するための連続法(好ましくは自動化法)を提
供し、この方法は試料を固体基質と混合し、基質結合性物質と基質非結合性物質
とを含有する試料の初期吸光度を測定し、基質結合性物質が除去された試料の吸
光度を測定し、次いで基質結合性物質の比を計算することからなっている。固体
基質は、基質結合性物質のための結合剤を付着させた粒子で構成することができ
る。これら粒子は吸光度の測定に際し試料から分離される。これは数種の手段に
よって行うことができ、その1つは試料と粒子との混合物をこれら粒子を保持す
る多孔質フィルタに通すことである。
基質結合性物質は、結合剤に対し親和性を有する任意の分子とすることができる
。この種の結合性物質は炭水化物、蛋白質、核酸、脂質などを包含する。結合性
物質は動物、植物、細菌、酵母、原生動物、ウィルス、組換産生させた物質など
から誘導することもできる。試料から基質結合性物質を除去したとき、試料に測
定可能な変化が生じ、これをたとえば分光光度計、蛍光度針などの装置によって
検出することができる。好ましくは、測定可能な変化は分光光度計を用いて測定
されるような試料の光学密変変化である。基質結合性物質が試料から除去され或
いは部分的に除去されたことを検出するには、増幅システムを必要上することが
容易に了解されよう。この種の増幅システムは当業界にて公知であり、酵素:基
質系などを包含する。
本発明の一聾様は、グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する試料における
グリコヘモグロビンの比もしくは比率を決定する方法を提供し、この方法はグリ
コおよび非グリコヘモグロビンを遊離させるよう試料を処理し、次いで固体基質
をグリコヘモグロビンと固体基質との間の錯体形成を行う条件下で試料と接触さ
せ、次いで試料の全ヘモグロビン含有量に関連する初期吸光度を測定し、グリコ
ヘモグロビンを固体基質に結合させることによりこのグリコヘモグロビンを試料
から分離し、次いでグリコヘモグロビンが除去され或いはグリコヘモグロビンが
著しく減少した試料の吸光度を測定することからなっている。
本発明の方法は、たとえばRNA、オリゴヌクレオチドのような他のcis−ジ
オールを含有する物質、たとえばり、L−ドーパ、エピネフリン、ノルエピネフ
リンなどを包含するカテコールのような小生理分子、たとえばクエン酸、乳酸な
どのα−ヒドロキシカルボン酸、およびたとえばアルブミンなどの他のグリコ蛋
白質を検出するため用いることができる。必要な1゜2−cis−ジオール構造
を持たない物質でも、しばしばポリオールで容易に誘導でき、これを次いでジヒ
ドロキシボリル成分に結合できる。たとえば大抵のヌクレオチドおよび核酸は、
0.5MのMOPS緩衝液(pH5,5)Gニア25℃で2時間にわたり過剰の
ソルビトールおよび1−エチル−3(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジ
イミド(EDC)で処理して末端ホスフェートを介しソルビトールに結合させる
ことができる[生化学分離におけるボロネートリガンド、パブリケーション50
1、アミコン・コーポレーション社、1981]。通常はボロネートに結合しな
いデオキシリボヌクレオチドおよびDNAを、ポリオール誘導化に関し3′ も
しくは5′末端ホスフエートが利用できれば、緊密結合されることができる。誘
導化したリガンドは、所望ならばホスホジェステラーゼでの処理によりもとの形
態に戻すこともできる。ソルビトールの代わりにメチル−グルカミンを用いて、
化学切断しうる基を形成させることができる。或いは、非cis−ジオール含有
分子をジヒドロキシボリル成分に結合させることもでき、これにはcis−ジオ
ール含有分子を結合剤として用い、ただしcis−ジオール含有分子は非cis
−ジオール含有分子に対し親和性を有するものとする。この種のcis−ジオー
ルおよび非cis−ジオール結合対の例は次のものを包含する:メチルーα−D
−(。
グルコピラノシド・コンカナバリンA、NAD(P) 、グルコース−6−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、ATP・ヘキソキナーゼなど。
グリコヘモグロビンを測定するための本発明は、グリコヘモグロビンを固体支持
体から溶出させることを必要としない迅速連続システムで前記グリコヘモグロビ
ンを測定する点において従来技術とは相違する。また本発明は分析に際し緩衝液
の交換を必要としない。好ましくは、システムは自動化させる。
さらに本発明は、グリコヘモグロビンを測定する分析で検量手段および対照とし
て使用するための、明瞭に規定された安定なグリコ標準およびこれら標準の作成
方法をも提供する。
本発明の原理は小アガロースビーズに固定化させた3−アミノフェニルボロン酸
に対するグリコヘモグロビンの親和性結合に基づいており、553 / 628
n mにて二色吸光度を介して測定する。全ヘモグロビン濃度に比例する初期
吸光度測定を、試料と試薬および希釈剤との混合の後に行う。グリコヘモグロビ
ン(たとえばHbA、ρの同一平面cis−ジオール基と固定化3−アミノフェ
ニルボロン酸との間の鎖体形成が、希釈試料をボロネートアガロースと反復混合
する際に生ずる。この結果、グリコヘモグロビンが希釈試料から除去される。[
合計−グリコヘモグロビン]の濃度に比例する最終吸光度測定により結合o b
96の計算が可能となり、これを用意した検量曲線を用いて基準化HbA、c
%に変換する。
第1工程として、試料(好ましくはグリコヘモグロビンを含有すると思われる試
料、特に好ましくは全血試料)を得ねばならない。次の試料、すなわちヘパリン
もしくはEDTAを用いて凝固防止した全血が好適である。しかしながら、クエ
ン酸ナトリウムおよび弗化ナトリウム中に集めた試料も使用することができる。
血液試料におけるグリコヘモグロビンを測定するに先立ち、赤血球を溶解させる
必要がある。赤血球の溶解により、グリコヘモグロビンと非グリコヘモグロビン
との両者が細胞から放出される。一般的な陽イオン型(たとえば臭化セチルトリ
メチルアンモニウム);陰イオン型(たとえばドデシル硫酸ナトリウムおよびデ
オキシコリン酸ナトリウム);並びに中性(たとえばサポニンおよびオクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール)活性剤が、赤血球を溶解させるのに有用であ
る。約0025〜0.5容量%の濃度範囲における中性活性剤が好適である。機
械的破壊、たとえば超音波処理および低張性溶解も赤血球からヘモグロビンを遊
離させるのに効果的な方法である。
試薬の長期貯蔵安定性を得るには、少量の微生物防止剤を系に添加することが望
ましく、これは溶剤、抗生物質および毒を包含する。他の生化学物質(たとえば
グリコヘモグロビンの測定におけるKCN)を溶血した血液試料に導入すること
もできる。
次いで、試料をグリコヘモグロビンに対し特異的な結合剤もしくは親和剤で処理
して、グリコヘモグロビンを非グリコヘモグロビンから分離させる。1つの方法
においては、グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する溶血した赤血球の試
料を、ジヒドロキシボリル成分が結合された固体基質と接触させる。
他の具体例においては、固体支持体に、たとえばIIbA、cに対し特異的に結
合する抗体またはHb A lcに特異的に結合するレクチンのような異なる結
合剤もしくは親和剤を結合させる。
固定支持体はビーズ、樹脂などの形態とすることができる。
特に好適な具体例においては、固体支持体を個々の粒子または微粒子の形態とす
る。これら粒子は天然もしくは合成ポリマー物質で構成することができ、所望に
応じこれらを架橋させてもさせなくても良く、或いは化学的に改変することもで
きる。好ましくはポリマーはたとえばポリアクリルアミドのように親水性であり
、或いはたとえば登録商標ウルトラゲルとして販売されるようなアガロースポリ
アクリルアミド共重合体またはアガロース或いはたとえばセルロース、セルロー
ス誘導体、澱粉、デキストランおよび架橋デキストランのような遊離ヒドロキシ
ル基を有するポリマー、たとえば登録商標セファデックス、セファロースおよび
セファクリルとして販売されるものである。
粒子の直径は広範囲に変化しうるが、40〜200μmの粒子が好適である。
この性質を有する粒子は結合剤もしくは親和剤を付着させるための固定基質とし
て役立ち、容器内で容易に使用することができる。容器は、グリコヘモグロビン
と固定支持体との間の結合を生ぜしめると共に吸光度を測定するものである。好
適容器は、粒子を試験溶液と混合しうると共に粒子を吸光度測定に際し溶液から
分離しうる容器である。最も好適な容器は、米国特許第4.883.763号(
参考のためここに引用する)に記載されたような同相分析装置もしくは試料処理
カードの改良型である。
混合リブ領域における円筒穴部は多孔質フィルタ挿入物を収容する。フィルタ挿
入物はアガロース粒子がキュベツト内に侵入するのを防ぐと共に、希釈試料が流
過するアガロース充填ベットの形成を可能にする。試薬および希釈剤を二重(ビ
ール)カップに精密に充填する。希釈比は約に60である。希釈比は、二の分析
が質l/容積濃変を測定するものでないため重要でない。
この固相分析装置を用い、装置内に入れた粒子にグリコヘモグロビン用の特異的
結合剤を固定化させる。粒子が保持されかつ固定化される。試料を固体基質と混
合し、グリコヘモグロビンを捕獲すると共に粒子上の試薬によって粒子上へ保持
する。
非グリコヘモグロビンは試薬により結合されず、したがって溶液中に遊離状態で
留まる。
グリコヘモグロビンに特異的な結合剤は、米国特許第4、269.605号(参
考のためここに引用する)に記載されたようなジヒドロキシボリル成分で構成す
ることができる。この成分は好ましくはフェニルもしくは置換フェニルボロン酸
、硼酸または他のボロン酸、たとえばエタンボロン酸および1−プロパンボロン
酸などである。結合剤は機械的、物理的もしくは化学的手段により固体基質に結
合させることができる。好ましくは、リガンドを直接共有結合によりマトリック
スに結合させる。結合剤は、その後の反応に際し脱着してボロン酸ヒドロキシル
に遊離しないように、基質に結合させるべきである。好適方法において、親和性
樹脂は、m−アミノフェニルボロン酸を1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ
プロピル)−カルボジイミド(E D C)用いて活性化されたカルボキシメチ
ル−アガロースビーズ(CM−セファロース(登録商標)、ファルマシア社)と
反応させて作成される。反応条件は、グリコヘモグロビン(G Hb )の特異
的結合を最大化させると共に非グリコヘモグロビンの非特異的結合を最少化させ
るべく、適切な置換度を有する生成物を生ずるよう選択される。選択したジヒド
ロキシボリル成分とは無関係に、グリコヘモグロビンの糖部分は所望の分離を達
成するようジヒドロキシボリル成分に結合しつることが必要である。
代案上して特異的結合剤は、被覆され、固定化され或いは粒子に共有結合される
抗体で構成することもできる。免鯵化および回収工程により抗血清を得る方法は
一般に当業界で知られている。抗体はモノクローナル抗体とすることもでき、そ
の手順も当業界で知られている。Hb A lcに対するモノクローナル抗体の
例はノーレス等に係る米国特許第4.727.036号に記載されている。
被覆し、固定化し或いは粒子に対し共有結合しつる他の特異的結合剤は、w4構
成に対し特異的な試薬を包含する。これらはコンカナバリンA1スクンニルーコ
ンAおよびビシア・ファバなどを包含するα−D−グルコースに対し特異性を有
するレクチン類を包含する。他のレクチンおよびその炭水化物特異性も周知され
ており、遊離レクチンまたは固体支持体に結合したレクチン、たとえばセファロ
ース(登録商標)−レクチンとして入手できる。他の炭水化物特異性支持体はア
ルミナゲル、燐酸カルシウムゲル、炭酸マグネシウム、珪酸マグネシウム、シリ
カゲルを包含する。
試料におけるグリコおよび非グリコヘモグロビンは、溶液の光学密度(吸光度)
を測定する装置、好ましくは340〜633nmの波長範囲における吸光度を測
定しうる分光光度計を用いて分析的に検出および定量される。好適具体例の装置
は、ヨーロッパ特許第016090181号(参考のため、その開示をここに引
用する)に記載された自動化アボット・ビジョン(登録商[)アナライザである
。
自動化分析装置は、二次元遠心分離の原理を用いて血漿を細胞から分離すると共
に試験パック内で流体を測定゛しかつ混合する。試験の開始に際し、回転板によ
り発生した遠心力(1800rpmの回転板速度)により試験パック内の各試薬
を1個もしくはそれ以上の試薬測定用もしくは保持用チャンバに移動させる。同
時に、試料を毛細管もしくは試料穴部から血液分離室まで移動させる。凝固防止
されかつ溶血された全血試料の場合、遠心力により溶解した赤血球ストロマを沈
降させて、ヘモグロビン含有試料をチャンバの上部に残す。次いで試験パックホ
ルダーによる一連の回転が生ずると共に、回転板が回転し続ける。
試験パックホルダーは試験パックを反時計方向に90°回転させて1、緩衝試薬
および希釈剤緩衝液を反応室中へ注入させると共に試料の1部を第1図に示した
ように試料保持室に注入させる。次いで試験パックホルダーは時計方向に90°
回転して、試薬および希釈剤の液体成分をキュベツト中へ移動させると共に試料
を測定室に移動させる。次いで試験パックホルダーは反時計方向に90℃回転し
て、測定された試料を反応室中へ移動させ、ここで固体試薬ならびにキュベツト
から流出する試薬および希釈剤の液体成分と混合する。試験バンクホルダーの時
計方向における最後の90°回転は希釈試料をキュベツトに移動させ、ここで光
学系が初期測定および試料と試薬との複数回の回転後における最終測定につき5
53〜628nmにて光学密賀を測定する。アボット・ビジョン(登録商標)・
アナライザの詳細についてはアボット・ビジョン(登録商標)・アナライザ・マ
ニュアル、第13.7頁に記載されている。同様な仕様を有する他の自動化分析
装置も上記方法に使用することができる。
緩衝剤
p Hは、ボレート成分の親和性カラムに対するcis−ジオール化合物の結合
に影響を及ぼすことが知られている。緩衝液のpHが高い(9,6より大)とヘ
モグロビンの結合および安定性が低下するのに対し、低pH値では非特異性結合
が増大する。非特異性結合は、陰帯電したボロネート成分およびフェニル環によ
り導入された疎水性成分に関連するイオン効果を包含する。分析に使用する緩衝
剤を考慮する際、たとえばトリス[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]
のような複数ヒドロキシル基を有する緩衝剤はボロネート成分に結合するため避
けるべきである。ソルビトール、セリン、エタノールアミンおよび硼酸も避ける
べきである。生成されるボレート−ジオール錯体を強化するよう作用する緩衝剤
が好ましい。この試験システムに適する緩衝剤は約7.5〜11.0の範囲のp
Kaを有する緩衝剤である。この範囲の緩衝剤は当業界にて公知である。分析に
際し37℃にて約7.8〜9.6のp H範囲、より好ましくは約8.5〜9.
2、特に好ましくは9〜9.2の範囲にp Hを維持するには、約8.5〜9.
2のpKaを有する緩衝剤がより好適である。アミンは錯体を強化するよう作用
し、したがってたとえばグリシン、モルホリン、I(EPESのようtIl衝剤
またはたとえばアンモニウム塩もしくはピペリジンのような添加剤が結合を促進
するのに有利である。好適具体例においてp Hを維持するよう使用される緩衝
剤は、2−アミノエチルスルホン酸(タウリン)であって、20〜50mM(好
ましくは25mM)の濃度にて9゜06のpKaを有する。
Middl(FA等、Bioch2m、1. 209ニア71−7?9 (19
83)および[生化学分離におけるボロネートリガンド、出版物501、アミコ
ン・コーポレーション社(1981)Jは、二価陽イオン、主としてMgCe2
から誘導されたMg を用いて、陰帯電した固定化ボロネートと陰帯電したリガ
ンドとの間の斥力を解消することを記載している。本発明もこの目的でMg2+
を使用する。しかしながら、本発明は好ましくはMgCl2の代りにMg5Oを
用いて、発明を最適に操作しうる。MgSO4の好適濃度は約10〜500mM
、より好ましくは50〜200mM1特に好ましくは約100〜150mMであ
る。ヘモグロビンは37℃および高められたpHではあまり安定でない。塩化物
の存在下で分析を実施すれば、ボロネートアガロースの不存在下で約896の吸
光度低下が生ずる。これは、試験パックのプラスチック表面に対する沈殿と吸着
との組合せに起因する。
吸光度の8%低下という値は、溶液からのヘモグロビンの非特異的損失がない正
常なグリコヘモグロビンレベルを有する試料につき予想される信号の約2倍にも
なる。換言すれば、パックグラウンドが信号の大きさの約2倍である。MgCl
2の代りにMgSO4を使用すれば、この損失は約3%まで減少することが判明
した。
ゼラチン(魚鱗)およびポリビニルピロリドン(pvp)を緩衝剤に混入すると
、さらにヘモグロビンが安定化された。
MgSO4と組合せて、これは損失を約1%まで減少させる。
この実験からのデータを第1表に示す。たとえばカゼイン、他の原料からのゼラ
チン、アルブミンなどの他の蛋白質安定剤および水溶性ポリマーも同様な結果を
与えると予想することができる。
第1表
緩衝剤の処方 :MgCl2の代りにMgSO4の使用*緩衝剤=25mMタウ
リン、100mM2令
Mg 、pH9,2,22℃
試料=アジド−メト−ヘモグロビン(非グリコ化)分析
分析の目的で、既知量の固体基質(10〜200 ulの範囲、典型的には65
μm)を乾燥錠剤もしくは湿潤懸濁物のいずれかとして適量の$IWR溶液と共
に供給する。緩衝溶液は、反応のp ifを血液試料の添加に際し約8.5〜9
,2の範囲の一定値に維持するのに適したpKaを有する20〜50mMの化合
物を含有する。約10〜500mM、より好ましくは約50〜200mM、特に
好ましくは約100〜150mMの一定濃度で緩衝剤にMg4+塩を添加して、
固体基質におけるG Hbとボロネートとの間の静電反発力を解消する。ヘモグ
ロビン沈殿を防止する蛋白質安定剤および抗微生物保存料も緩衝剤に含ませるこ
とができる。分析温度は約24〜39℃、より好ましくは約30〜37℃の範囲
であり、約37℃の温度が最も好適である。
血液試料を先ず最初にヘパリンで処理して、凝血を防止すると共にサポニンで処
理して赤血球を溶解させる。次いで、試料を遠心分離すると共に試料の1部を樹
脂および緩衝剤とざっと混合する。希釈した試料を樹脂から分離し、希釈試料の
初期吸光度を得る。次いで、希釈試料を激しく樹脂と、グリコヘモグロビンがほ
とんど固体基質に結合するまで混合する。樹脂を取出し、最終吸光度の測定を行
う。吸光度データを処理して、結合したヘモグロビンの相対量もしくは比率を計
算する。グリコヘモグロビンの比率は、結合ヘモグロビン対グリコヘモグロビン
%の標準曲線から決定される。標準曲線は、既知比率のグリコヘモグロビンの検
量試料を用いて同じ手順により作成される。
既知%のグリコヘモグロビンの対照を用いて、標準曲線の正確性を定期的に試験
し或いは確認する。
グリコヘモグロビンのデータ整理
標準曲線を作成すると共に、この曲線から未知試料を測定するには、分析器によ
って次の工程を行う。全ヘモグロビン濃度に比例する初期吸光度測定値(A、)
と(合計−非結合)ヘモグロビンに比例する最終吸光度測定値(A1)とを測定
して記憶する。結合ヘモグロビン%(%B)の測定値を次式:%式%)
を用いて計算する。この結合%を次の2つの作用につき補正せねばならtlい:
1.成る程度の結合が初期測定の前に生ずる。
2 平衡に達する前に最終測定を行う。その結果、測定した結合06は全ヘモグ
ロビン濃度により影響を受ける。測定結合%はヘモグロビン濃度の減少と共に増
大する。したがって補正結合06(06D)は、一対の定数(EおよびI)と初
期吸光度測定値(A、)とを用い、測定結合%を調整して得られる96D=96
8−Ex (A、−1)
ここで、■は約13 g/diの濃度における「正常」ヘモグロビンの試料につ
き得られる初期吸光度測定値に等しい。このパラメータは実際の測定波長、試験
パックにおける希釈度、および試験パックにおけるキュベツトの路長に依存する
。■に関する2つの異なる数値の一方を、試料が検量手段/対照であるか或いは
患者の試料であるかに応じて選択する。希釈度および路長は試験パックの製造に
際し調節される。実際の測定波長は装置毎に若干変化する。したがって、1に関
する独特の対を各装置に用いる。Eは、結合%をヘモグロビン濃度の関数として
決定すると共にグリコ化%を一定に維持して実験的にめた恒数である。Eに関す
る2つの異なる数値の一方は、試料が検量手段/対照であるか或いは患者の試料
であるかに応じて選択される。
直線的標準曲線は、%HbA、−所定の数値を用いて検量手段につき%Dと%H
b A lcとの回帰分析から計算される;%HbA1.=(m×%D)+B
[式中、mは傾斜であり、BはY輪切片である]。
例:標準曲線:
06 Hb 、仙、= (0,8741X%D)+0.996E=7.7 Xl
0−41 =iSOO11b濃度(i/Ill Ai (s^、11)%8 9
62 % 1lbA、。
17.0 1962 8.82 9.18 9.0215.0 1731 9.
00 9.18 9.0213.0 1500 9.18 9.H9,0211
,012699,369,1119,029,010389,549,1119
,027,08089,719,189,02樟準曲線を第2図にプロブトする
。このデータを用いた換算法によれば、大幅に変化するヘモグロビン濃度の試料
に対しても%HbA、cの正確な測定を可能にする。1つの有力な利点は、隈定
容積の試料(たとえばネオナタール)を希釈してもまだ精密に分析しうる点であ
る。
検量試料/対照
グリコヘモグロビン分析に使用するためのグリコヘモグロビン検量試料および/
または対照は、好ましくはヒトもしくは動物の血液から作成された液体材料であ
る。1具体例において、グリコヘモグロビン材料は牛赤血球から作成される。グ
リコヘモグロビン検量試料は好ましくは低レベル、中レベルおよび高レベルのグ
リコアジド−メト−ヘモグロビン(実施例3)を好ましくは還元型にて約5〜9
、より好ましくは6〜8のpHの緩衝溶液中に含有する。検量試料に含有される
グリコヘモグロビン材料のレベルは、全グリコヘモグロビン(TGHb)の比率
またはヘモグロビン(HbA、c)の比率のいずれかにより示すことができ、こ
れは試料中のヘモグロビンの全量に対するグリコヘモグロビンもしくはヘモグロ
ビンA1eの量である。低水準の検量試料は約θ〜10%TGHb即ち0〜8%
HbAlc。
より好ましくは約2〜7%TGHb即ち3〜6%Hb A 、。
特に好ましくは4〜5%T G Hb即ちHbA、、の範囲である。
中水率の検量試料は約10〜27%TGHb即ち8〜16%Hb A 、、より
好ましくは13〜21%TGI(b即ち10〜15%)(bA 、特に好ましく
は約15〜18%TGHb即ちC
11〜13%11bA、、の範囲とすることができる。高水準の検量試料は約2
2〜44%TGHb即ち16〜30%Hb A 、。
より好ましくは26〜36%T G Hb即ち18〜25%HbA、、特に好ま
しくは約27〜30%T G Hb即ち19〜21961(bA、cco範囲と
することができる。低、中および高水準の検量試料は、45967 G )I
b即ち30%l(b A lcよりも大きな、より好ましくは約45〜60%T
GHb即ち30〜4096HbA、、のグリコ96範囲におけるグリコヘモグロ
ビン材料の保存溶液と、非グリコ還元ヘモグロビン溶液との混合物から処方する
ことができる。非グリコヘモグロビン溶液はごく少量であればグリコ化物を含む
ことができる。
検量試料および対照の安定性は、約8℃もしくはそれ以下で貯蔵する際には約1
0ケ月より大、より好ましくは10〜14ケ月の範囲、特に好ましくは少なくと
も14ケ月の安定性を有すべきである。
対照は検量試料と同様に作成される。対照レベルは、好ましくはグリコヘモグロ
ビンの正常(4〜6%II b A 、ρおよび高められた(8%IIbA、、
より大)生理的レベルを反映するように選択される。
本発明の1具体例において、安定なヘモグロビン溶液はアジド−メト−ヘモグロ
ビンから作成される。アジド−メト−ヘモグロビンは、洗浄した赤血球から低張
性衝撃により放出された脂質フリーのヘモグロビンから作成することができる。
赤血球の原料はヒトまたは動物(好ましくは哺乳動物)であり、より好ましくは
牛赤血球である。ヘモグロビンは、たとえばフエ1ノシアン化カリウム、硝酸ナ
トリウムなどの酸化剤によりメト−ヘモグロビンまで酸化される。次いでメト−
ヘモグロビンをアジド塩(たとえばナトリウムアジドなど)と接触させアジド−
メト−ヘモグロビンまで変換する。
赤血球におけるヘモグロビンは、非酵素過程によりグルコースの存在下でグリコ
化される。先ず最初に、易可逆性反応がグルコースとヘモグロビンβ鎖のN−末
端バリンとの間で生じて、不安定なアルジミン即ちシッフ塩基を生成する。この
迅速な平衡に続いて遅いアマトリ転位が生じ、ヘモグロビンAlcの安定なケト
アミン結合を形成する。ヘモグロビンA1−測定は長期糖尿病管理の有用な指標
である。
本発明の他の具体例において、安定なグリコヘモグロビン溶液はアジド−メト−
ヘモグロビンから作成される。非酵素的ヘモグロビン反応を、安定な液体グリコ
ヘモグロビン検量試料および対照材料のインビトロ合成につき用いた。ヒトもし
くは牛赤血球からのアジド−メト−ヘモグロビンを好ましくは37℃にて数日間
にわたり種々の濃度のグルコースと共に培養した。
グルツース分子はアミン基と、シッフ塩基物質をヘモグロビン上で形成する。未
反応グルコースを除去した後、不安定なシッフ塩基物質を緩和な還元剤(たとえ
ばシアノ硼水素化ナトリウム)での還元、たとえばパラジウムなどの触媒の存在
下における接触水素化、硼水素化ナトリウムなどでの還元によって安定化させた
。還元の完結は、高められた温度(たとえば約45℃)にて還元グリコアジド−
メト−ヘモグロビンを熱処理(hesitIre++iB) して試験すること
ができる。還元副生物をゲル濾過もしくは透析によって除去した。
グリコヘモグロビンを生成させるべくアジド−メト−ヘモグロビンに添加するグ
ルコースの濃度は約50〜1000mM。
好ましくは約ioo〜500mM、特に好ましくは約150〜300mMの範囲
である。グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンと共に約1〜1o日間にわた
り或いは所望のグリコ化%に達するまで培養する。
さらに他の具体例においては、シアノ基をアジドの基の代りに使用するこきがで
きる。シアノ−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビ
ンも安定なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビン溶液を形成する。アジド−メ
ト−ヘモグロビンおよび還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンの作成方法を用
いて、シアノ−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビ
ンを作成することができる。たとえばシアン化ナトリウムのようなシアン化物が
、この作成方法でアジド塩の代りに使用される。
さらに他の具体例においてはカルボニル基をアジド基の代りに使用することもで
きる。カルボニル−ヘモグロビンおよび還元グリコカルボニル−ヘモグロビンも
安定なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビン溶液を形成する。カルボニル−ヘ
モグロビンの作成方法は、−酸化炭素ガスをオキシ−ヘモグロビン溶液中にグリ
コ化の前に吹込むことを含む。この場合、フェリシアン化カリウムまたは他の酸
化剤は必要とされない。何故なら、オキシ−ヘモグロビンはカルボニルヘモグロ
ビン成形のための好適先駆体になるがらである。−酸化炭素の吹込み過程に際し
発泡を最小化するには消泡剤が必要とされる。得られるカルボニル−ヘモグロビ
ン物置は、アジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト−ヘモグロビンと
同様にグリコ化されて処理さらに本発明は、試料(好ましくはグリコおよび非グ
リコヘモグロビンを含有する血液試料)のグリコヘモグロビン含有量を分析する
際に使用するための試験キットをも包含する。この試験キットは次の各成分を含
む: (1)約6〜8(好ましくは7.7)のpF(を有し、グリコヘモグロビ
ンのための結合剤(好ましくはジヒドロキシボリル成分、より好ましくは3−ア
ミノフェニルボロン酸を付着させた粒子の懸濁物とMg2+源とを含有する緩衝
試薬溶液、および(2)反応混合物のpHを37℃にて約7.8〜9.6、より
好ましくは8.5〜9,5、特に好ましくは9〜9.2の範囲に維持しうると共
に、緩′衝剤が約7.5−11、好ましくは8.5〜9.2のpKaを有する希
釈剤緩衝溶液。試験に用いる粒子材料および結合剤に応じ、試験キット成分は別
々に或いは組合せて供給することができ、或いは予備混合して単一溶液混合物と
して供給することもできる。
他の具体例において、親和性粒子は抗−グリコヘモグロビン抗体またはレクチン
を結合剤として付着させる。
より好ましくは、緩衝試薬溶液はジヒドロキシボリル誘導粒子と約10〜500
mMのMgSO4、特に好ましくは約100〜150mMのMgSO4を含有す
る。緩衝試薬溶液はさらに抗微生物剤および/または保存料、たとえばゲンタマ
イシン、ナトリウムアジドなどをも含有することができる。
特に好ましくは緩衝試薬溶液は、8.4mMのI(E P E 5(N−2−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸)と150 m M
c7) M g S O4と0.4g/リットルのゲンタマイシン硫酸塩と0.
05%のナトリウムアジドとを含有する緩衝試薬溶液(pH7,7)における、
3−アミノフェニルボロン酸誘導アガロースビーズ粒子の懸濁物を含有する。
より好ましくは希釈緩衝剤溶液はさらにたとえばゼラチン、アルブミン、カゼイ
ンなど、好ましくは魚鱗ゼラチンのような蛋白質安定剤を約0.5〜5%、より
好ましくは1〜2%、特に好ましくは1.65%の濃度で含有すると共に、たと
えばポリビニルピロリドン(PVP)(K値90)のような水溶性ポリマーを約
0.5〜5%、より好ましくは1〜2%、特に好ましくは1.65%の濃度で含
有し、さらにたとえばゲンタマイシンおよびナトリウムアジドのような抗微生物
剤および保存料をも含有する。好ましくは、約65μlの沈降した水和ビーズを
含有する約190μlの緩衝試薬溶液を、約4〜7μlの試料につき用いる。
緩衝試薬溶液および希釈剤緩衝溶液は別々に、或いは2種の試薬として組合せ或
いは単一の試薬として、より好ましくは2種の試薬として包装することができる
。好適具体例において、緩衝試薬および希釈剤緩衝液は、たとえば試験パックの
ような形式で供給される。好ましくは各試験パックは次のものを含有する+8.
4mMのHEPES(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタン
スルホン酸)と150mMのMg5O,と0.4g/リットルのゲンタマイシン
硫酸塩と0.05%のナトリウムアジドとを含有する緩衝溶液(pH7,7)に
おける、3−アミノフェニルボロン酸誘導アガロースビーズ粒子(3,5mg、
乾燥重量)の懸濁物を含有する約190μ!の緩衝試薬。希釈剤緩衝液は、次の
濃度にて安定剤と抗微生物剤とを含有する約140μlの緩衝溶液(pH9,6
)である:94.2mMのタウリン(2−アミノエチルスルホン酸)、1.65
%の魚鱗ゼラチン、1.65%のポリビニルピロリドン(K値90) 、0.4
g/リットルのゲンタマイシン硫酸塩および0.05%のナトリウムアジド。
ボロネート誘導アガロースは、最終分析条件下で用いる際に、高p Hでは凝集
する傾向を有する。これは材料の取扱および分配を困難にする。この問題を解決
するには、試薬系を試験パック内の封止2−室装置に設ける。1室は低pHの緩
衝液(緩衝試薬)におけるボロネート−アガロースを含有し、他室は希釈剤緩衝
溶液を含有する。2個の分室の内容物を分析を行う時点でのみ合し、この時点で
ボロネートアガロースのpHを最終分析pHまで上昇させる。当業゛者は、各成
分を個々に或いは組合せて順次にまたは同時に試料へ添加しうろことを認識する
であろう。好適具体例において、緩衝試薬溶液および希釈剤緩衝溶液は試料へ同
時に添加される。他の好適具体例においては、希釈剤を試料に添加した後に緩衝
試薬溶液を添加する。
好ましくは、キットはさらに第3の分離した成分として、たとえば乾燥サポニン
を含有する毛細管のような試料用の溶解剤をも含む。
検量試料および対照は、別々に包装して或いはキット内にまとめて或いは試験キ
ットで供給することができる。検量試料は、好ましくは約0〜8%、8〜16%
および16〜3o%Hb A 、c(7)範囲内のグリコ化レベルを有する還元
グリコアジド−メト−ヘモグロビンを含有する。比較は、好ましくは正常および
異常な患者範囲におけるグリコ化レベルを持った還元グリコアジド−メト−ヘモ
グロビンを含有する。
実施例1
ボロネートアガロースの作成
アガロース、すなわちファルマシア社からのCMセファロース(登録商標)CL
6Bを蒸留水で洗浄した後、100mMのMES (2−N−モルホリノエタン
スルホン酸)緩衝液(pH4,7)で洗浄した。アガロースを50%固形分まで
懸濁させ、次いで減圧下に0℃まで冷却した。66mMのmAPBA (3−ア
ミノフェニルボロン酸)を作成し、減圧下に0℃まで冷却し、次いでアガロース
に添加した。800mMのEDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミド塩酸塩)を作成し、反応混合物に添加した。この混合物を
減圧下に0℃にて1時間にわたり反応させ、次いで4Mの酢酸ナトリウムにより
反応停止させた。mAPBA誘導化アガロースを順次に100mM酢酸と50m
MNaOH/IM NaCJと100mM酢酸と50mMNaOH/LM Na
Clと次いで蒸留水とで洗浄した。洗浄したmAPBA誘導化アガロースを次い
でt(E P E S 1ull液で洗浄し、約55%固形分まで懸濁させた。
最終混合物のpHを検査し、必要に応じ7.7のpHに調整した。検量操作を実
施例2における方法にしたがい空試験パックにおける上記粒子を用いて行い、検
量曲線を作成した。
正確な検量曲線を得るため、粒子の固形物%を希釈または粒子の添加によって調
整することができる。
実施例2
アボット・ビジョン試験パックおよびアボット・ビジョン分析装置を用いるグリ
コHb法第1図に示したようなビジジン試験パックを冷蔵庫から取出す。試験パ
ックを室温にて最小30分間にわたり加温させる。
乾燥サポニンおよびヘパリンが充填されかつ試料を含有する毛細管を試験パック
の毛細管スロットに挿入する。検量試料と対照とを、試験パックの検量試料およ
び対照穴部に直接に滴下装置を用いて加える。試験パックを分析装置に入れ、「
操作」ボタンを押す。
次いで分析器は次の工程を自動的に行う;工程 説 明 註
1、ロータが回転し始める。 指定の分析順序を開始する。
バーコードを読む。
2.0−タを1800 溶解した全血試料を、挿入さRPMまで加速させ、れた
毛細管から遠心室(A)45秒間待つ。 に移す。細胞残渣を沈降させる。試薬
溶液と希釈剤緩衝液
とを試薬/希釈剤カップ(B)
の試薬および希釈剤室から
試薬/希釈剤保持室(C)に
移す。試料および試薬/希釈
剤を37℃まで加温し始める
(検量試料および対照は検量
試料および対照穴部から同じ
手順にしたがう)。
3、試験パックを90°回転 全血上澄液の1部を試料保持させる。この位置に
て 室CD)に移す。試薬と希釈250秒間保つ。 剤とをさらに混合し、試薬
/希釈剤混合物を反応室(E)
に移す。加温を終了する。
4、試験パックを一90° 全血液上澄液の1部を試料容回転させる。この位置
に 精測定室(F)に移す。
5秒間保つ。波長対を 試薬/希釈剤溶液をキュベラ選択する。空気ブランク
ト(G)に移す。アガロースを測定して記憶する。 ビーズを多孔質フィルタ(
H)希釈剤ブランクを測定し によって保持する。
て記憶する。
5、(a)試験パックを 既知容積の全血上澄液(F)90°回転させる。 を
試薬/希釈剤溶液に添加し、この位置に3秒間 その際に試薬/希釈剤溶液は保
つ。 キュベツト(G)から反応室
(E)に流入する。全血上澄
液をざっと試薬/希釈剤溶液
およびアガロースビーズと混
合し、これには混合物を反応
室(E)からキュベツト(G)
に移動させ、再び戻す。
(b)試験パックを
一90°回転させる。
(C)この位置に5秒間
保つ。
(d)工程5のa −cを
さらに5回反復する。
6.15秒間待つ。
7、(a)5秒間待つ。 全Hb濃度に比例した(b)空気ブランクを 初期吸
光度測定を行う。
測定する 測定値をさらに空気ブランク(C)試料吸光度を測 測定値を用いて
補正し、定する。 光学ドリフトにつき補償する(d)試料吸光度を
空気ブランクドリフ
トにつき補正する。
(e)補正した試料
吸光度を記憶する。
(f)工程7のa −e
をさらに2回反復する。
8、(a)試験パックを 全血上澄液を試薬/希釈250秒間保させる。 液お
よびアガロースビーズと(b)この位置に15 充分混合し、これには混合物秒
間保つ。 を反応室(E)からキュベラ(c)試験パックを ト(G)に移動さ
せると共に一90°回転させる。 再び戻す。
(d)この位置に5秒間
保つ。
(e)工程8のa−dを
さらに19回反復する。
9、(a)15秒間待つ。 未結合Hb濃度に比例した最(b)空気ブランクを
終吸光度測定を行う。測定値測定する。 をさらに空気ブランク測定値(C)
試料吸光度を測定 により補正し、光学ドリフトする。 につき補償する。
(d)空気ブランク
ドリフトにつき試料
吸光度を補正する。
(e)補正した試料
吸光度を記憶する。
(f)5秒間待つ。
(g)工程9のb−fを
さらに2回反復する。
10、回転を停止する。
11、データを処理する。 最初の3回の試料測定値を平均し、A、とじて記憶
する。
最後の3回の試料測定値を平
均し、A1として記憶する。
上記データ換算にしたがい計
算を行う。
12、結果を印刷する。
実施例3
検量試料および対照材料作成
^、チアジド−トーヘモグロビン(牛)の作成1、牛赤血球から血漿を20mM
の等張燐酸塩緩衝塩水で洗浄除去した。
2、赤血球細胞を、0.OIMの燐酸塩緩衝液を用(1凍結/解凍することによ
り低張性衝撃によって溶解させる。
3、ヘモグロビンを19.5g/dl Hbまで分子量10.000のカットオ
フのフィルタによる限外濾過で濃縮した。pHを2N NaOHにより7.2〜
7.8に調整した。
4、Hb溶液における脂質を40g/Lのエアロシル380(パン・ウォーター
ス社)により抽出した。この混合物を4℃にて1〜18時間攪拌した。混合物を
4℃にて4200rpmで10分間にわたり遠心分離し、ヘモグロビンを回収し
て濾過した。ヘモグロビンを20mMの燐酸塩緩衝塩水に対し分子量10、・0
00のフィルタを用いて透析濾過した。
5、ヘモグロビンを1.3・Xモル過剰のフェリシアン化カリウムを用いて2〜
8℃で30〜40分間にわたリメトーヘモグロビンまで酸化させた。
6、メト−ヘモグロビンを、3×モル過剰のナトリウムアジドを添加して2〜8
℃で15〜30分間にわたりアジド−メト−ヘモグロビンまで変換させた。
7、この材料を分子量to、oooのカットオフフィルタにより透析濾過した。
溶液のpHを7,3〜7.5に調整し、抗微生物剤を添加した。
8、濃度を約19.5g/djヘモグロビンに調整した。
9、この材料を滅菌濾過し、2〜8℃にて貯蔵した。
B、グリコヘモグロビン保存溶液の作成1、無水グルコースをアジド−メト−ヘ
モグロビンに添加し、2〜8℃で30分間混合して250mMのグルコース最終
濃度を得た。
2、この溶液を、30〜40%のグリコ化レベルに達するまで37℃にて保温し
た。
3、溶液を分子量io、oooのフィルタにより2〜8℃にて20mM燐酸塩緩
衝塩水に対し透析して、未反応グルコース(≦5mg/dl)を除去した。
4、グリコヘモグロビンを分子量10.000〜30゜000のカットオフフィ
ルタを用いる透析濾過により約19.5g/dlまで濃縮した。
5、ヘモグロビン/グルコースアダクトを、10×モル過剰のシアノ硼水素化ナ
トリウムを2〜8℃で添加する還元によって安定化させた。
6、還元の完結を、45℃にて材料を熱処理することにより試験した。必要に応
じ、工程5を反復した。
7、ヘモグロビンを燐酸塩緩衝液で透析した。
8、ヘモグロビン濃度を19.5g/dlに調整した。
9.9)Iを7.4に調整し、溶液を滅菌濾過すると共に2〜8℃で貯蔵した。
C1非グリコヘモグロビン保存溶液の作成この溶液は、グルコースを添加しない
以外はグリコヘモグロビン保存溶液と同様に作成した。
D、グリコおよび非グリコ保存溶液の混合物を作成することにより最終的な検量
試料および対照溶液を作成した。
実施例4
ヘモグロビンをグリコ化する方法の最適化非酵素的ヘモグロビン反応を用いて、
液状の安定グリコヘモグロビン検量試料もしくは対照のインビトロ合成に関する
方法を開発した。実施例3における方法にしたがい牛赤血球から作成した新鮮ま
たは凍結のアジド−メト−ヘモグロビンを37℃にて種々の時間にわたり250
mMのグルコース(100mjの19. 5 g/di アジド−メト−ヘモグ
ロビンに対し、4.53gのグルコース)と共に培養した。未反応グルコースを
ゲル濾過によって除去し、グリコアジド−メト−ヘモグロビンを過剰のシアノ硼
水素化ナトリウムで還元した。還元の副生物を20mM燐酸塩緩衝塩水に対する
透析によって除去し、全グリコヘモグロビン%をl5o−jab Glyc−A
f f in親和性カラム法によりて分析した。結果を第3表に示す。
第3表
牛ヘモグロビンの時間経過
第4表
ヒトヘモグロビンの時間経過
144 63、0
ヒトヘモグロビンを同様にグリコ化し、結果を第4表に示す。
凍結貯蔵したヒトヘモグロビンを用い、63%の最大全グリコ化%が約144時
間後に観察され、その時点でヒトヘモグロビンは凝集し始めた(第4表)。
全グリコ化%に対するグルコース濃度と牛ヘモグロビンとの経時比較は、グリコ
化法における2つの重要な因子を示した(第3図)。第1に最大グリコ化%はグ
ルコース濃度の増加と共に増大し、第2にグリコ化%の速度はより高いグルコー
ス濃度にて加速された。両回子はグリコ化過程を最適化するのに貢献する。
24時間にわたる45℃での熱処理がシアノ硼水素化ナトリウム(N a CN
B Ij3)の効果を示す有効な指標であることを証明するため、高レベルの
検量試料を45℃にて種々の濃度のNaCNBHと共に保温した。種々の量のN
a CN B H3を検量試料におけるヘム濃度に基づき高レベルの検量試料
に添加して、第5表に示す最終濃度を得た。各溶液を2つの部分に分割し、一方
を45℃にて24時間保温し、他方を2〜8℃で貯蔵した。この実験からのデー
タを第5表および第4図に示す。
この実験は、適量で存在する場合のグリコヘモグロビンの安定化に関するN a
CN B H3還元の効果およびN a CN B H3還元のためのモニタ
ーもしくは対照として使用する45℃熱処理の効果を示す。
第5表
グリコヘモグロビン安定性:24時間の45℃熱処理IM濃度
NzCNBH,2〜8℃比較 24時間45℃ 、差ストレス
OmM 11.68% 12.69% −14,0%lsM 傘13.99%
12.63% −10,0%5sM 14.55% 13.14% −10,0
%105M 14.66% N、 60% −7,0%20mM 14.74%
14.14% −4,0%305M 14.8541 14.60% −1,
611%40aM i4.94% 14.1111% −040jl*カラム漏
れを示す。
グリコ牛アジドーメトーヘモグロビンのシアノ硼水素化ナトリウム還元が非グリ
コ非還元アジド−メト−ヘモグロビンの安定性と比較してヘモグロビン(Hb)
の安定性を増大させることを証明するため、グリコ化された還元試料につき約1
7. 5 gy’dl Hbおよび非グリコ非還元試料につき18.1g/dl
lの濃度における各1部を45℃にて保温し、同じ濃度の対照を2〜8℃にて貯
蔵した。それぞれの試料を所定の時間間隔で34日間にわたり定期的に採取し、
ヘモグロビン濃度を測定した。第6表および第5図における結果は、グリコ化さ
れた還元中アジドーメトーヘモグロビンが非グリコ非還元型よりも安定であるこ
とを示す。
還元型のグリコ牛アジドーメトーヘモグロビン検量手段の長期間安定性を一20
℃および2〜8℃での保温によって測定した。各標準の1部を全部で309日間
にゎたりHbAlc%につき毎日試験した。第7表および第6図における結果は
、検量手段が一20℃もしくは2〜8℃のいずれかにおける長時間の貯蔵につき
安定であることを示す。悪作用は認められなかった。
了
ローNPI r’−小====呂;=工世;S −雪国
第7表
安定化検量試料の長期安定性
一20℃で貯蔵した検量試料
2〜8℃にて貯蔵した検量試料
実施例5
予想値
本発明の方法を用い、グリコヘモグロビン基準範囲は4.1〜5,7標準化%H
bAIcであることが決定された。この範■は101名の明かに健康な個人(女
性41名、男性60名)鴫試験して確認された。基準範囲は特定の患者集団に応
じて変イ1することがある。
実施例6
再現性
本発明による方法の再現性を、1つの分析装置を用いて5E間にわたり4反復で
2レベルのグリコヘモグロビン比較をフィールド試験することにより決定した。
総平均および変動係数(% CV )を変動分析から計算した。全%Cvは日内
変化及0日間変化に基づくものの合計である。
アボット・ピシリン 平均 日内
グlJ:ffHb対照 %Hb^1. %CV 全XCv対照I 5.3 3.
2 3.2
対照n l(12,22,6
実施例7
精度
%グリコHb試験を決定するための本発明による方法の1 精度を、この試験と
HPLCグリコヘモグロビン分析または1solab Glyc Affin分
析(親和性による全グリコヘモグロビン)との比較によりヒト全血液試料のフィ
ールド試験にて決定した。%グリコヘモグロビンを測定するための本発明による
方法とグリコヘモグロビンのHPLC法との間の相関試験を行った。
□
グリコヘモグロビンを測定する本発明の方法を病院環境で行い、4.5〜13.
3%のグリコヘモグロビン値の範囲にわたる51人のヒト全血試料を用いて病院
で行った。それらの結果を、HPLCグリコヘモグロビン法を用いて得られた結
果と相関させた。
全試料を現場にて単一試料で分析した。ピシリン・グリコ11 bシステムとH
PLCグリコヘモグロビンシステムとの相関関係を第7図に示す。直線回帰分析
は次の結果を与えた:比較:ビジョン・グリコHb(Y輪)対HPLCグリコヘ
モグロビン(X軸)
試料数=51
傾斜=0.98
切片=0.33
相関係数=0.983
偏り=0.2
Sd線=0.4
Sd差=0.4
t=0.40
統計的または臨床的な有意差は観察されなかった。
グリコヘモグロビン対Tsolab GIycAffin試験につき本発明の方
法を用いて、次の相関関係が観察された:N=51
傾斜=0.652
切片=1.40
相関係数=0.991
偏り=−1,6
Sd線=0.3
Sd差=1.3
対t=−8,97
非対t=−2,69
これらデータを第8図にプロットする。
実施例8
妨害
下記の一般的に処方した薬剤を本発明の方法に対する妨害につき、添加物質を含
有する全血試料を試験して検査した。所定濃度における次の物質は、特定レベル
のHbAl−含有する試料に対し10%未満の妨害を示した:
試験物質 濃 度 %1lbA、c
内生物質
ビリルビン 3G■#JI 4.7
グルコース 800■/d14.5
トリグリセリド 1300■/dg 4.8タイプ■糖尿病につき処方した薬剤
クロルプロパミド 75■/d15.5グリピジド 50■#J 5.5
グリブリド 50■/d15.5
トルブタミド 1.00■#1 5.1次の物質は、示した試料濃度にて本発明
の方法を有意には妨害しなかった。有意の妨害とは、正常範囲の試料につき試験
結果にて10%より大きい差をもたらすものとして規定される。
一般的処方薬剤 試験した濃度
アセトアミノフェン(タイレノール)30■/d1アセチルサリチル酸(アスピ
リン) 50nl/dj!アスコルビン酸(ビタミンC) 10■/dlカフエ
イン 6■/d1
セホキシチン 2.5■/djl
ンメチジン(タガメット)7.5■/dlL−ドーパ 10■/d1
エピネフリン(アドレナリン)0.1■/d1ハイドロクロルチアジド 5■/
dl
イソニアシト 25■/dl
ペニシリンG 1000単位/dl。
フェニトイン(シランチン) 8■/dlサリチル酸 40■/d1
テオフイリン 8■/dl
ワルフアリン(クマリノ)10■/dl実施例9
ヘモグロビン変種(異常ヘモグロビン)グリコヘモグロビンの親和性結合法は、
ヘモグロビン変種による最小の妨害を示す[Mijdle、 F、^0等、 B
iochem、1.209ニア71−779. 1983; Ab目hI、 E
、C,’i J、’ L*b、 Cl1n、 Med、102:1g?−197
,1983; T山*+’、 D、劃Cl’in、 Chew、 A山12g+
6ト67゜1983; Y山coll、R,W等、 Cl1n、Chew、29
+543−545. H83]。
ヘモグロビンF(胎児)、sおよびCは、本発明に記載した試験を妨害しないこ
とが判明した。同様に、他の変種も妨害しないと思われる。
FIG、 2
%HbAlc
FIG、 3
時間 (HR3)
FIG、4
NaCNBH3(mM)
FIG、5
時間(日数)
FIG、6
グリコ牛アジドーメトーヘモグロビン
検量試料安定性・−20’C貯蔵
グリコ牛アジドーメトーヘモグロビン
検量試料安定性:2〜8℃貯蔵
ビジョン−グリコ Hb
国際調査報告 In+−8+、、m+ulsl、l、1way。、。
国際調査報告 l=t、、a+++uani甲嘘@n〜0フロントページの続き
(72)発明者 イングランド、バーバラ・ジエイアメリカ合衆国、ライスコン
シン・53211、ミルウオーキー、イースト・ケンウッド・ブウルバード・1
808
(72)発明者 アニーノ、メアリー・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60
004、アーリントン・ハイツ、ノース・ハイランド・アベニュー・2616
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.基質結合性および基質非結合性の物質を含有する試料中における、基質結合 性物質の相対量を測定するに際し:(a)試料を最終測定濃度まで希釈し;(b )希釈試料の初期吸光度を測定し;(c)固体基質と希釈試料とを合し; (d)希釈試料と固体基質とを固体基質に対する基質結合性物質の実質的結合を もたらすのに充分な条件下で混合し;(e)固体基質を分離し; (f)固体基質により結合された基質結合性物質の量を決定する ことを特徴とする基質供給性物質の相対量の測定方法。 2.希釈剤が固体基質を含有するが、基質結合性物質の実質的量が固体基質に結 合する前の状態で初期吸光度を測定する請求の範囲第1項に記載の方法。 3.方法を自動化する請求の範囲第1項に記載の方法。 4.固体基質により結合された基質結合性物質の量を、固体基質の分離後に試料 の吸光度を測定して決定する請求の範囲第1項に記載の方法。 5.基質結合性物質の相対量を吸光度測定値から計算する請求の範囲第4項に記 載の方法。 6.試料における基質結合性物質の相対量を、検量試料から作成された標準曲線 により決定する請求の範囲第1項に記載の方法。 7.工程a、bおよびcを実質的に同時に行う請求の範囲第1項に記載の方法。 8.結合した基質結合性物質の測定を、初期吸光度測定値を得る前に生じた固体 基質に対する基質結合性物質の結合を補償するよう調整する請求の範囲第7項に 記載の方法。 9.固体基質が、基質結合性物質のための結合剤を付着させた粒子からなる請求 の範囲第1項に記載の方法。 10.粒子を吸光度の測定に際し試料から分離する請求の範囲第9項に記載の方 法。 11.分離が、試料と粒子との混合物を粒子を保持するような多孔質フィルタに 通過させることからなる請求の範囲第10項に記載の方法。 12.グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する全血試料中における、グリ コヘモグロビンの相対量を測定するに際し:a.グリコおよび非グリコヘモグロ ビンを放出するよう試料を処理し; b.この試料を最終測定濃度まで希釈し;c.希釈試料の初期吸光度を測定し; d.固体基質と希釈試料とを合し; e.希釈試料と固体基質とを、固体基質に対するグリコヘモグロビンの実質的結 合をもたらすのに充分な条件下で混合し;f.固体基質を分離し; g.固体基質により結合された基質結合性物質の量を決定する ことを特徴とするグリコヘモグロビンの相対量の測定方法。 13.固体基質により結合された基質結合性物質の量を、固体基質の分離後に試 料の吸光度を測定して決定する請求の範囲第12項に記載の方法。 14.グリコヘモグロビンの相対量を吸光度測定値から計算する請求の範囲第1 3項に記載の方法。 15.固体基質がグリコヘモグロビンのための結合剤を付着させた粒子からなる 請求の範囲第12項に記載の方法。 16.結合剤がジヒドロキシボリル成分を有する基である請求の範囲第15項に 記載の方法。 17.ジヒドロキシボリル成分を有する基が3−アミノフェニルボロン酸から誘 導される請求の範囲第16項に記載の方法。 18.結合剤が抗−グリコヘモグロビン抗体から誘導される請求の範囲第15項 に記載の方法。 19.結合剤がレクチンから誘導される請求の範囲第15項に記載の方法。 20.工程b、cおよびdを実質的に同時に行う請求の範囲第12項に記載の方 法。 21.結合したグリコヘモグロビンの測定を、初期吸光度測定値を得る前に生じ た固体基質に対するグリコヘモグロビンの結合を補償するよう調整する請求の範 囲第20項に記載の方法。 22.サポニンを試料に添加してグリコおよび非グリコヘモグロビンを遊離させ る請求の範囲第12項に記載の方法。 23.グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する全血試料中におけるグリコ ヘモグロビンの相対量を測定するに際し:a.グリコおよび非グリコヘモグロビ ンを放出するよう試料を処理し; b.最終測定濃度を有すると共にMgSO4を含有する試料の希釈溶液を作成し ; c.希釈試料の初期吸光度を測定し; d.希釈試料と、グリコヘモグロビンのための結合剤を付着させた粒子からなる 固体基質とを合し;e.希釈試料と固体基質とを、固体基質に対するグリコヘモ グロビンの実質的結合をもたらすのに充分な条件下で混合し;f.固体基質を分 離し; g.固体基質により結合されたグリコヘモグロビンの量を決定する ことを特徴とするグリコヘモグロビンの相対量の測定方法。 24.希釈試料におけるMgSO4の最終濃度が約10〜500mMである請求 の範囲第23項に記載の方法。 25.希釈剤がMgSO4を含有する請求の範囲第23項に記載の方法。 26.希釈試料が、初期吸光度を測定する前に少なくとも1種の蛋白質安定剤を 含有する請求の範囲第23項に記載の方法。 27.蛋白質安定剤をゼラチン、ポリビニルビロリドン、カゼインおよびアルブ ミンよりなる群から選択する請求の範囲第26項に記載の方法。 28.試料におけるグリコヘモグロビンの相対量を分析するためのキットにおい て、別々に包装された成分が:a.緩衝剤とMgSO4とグリコヘモグロビンの ための結合剤を付着させた固体基質とを含有する試薬溶液;およびb.試料およ び試薬溶液と混合した際に約7.8〜9.6の範囲の数値にpHを維持しうる希 釈剤緩衝溶液からなることを特徴とするグリコヘモグロビンの相対量の分析キッ ト。 29.MgSO4が、試薬溶液と希釈剤緩衝液とで希釈された試料におけるMg SO4の最終濃度を約10〜500mMにするような濃度で存在する請求の範囲 第28項に記載のキット。 30.希釈剤緩衝液がゼラチン、ポリビニルビロリドン、カゼインおよびアルブ ミンよりなる群から選択される少なくとも1種の蛋白質安定剤を含有する請求の 範囲第28項に記載のキット。 31.全血試料からグリコおよび非グリコヘモグロビンを放出する試薬をさらに 含む請求の範囲第28項に記載のキット。 32.1種もしくはそれ以上の検量試料および対照をさらに備える請求の範囲第 28項に記載のキット。 33.MgSO4とグリコヘモグロビンのための結合剤を付着させた固体基質と を含有する試薬溶液からなることを特徴とする試料におけるグリコヘモグロビン の相対量の分析キット。 34.グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安 定なグリコヘモグロビン溶液を作成するに際し: a.赤血球を洗浄し; b.ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ;c.脂質をヘモグロビン溶液 から除去し;d.ヘモグロビンをメト−ヘモグロビンまで酸化し;e.メト−ヘ モグロビンをアジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト−ヘモグロビン まで変換し;f.グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メ ト−ヘモグロビンに添加してグリコアジド−メト−ヘモグロビンもしくはグリコ シアノ−メト−ヘモグロビンを生成させる ことを特徴とする安定なグリコヘモグロビン溶液の作成方法。 35.赤血球が哺乳動物赤血球である請求の範囲第34項に記載の方法。 36.ヘモグロビンを、フェリシアン化カリウムを用いてメト−ヘモグロビンま で酸化する請求の範囲第34項に記載の方法。 37.メト−ヘモグロビンを、ナトリウムアジドを用いてアジド−メト−ヘモグ ロビンまで変換する請求の範囲第34項に記載の方法。 38.メト−ヘモグロビンを、シアン化物を用いてシアノ−メト−ヘモグロビン まで変換する請求の範囲第34項に記載の方法。 39.グリコアジド−メト−ヘモグロビンもしくはグリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンを還元剤により還元することをさらに含む請求の範囲第34項に記載の方 法。 40.還元剤がシアノ硼水素化ナトリウムである請求の範囲第38項に記載の方 法。 41.還元の完結を、昇温熱処理試験により試験する請求の範囲第38項に記載 の方法。 42.グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安 定なグリコヘモグロビン溶液を作成するに際し: a.赤血球を洗浄し; b.ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ;c.脂質をヘモグロビン溶液 から除去し;d.ヘモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換し;e.グ ルコースをカルボニル−ヘモグロビンに添加してグリコカルボニル−ヘモグロビ ンを生成させることを特徴とする安定なグリコヘモグロビン溶液の作成方法。 43.グリコカルボニル−ヘモグロビンを還元剤により還元することをさらに含 む請求の範囲第42項に記載の方法。44.還元剤がシアノ硼水素化ナトリウム である請求の範囲第43項に記載の方法。 45.グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安 定な非グリコヘモグロビン溶液を作成するに際し: a.赤血球を洗浄し; b.ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ;c.脂質をヘモグロビン溶液 から除去し;d.オキシ−へモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換し 、またはヘモグロビンをメト−ヘモグロビンまで酸化し; e.メト−ヘモグロビンをアジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト− ヘモグロビンまで変換することを特徴とする安定な非グリコヘモグロビン溶液の 作成方法。 46.グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安 定な非グリコヘモグロビン溶液を作成するに際し: a.赤血球を洗浄し; b.ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ;c.脂質をヘモグロビン溶液 から除去し;d.ヘモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換することを 特徴とする安定な非グリコヘモグロビン溶液の作成方法。 47.グリコアジド−メト−ヘモグロビン、グリコシアノ−メト−ヘモグロビン またはグリコカルボニル−ヘモグロビンからなることを特徴とするグリコヘモグ ロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定なグリコへモグロ ビン溶液。 48.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモ グロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンからなることを特徴とする グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定なグ リコヘモグロビン溶液。 49.アジド−メト−ヘモグロビン、シアノ−メト−ヘモグロビンまたはカルボ ニル−ヘモグロビンからなることを特徴とするグリコヘモグロビンの分析にて検 量試料もしくは対照として有用である安定な非グリコヘモグロビン溶液。 50.試料におけるグリコヘモグロビンの相対量を測定する方法に使用するため の別々に包装された安定なグリコヘモグロビン標準のキットにおいて: a.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約0〜10%の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有す る溶液と: b.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約10〜27%の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有 する溶液と; c.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約22〜44%の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有 する溶液と; d.アジド−メト−ヘモグロビン、シアノ−メト−ヘモグロビンまたはカルボニ ル−ヘモグロビンの溶液とからなることを特徴とするキット。 51.各成分が: a.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約2〜7%の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有する 溶液と; b.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約13〜21%の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有 する溶液と; c.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約26〜36%の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有 する溶液と; d.アジド−メト−ヘモグロビン、シアノ−メト−ヘモグロビンまたはカルボニ ル−ヘモグロビンの溶液とからなる請求の範囲第45項に記載のキット。 52.試料におけるグリコヘモグロビンの相対量を測定する方法に使用するため の安定なグリコヘモグロビン標準のキットにおいて: a.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約4〜6%の範囲内で測定可能な比率のヘモグロビンAlcと共に含有 する溶液と; b.還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグ ロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有 量に対し約8%より高い測定可能な比率のヘモグロビンAlcと共に含有する溶 液と からなることを特徴とするキット。
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