JPH06508690A

JPH06508690A - グリコヘモグロビンの迅速測定

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Publication number: JPH06508690A
Application number: JP5501132A
Authority: JP
Inventors: フイーチナー，マイケル・デイ; ランプ，ジヨン・エム; イングランド，バーバラ・ジエイ; アニーノ，メアリー・ジエイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1991-06-19
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2017-11-05
Also published as: JP3400991B2; US5589393A; WO1992022818A1; EP0590047A1; JP3340129B2; CA2102526A1; US5686316A; JP2002022747A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】グリコヘモグロビンは、ヘモグロビン分子に各種の糖類（最も一般的にはグルコース）が結合して生成される一連のヘモグロビン少量成分を意味する一般的用語である。糖尿病の観点からしてこれらヘモグロビン少量成分のうち最も重要なものは、ヘモグロビンＡ　である。これは、ヘモグロビンＡの一方もしＣくは両方のβ鎖におけるＮ−末端アミノ酸残基バリンにグルコースが結合して形成される［Ｇｏｌｌｓｌｅｉｎ、　＋１．Ｅ、等、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ。

３２：Ｂｅ４−８７０．　１９８６コ　。

ヒト赤血球はグルコースを自由に透過しつる。各赤血球内には、グリコヘモグロビンがヘモグロビンＡ（天然の正常型）から周囲グルコース１度に比例した割合で形成される。この反応は自発的であって酵素触媒を要しないものの、充分に遅く、このため赤血球の寿命（１２０日）の間にはヘモグロビンのごく一部が修飾されるだけで、かつこれは不可逆性である。その結果、グリコヘモグロビンは過去の血糖値の加重「移動」平均の日間となり、より最近の血糖値がより大きく影響する［５ｉｎ（Ｂ＋等、＾ｎｎ、ｃＩｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、２６：２１３− ２１９．　１９８９］。

グリコヘモグロビンのレベル上昇は真性糖尿病に関連することが知られている。

非糖尿病患者ではグリコヘモグロビンは全ヘモグロビンの約５％のレベルにて存在するのに対し、糖尿病患者はこの量の２〜４倍を示す。グリコヘモグロビンレベルは血糖値の短期変動には比較的影響を受けず、糖尿病患者における血糖管理の状態を比較的正確に反映する。その結果は、過去１〜３ケ月にわたる期間平均血糖濃度を示す。グリコヘモグロビン測定は糖尿病患者におけるグルコース不耐性程度の評価および真性糖尿病の管理に使用される［Ｌ＠ｔｌｅｒ、＾ｎｎ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６：２Ｎ−２１９，１９８Ｌ　ＫｅｎｎｅｄＦ等、　Ｂ＋、Ｍｅｄ、　Ｂｅ１ｌ、４５：１７４−１９０．１９ｇ９；　ＦＩｎｅｃｋｔｇｅ＋等、１．　Ｃｈｒｏｍ＊ｌｏｇｒ、４２９：２７９−２９２゜１９１１８；　Ｇｏｌｄｓｌｅｉｎ、等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈ■、３２＋Ｂ６４−７０．　１９８６；Ｌ＋ｔｅｎ＋ｅｎ、　Ｄｅｎ、　Ｍｅｄ、　Ｂｕｌｌ、３２：３０９−３２８．　１９１１５；　Ｇｏｌｄｓｌｅｉｎ等、ＣＲＣＣ’＋ｉ１．’　Ｒｚｗ、Ｃｌ１ｎ、Ｌｔｂ、Ｓｃｉ、２１：１８７−２２１　１９８４゜Ｐｅａｃｏｃｋ、１．Ｃｌ１ｎ、Ｐ＊１ｈｏ１．　３７：　８４１−８５１．　１９８４：　ＭｉｚｄｅｌＩ等。

＾ｎｎ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｔ　２１：２−１５＋　１９８４：　ＭＢｅ＋等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｗ＾ｃｌ＊　！２７：１４７−１８４．　１９８３；　Ｇ１ｂｂｔ７．’　Ｍｅｄ、Ｃｌ１ｎ、Ｎｏｒｔｈ　＾−６６：１３０９−１３１５．　１９８２　Ｊ。

グリコヘモグロビンを、ヘモグロビンＡｌｔもしくはヘモグロビンＡ１として或いは全グリコヘモグロビンとして測定するには種々の方法がある（イオン交換クロマトグラフィー、チオバルビッール酸法、等電点照準法および親和性クロマトグラフ分析）　［Ｃｏ１（Ｒ，Ａ等、　Ｍｅｔ昌ｂｏ１口園２７：２８９−３０１．　１９７８；　Ｎｌ１ｈＩｎ。

Ｄ、Ｍ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｌ、　２７：ｌ２６１−１２６３．　１９０；　ＩＩｏｏ＋ｅ、１．Ｃ，等、　ｌｕｕ＋。

Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｔ＋ｉ、　Ｎ：８Ｓ−９１，１９Ｎ　］　、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ヘモグロビンＡｌｃを含めて多くのグリコヘモグロビン物質は中性ｐＨにてヘモグロビンＡＣよりも陽帯電が低く、陰帯電樹脂にあまり結合しない［Ｒｏｓｅｆｆｉｌｈｓｌ、　Ｐ、に、等。

Ａｍ　１．　Ｃ１口　Ｐｔ１ｈｏ１．７５：４５−４９．　１９８１；米国特許第４．４０７．９６１号、米国特許第４．６４９゜１２２号］。ヘモグロビンＡｌｔをヘモグロビンＡ１１ｂフラクンランから分離する幾つかの方法が記載されている［Ｇｏｌｌｓｌｅｉｎ、Ｄ、Ｅ　等、　［ｌｉ＊ｂｅｌｅ＋　３１ニア［１−７１１９８２；Ｍ＠ｑｕ＊ｒｌ、　Ｆ、Ｌ等、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｓ、Ａｃｔｓ　１０！ｌ：３２９−３３２．　１９８０；Ｉｎｎ？＋、　Ｍ、Ｄ、等、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　２：５３−５８．　１９７８；　Ｃｌｔ＋ｋｅ、１．Ｔ９等。

１１０ｂｅｌｔ　ＭｅＮｂｏｌ、５：２９３−２９６．　１９７９；　ＤＩｔｉ３　１．Ｅ、等。

Ｄ目ｂｔｌｓ＋　２７：ＩＯ２−１０７，１９７８；　Ｃａｆｅ、Ｒ，Ａ。等、　Ｍｅｌ＊ｂｏｌｉｓｓ　２７：２８９−３０１．　１９７８．米国特許第４．３Ｎ、４９１：　Ｂｉｏ−ＲＩｄ　Ｌｓｂｏｒ１ｏ＋ｉｅ＋。

ｔｌｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ、ｃ　Ｍｉｅ＋ｏ　Ｃｏｌｗｍｎ　Ｔｅ５１　１１１＋ｗｃｌｉｏ＠　Ｍ＊ｎｗｓｌ。

Ｍ＋＋ｃｈ　１９９０］。しながら、これら方法にはいろいろの欠点を有する。

これら方法の多くは２種の緩衝液を用い、その第１緩衝液は特異結合した物質を脱着させないように未結合物質をイオン交換樹脂から溶出させる。異なるｐｔ（もしくはイオン強度で用いられ或いは競合抑制剤を含有する第２緩衝液が、特異結合した物質を溶出させるのに必要とされる。温度、ｐＨ１イオン強度およびカラム寸法が試験結果に影響を及ぼす［ＳｉｍｏＩｌ、　Ｍ。

等、Ｄｉ＠ｂｅｌｅｓ　２９＋４６７−４７４．　１９８０；　５ｃｈｅｌｌｅｋｅ＋＋３　＾、　Ｐ、　Ｍ、等１ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　２７＋９４−９９．　１９８１；　Ｃｔｓｌｌ（ｎｏｌ、　Ｍ、等、Ｊ。

Ｃｈ＋ｏ１１ｏ（ｒ。２７２：５１−６５．　１９１１３］　。さらに、これら方法は幾つかの異なる工程および数個の容器を必要とし、殆どの方法は自動化されず、或いは半自動化されるに過ぎない。

用いる方法に応じ、これら分析法の他の限界は可逆性の中間グリコ型［プレーヘモグロビン−ＡＩｃ’を含むことであり、これは分析を行う前に除去する必要がある［Ｇｏｌｄｓｌｅｉｅ、　Ｄ、Ｅ、等。

Ｄｉｇｂｅｌｅ＋　３１＋７０−７１１．　１９ｇ２；　Ｂ■ｎ、　Ｈ，Ｆ、Ｄ目ｂｔｌｔｔ　３０：６Ｎ−６１７゜１９８１：　Ｎ暑ｌｈ＊ｎ、　Ｄ、Ｍ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ　、　２７：１２６１１２６３．　１９１１１；ＭＢｔｒ、Ｔ、Ｋ　等、　Ｃｌ１ｐ、　Ｃｈｉｓ、　Ａｃｔｓ　１２７＋１４？−１８４，１９８３；Ｈｅｔｌｌｈ　ｔｎｄ　Ｐａｂｌｉｃ　Ｐｏ１ｉｃｙ　Ｃｏ＊ｍｉ目ｔｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｏ１１Ｂｓ　ｏｌＦｂｙ＋ｉｃｉｇｎ＋　Ａｎｎ、Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ、１０１ニア１０−０３、Ｌ９［１４；　Ｎｔｌｈｓ＋＋。

１１、Ｍ、　Ｃ１１Ｉ１．　Ｃｈｅｔ　２７：１Ｈｌ−１０３，１９８１］　。

高レしルの胎児ヘモグロビン、鎌状ヘモグロビンおよび他の希な状態がこの分析を阻害しうる［Ｎ１ｅｉ＊ｄｌｉｋ、Ｄ、Ｃ等、ＪＡＭ＾２２４：１７３４−１７３６゜１９７３］。

グリコヘモグロビンを測定する他の方法は、グリコヘモグロビンと結合する特異的親和性もしくは結合剤を使用する。次の特許、すなわち米国特許第４．２００．４３５号；第４．２６０．５１６号；第１．２７４．９’ｌＲ号；第４．２５５．３１１５号；および第４．４３８．２１１４号において、グリコヘモグロビンは親和性法またはヘモグロビンのアロステリック特性を用いて測定される。ドイツ特許第１５９５６９号には、親和性試薬として糖結合性蛋白が記載されている。

他のＷｌＦ［］性結合法は、グリコヘモグロビンとポロン酸（ｂｏｔＯｎｉｃ　ｒｃｉｄ）誘導体との間の特異的な錯体形成に基づいている　［Ｍｉｄ＋ｌｌｅ等、Ｂｉｏｅｈｔｔ　１．　２０９ニア７１−７７９．　１９８３；　Ｋｌｅｎｋ等。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｈ：２ＨＬ２Ｇ９４．１９８２；い目１を等、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ　。

３２：：ｌ５ＬＨ１１，１９８６、米国特許第４．２６９．６０５号；米国特許第１、８６１．７２８号、英国特許出願第２２０６４１１＾号；　１ｓｏｌ＊ｂ、Ｉｎｃ。

Ｔｓｃｈｎｉｃ＊ｌ　Ｐｗｂｌｉｃ＊口ｏｎ：Ｇｌマｃ＾山ｎ”　ＧＨｂ、ＨａＧ；Ｆｏｕｔｓｌ。

獣θ等、　Ｃｌ口、　Ｃｂｔｓ、　３４：目Ｓ−１４８，１９８１１゜親和性結合法は１１　ｂ　Ａの他にグリコヘモグロビン類も検出するが、これらはたとえばイオン交換クロマトグラフィーのような１１ｂＡ、、に対し一層特異的な方法に対し比例関係にある［Ｌｉ１ｌｌｅ等、　Ｃｌ１ＬＣｈｅｔ　３２：３５＋１ −３６０．　１９８６］　。グリコヘモグロビンに関するイオン交換分析および比色分析と同様に、親和性法も限界を有する。

これら限界の１つは、２種の異なる緩衝液を必要とすることである。第１緩衝液は、ｃｉｓ−ジオール基を持たない非グリコフラクションを溶出させる。グリコヘモグロビンが多い結合フラクションは、たとえば糖アルコールのようなカラムからグリコヘモグロビンを排除する置換剤を含有した第２緩衝液で溶出される。

さらに流速およびカラムの寸法も、親和性試薬に結合するヘモグロビンの量を制限する。

標準曲線を作成し分析精度を決定するための、グリコヘモグロビン分析に用いるのに適した安定なグリコフシル化標準または較正手段もしくは対照については種々の意見がある［Ｇｏｌｄ＋１ｅｉｎ、Ｄ、Ｅ、等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅ＋＋、３２，１０８：８６４−８７０．　１９１１６；Ｆｒｒｎｔｉｎｉ、　Ｃ，等、　Ｇ、　Ｎｔｌ、　Ｃｈｉｎ、　Ｃｌ１ｎ、９：１８７１９２．　１９８４　］　。

これら対照の中には、保存料を添加した赤血球の溶血物に過ぎないものもある［東独特許第１５０５４３号；米国特許第３５１９５７２号；英国特許第９３４４６１号］。これら物質はしばしば凍結乾燥され、使用地の実験室で再編成されて数日間〜数週間にわたり使用される　［ｌ１ｉｏ−Ｒｌｄ　Ｌｘｂｏ＋＊ｌｏ＋ｉｅ＋、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ＾ｌｅ　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏ１ａｔｎＴｅ＋ｌ　Ｉｎ５ｔ「＋１ｃｔｉｏｎ　Ｍｔｎ■ｌ、　ＭＩ＋ｃｈ　１９９０　］　ｏ　このようにしたときの物質の安定性は充分に説明されていない。シアノメテモグロビン、オキシヘモグロビン−ポリヒドロキシ化合物；および−酸化炭素型のヘモグロビンを用いて、安定なヘモグロビン標準を形成するよう試みた人もいる［ドイツ特許第３３１１４５８号；ヨーロッパ特許第７２４４０号；およびＭｏ　＠ＣＩ、Ａ　等、］、Ｃｌ１ｎＣｈｅｆｆｉ、　Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２３：３６１−３６４．　１９８５］　ｏ現地で作成される対照（一般に正常および糖尿病の試料から作成した全血もしくは充填赤血球の溶血物）を用いることにより、多くの実験室は分析精度を管理している［Ｇｏｌｄｓｌｅｉｎ、　Ｄ、Ｅ、　Ｄ口ｂｅｌｅ＋　３１ニア（１−７８，１９８２：　Ｃｏ１ｅ、Ｒ八　等Ｍｅ１ｇｂｏ１口ｍ　２７：２８９−３０１．　１９７８：Ｓｉｍｏｎ、　Ｍ　等、　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｎ＋、２８：１９５−１９８．　１９８２；　Ｐ１＋ｋｅｒ、　Ｋ、Ｍ等、Ｃｌ１ｎ、　ＣｈｅＭ、２７：ｆ＋６９−６７２．　１９８１］　。これらの対照は、安定性を保つよう精密に制御された条件下で貯蔵せねばならない［Ｌｌｉｎｄｅ＋、　Ｏ，Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　２８：９６−９９　（１９Ｂ２）］　。

実施が容易であり、阻害を受けず、かつたとえばｐＨおよび温度のような実験変動因子に対し比較的敏感でないグリコヘモグロビン分析については、引き続き要求がある。さらに、この種の分析に用いるための安定な標準および対照、並びに標準の作成方法も期待されている。

発明の要点本発明は、検出すべき基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料において、基質結合性物質の比率もしくは濃度を検出すると共に定量する方法に関するものである。より詳細には本発明は、検出すべき基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料において、基質結合性物質の比率もしくは濃度を検出すると共に定量する迅速法に関するものである。

本発明によれば、基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料の吸光度を測定し、特異的結合剤もしくは親和性剤を付着させた固体基質を添加する。結合反応における基本的成分は試料と、結合剤を付着させた固体基質と、結合反応に適合性の緩衝溶液とである。

結合反応の後、試料の吸光度を適する検出装置を用いて測定する。試料の量もしくは相対活性は、固体基質により結合された結合性物質の量に逆相関する。

したがって本発明の一態様は、基質結合性物質を含有すると思われる試料におけるこの基質結合性物質の存在および量を決定する方法に関し、この方法は基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料の初期吸光度を測定し、結合性物質に対し特異的な結合剤を付着させた固体支持体に基質結合性物質を結合させ、基質結合性物質が除去され或いは減少した試料の吸光度を測定し、次いで基質結合性物質の比率を計算することを含む。

本発明の好適態様は、グリコヘモグロビンと非グリコへモグロビンとの両者を含有する試料において、グリコヘモグロビンの相対量を決定する方法に関する。グリコヘモグロビンを特異的に結合する結合剤もしくは親和剤を固体基質に付着させ、これを混合すると共に粒子を試験溶液から分離するようにした容器に仕込む。２回の吸光度測定を試験溶液につき行うが、１回目は試薬、希釈剤と試験溶液との混合直後に行い、さらに他方の吸光度測定はグリコヘモグロビンが固体基質に実質的に結合した後に行う。分析の化学的原理は、３−アミノフェニルボロン酸に対するｃｉｓ−ジオール化合物の親和性結合に基づいている。全グリコヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃとの間には直線的関係があるので、％ヘモグロビンへ−こ相当する単位の基準化および記録が可能となる。

本発明の他の態様は、グリコヘモグロビンの測定に用いるための安定な液体グリコおよび非グリコヘモグロビン溶液の製造方法に関するものである。

さらに他の態様において本発明は、グリコヘモグロビンの測定に用いるためのキットに関するものである。

さらに他の態様において本発明は、糖尿病患者の診断および管理に際し有用なグリコヘモグロビン比率の決定方法を提供する。

図面の説明本発明のこれらおよび他の目的、特徴および多くの利点は添付図面を参照する以下の詳細な説明から一層よく理解されるであろう。

第１図は本発明の好適実施例に用いる試験パックの図解の平面図である。試験パックの詳細については、多孔質フィルタを含むよう改変した米国特許第４．８８３．７６３号に記載されている。

第２図は、アボット・ビジョン（登録商標）分析器にて本発明の方法により決定された牛アジドーメトーヘモグロビン検量手段を用いるグリコヘモグロビンの標準曲線である。

第３図はグルコース濃度の関数としての牛ヘモグロビンのインビトログリフ化における経時的試験である。

第４図は４５℃にて２４時間のストレスにより示したシアノ硼水素化ナトリウムでの還元によるグリコ牛アジドーメトーヘモグロビンの安定化を示す。

第５図はグリコ化されかつ還元されたヘモグロビンとグリコ化されずかつ還元されないヘモグロビンとの比較安定性を示す。

第６図は一２０℃および２〜８℃で貯蔵したグリコ牛アジドーメトーヘモグロビン検量物質の長期安定性を示す。検鍛ｆ段Ａ＝４．４〜５．０９６グリコヘモグロビン（Ｉ（ｂＡ、ρ　；検定手段Ｂ＝１２．４〜１４．０％ＨｂＡ、ｃ；検定手段Ｃ＝２０．７〜２３．３９６１１ｂＡ、、。

第７図は本発明による方法とＨＰ　Ｌ　Ｃ−グリコＨｂ法との間の相関関係を示す。相関係数（ＣＣ）＝０．９７９゜第８図は本発明による方法とイソラブＧｌｙｃ−Ａｆ　ｆ　ｉｎヘモグロビン分析との間の相関関係を示す。相関係数（ＣＣ）＝０．　９９１゜本発明により解決された主たる問題は、２回の吸光度測定が必要とされる方法の自動化であった。１回目の測定は試料における結合性物質および非結合性物質の合計濃度に比例するものであり、他方は結合反応の後の結合もしくは遊離のいずれかのフラクションに比例するものである。両側室を単一の試験溶液から単一の試験容器内で行いたいという点に困難の原因がある。

これは、自蔵の試薬容器を用い、慣用のカラムクロマトグラフ分離または緩衝液の変更なしに、好ましくは自動化装置で行うことができる。

本発明の一態様は、試料における基質結合性物質と基質非結合性物質との全体に対する基質結合性物質の比を決定するための連続法（好ましくは自動化法）を提供し、この方法は試料を固体基質と混合し、基質結合性物質と基質非結合性物質とを含有する試料の初期吸光度を測定し、基質結合性物質が除去された試料の吸光度を測定し、次いで基質結合性物質の比を計算することからなっている。固体基質は、基質結合性物質のための結合剤を付着させた粒子で構成することができる。これら粒子は吸光度の測定に際し試料から分離される。これは数種の手段によって行うことができ、その１つは試料と粒子との混合物をこれら粒子を保持する多孔質フィルタに通すことである。

基質結合性物質は、結合剤に対し親和性を有する任意の分子とすることができる。この種の結合性物質は炭水化物、蛋白質、核酸、脂質などを包含する。結合性物質は動物、植物、細菌、酵母、原生動物、ウィルス、組換産生させた物質などから誘導することもできる。試料から基質結合性物質を除去したとき、試料に測定可能な変化が生じ、これをたとえば分光光度計、蛍光度針などの装置によって検出することができる。好ましくは、測定可能な変化は分光光度計を用いて測定されるような試料の光学密変変化である。基質結合性物質が試料から除去され或いは部分的に除去されたことを検出するには、増幅システムを必要上することが容易に了解されよう。この種の増幅システムは当業界にて公知であり、酵素：基質系などを包含する。

本発明の一聾様は、グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する試料におけるグリコヘモグロビンの比もしくは比率を決定する方法を提供し、この方法はグリコおよび非グリコヘモグロビンを遊離させるよう試料を処理し、次いで固体基質をグリコヘモグロビンと固体基質との間の錯体形成を行う条件下で試料と接触させ、次いで試料の全ヘモグロビン含有量に関連する初期吸光度を測定し、グリコヘモグロビンを固体基質に結合させることによりこのグリコヘモグロビンを試料から分離し、次いでグリコヘモグロビンが除去され或いはグリコヘモグロビンが著しく減少した試料の吸光度を測定することからなっている。

本発明の方法は、たとえばＲＮＡ、オリゴヌクレオチドのような他のｃｉｓ−ジオールを含有する物質、たとえばり、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、ノルエピネフリンなどを包含するカテコールのような小生理分子、たとえばクエン酸、乳酸などのα−ヒドロキシカルボン酸、およびたとえばアルブミンなどの他のグリコ蛋白質を検出するため用いることができる。必要な１゜２−ｃｉｓ−ジオール構造を持たない物質でも、しばしばポリオールで容易に誘導でき、これを次いでジヒドロキシボリル成分に結合できる。たとえば大抵のヌクレオチドおよび核酸は、０．５ＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５，５）Ｇニア２５℃で２時間にわたり過剰のソルビトールおよび１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）で処理して末端ホスフェートを介しソルビトールに結合させることができる［生化学分離におけるボロネートリガンド、パブリケーション５０１、アミコン・コーポレーション社、１９８１］。通常はボロネートに結合しないデオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡを、ポリオール誘導化に関し３′　もしくは５′末端ホスフエートが利用できれば、緊密結合されることができる。誘導化したリガンドは、所望ならばホスホジェステラーゼでの処理によりもとの形態に戻すこともできる。ソルビトールの代わりにメチル−グルカミンを用いて、化学切断しうる基を形成させることができる。或いは、非ｃｉｓ−ジオール含有分子をジヒドロキシボリル成分に結合させることもでき、これにはｃｉｓ−ジオール含有分子を結合剤として用い、ただしｃｉｓ−ジオール含有分子は非ｃｉｓ −ジオール含有分子に対し親和性を有するものとする。この種のｃｉｓ−ジオールおよび非ｃｉｓ−ジオール結合対の例は次のものを包含する：メチルーα−Ｄ −（。

グルコピラノシド・コンカナバリンＡ、ＮＡＤ（Ｐ）　、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ・ヘキソキナーゼなど。

グリコヘモグロビンを測定するための本発明は、グリコヘモグロビンを固体支持体から溶出させることを必要としない迅速連続システムで前記グリコヘモグロビンを測定する点において従来技術とは相違する。また本発明は分析に際し緩衝液の交換を必要としない。好ましくは、システムは自動化させる。

さらに本発明は、グリコヘモグロビンを測定する分析で検量手段および対照として使用するための、明瞭に規定された安定なグリコ標準およびこれら標準の作成方法をも提供する。

本発明の原理は小アガロースビーズに固定化させた３−アミノフェニルボロン酸に対するグリコヘモグロビンの親和性結合に基づいており、５５３　／　６２８　ｎ　ｍにて二色吸光度を介して測定する。全ヘモグロビン濃度に比例する初期吸光度測定を、試料と試薬および希釈剤との混合の後に行う。グリコヘモグロビン（たとえばＨｂＡ、ρの同一平面ｃｉｓ−ジオール基と固定化３−アミノフェニルボロン酸との間の鎖体形成が、希釈試料をボロネートアガロースと反復混合する際に生ずる。この結果、グリコヘモグロビンが希釈試料から除去される。［合計−グリコヘモグロビン］の濃度に比例する最終吸光度測定により結合ｏ　ｂ　９６の計算が可能となり、これを用意した検量曲線を用いて基準化ＨｂＡ、ｃ％に変換する。

第１工程として、試料（好ましくはグリコヘモグロビンを含有すると思われる試料、特に好ましくは全血試料）を得ねばならない。次の試料、すなわちヘパリンもしくはＥＤＴＡを用いて凝固防止した全血が好適である。しかしながら、クエン酸ナトリウムおよび弗化ナトリウム中に集めた試料も使用することができる。

血液試料におけるグリコヘモグロビンを測定するに先立ち、赤血球を溶解させる必要がある。赤血球の溶解により、グリコヘモグロビンと非グリコヘモグロビンとの両者が細胞から放出される。一般的な陽イオン型（たとえば臭化セチルトリメチルアンモニウム）；陰イオン型（たとえばドデシル硫酸ナトリウムおよびデオキシコリン酸ナトリウム）；並びに中性（たとえばサポニンおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）活性剤が、赤血球を溶解させるのに有用である。約００２５〜０．５容量％の濃度範囲における中性活性剤が好適である。機械的破壊、たとえば超音波処理および低張性溶解も赤血球からヘモグロビンを遊離させるのに効果的な方法である。

試薬の長期貯蔵安定性を得るには、少量の微生物防止剤を系に添加することが望ましく、これは溶剤、抗生物質および毒を包含する。他の生化学物質（たとえばグリコヘモグロビンの測定におけるＫＣＮ）を溶血した血液試料に導入することもできる。

次いで、試料をグリコヘモグロビンに対し特異的な結合剤もしくは親和剤で処理して、グリコヘモグロビンを非グリコヘモグロビンから分離させる。１つの方法においては、グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する溶血した赤血球の試料を、ジヒドロキシボリル成分が結合された固体基質と接触させる。

他の具体例においては、固体支持体に、たとえばＩＩｂＡ、ｃに対し特異的に結合する抗体またはＨｂ　Ａ　ｌｃに特異的に結合するレクチンのような異なる結合剤もしくは親和剤を結合させる。

固定支持体はビーズ、樹脂などの形態とすることができる。

特に好適な具体例においては、固体支持体を個々の粒子または微粒子の形態とする。これら粒子は天然もしくは合成ポリマー物質で構成することができ、所望に応じこれらを架橋させてもさせなくても良く、或いは化学的に改変することもできる。好ましくはポリマーはたとえばポリアクリルアミドのように親水性であり、或いはたとえば登録商標ウルトラゲルとして販売されるようなアガロースポリアクリルアミド共重合体またはアガロース或いはたとえばセルロース、セルロース誘導体、澱粉、デキストランおよび架橋デキストランのような遊離ヒドロキシル基を有するポリマー、たとえば登録商標セファデックス、セファロースおよびセファクリルとして販売されるものである。

粒子の直径は広範囲に変化しうるが、４０〜２００μｍの粒子が好適である。

この性質を有する粒子は結合剤もしくは親和剤を付着させるための固定基質として役立ち、容器内で容易に使用することができる。容器は、グリコヘモグロビンと固定支持体との間の結合を生ぜしめると共に吸光度を測定するものである。好適容器は、粒子を試験溶液と混合しうると共に粒子を吸光度測定に際し溶液から分離しうる容器である。最も好適な容器は、米国特許第４．８８３．７６３号（参考のためここに引用する）に記載されたような同相分析装置もしくは試料処理カードの改良型である。

混合リブ領域における円筒穴部は多孔質フィルタ挿入物を収容する。フィルタ挿入物はアガロース粒子がキュベツト内に侵入するのを防ぐと共に、希釈試料が流過するアガロース充填ベットの形成を可能にする。試薬および希釈剤を二重（ビール）カップに精密に充填する。希釈比は約に６０である。希釈比は、二の分析が質ｌ／容積濃変を測定するものでないため重要でない。

この固相分析装置を用い、装置内に入れた粒子にグリコヘモグロビン用の特異的結合剤を固定化させる。粒子が保持されかつ固定化される。試料を固体基質と混合し、グリコヘモグロビンを捕獲すると共に粒子上の試薬によって粒子上へ保持する。

非グリコヘモグロビンは試薬により結合されず、したがって溶液中に遊離状態で留まる。

グリコヘモグロビンに特異的な結合剤は、米国特許第４、２６９．６０５号（参考のためここに引用する）に記載されたようなジヒドロキシボリル成分で構成することができる。この成分は好ましくはフェニルもしくは置換フェニルボロン酸、硼酸または他のボロン酸、たとえばエタンボロン酸および１−プロパンボロン酸などである。結合剤は機械的、物理的もしくは化学的手段により固体基質に結合させることができる。好ましくは、リガンドを直接共有結合によりマトリックスに結合させる。結合剤は、その後の反応に際し脱着してボロン酸ヒドロキシルに遊離しないように、基質に結合させるべきである。好適方法において、親和性樹脂は、ｍ−アミノフェニルボロン酸を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｅ　Ｄ　Ｃ）用いて活性化されたカルボキシメチル−アガロースビーズ（ＣＭ−セファロース（登録商標）、ファルマシア社）と反応させて作成される。反応条件は、グリコヘモグロビン（Ｇ　Ｈｂ　）の特異的結合を最大化させると共に非グリコヘモグロビンの非特異的結合を最少化させるべく、適切な置換度を有する生成物を生ずるよう選択される。選択したジヒドロキシボリル成分とは無関係に、グリコヘモグロビンの糖部分は所望の分離を達成するようジヒドロキシボリル成分に結合しつることが必要である。

代案上して特異的結合剤は、被覆され、固定化され或いは粒子に共有結合される抗体で構成することもできる。免鯵化および回収工程により抗血清を得る方法は一般に当業界で知られている。抗体はモノクローナル抗体とすることもでき、その手順も当業界で知られている。Ｈｂ　Ａ　ｌｃに対するモノクローナル抗体の例はノーレス等に係る米国特許第４．７２７．０３６号に記載されている。

被覆し、固定化し或いは粒子に対し共有結合しつる他の特異的結合剤は、ｗ４構成に対し特異的な試薬を包含する。これらはコンカナバリンＡ１スクンニルーコンＡおよびビシア・ファバなどを包含するα−Ｄ−グルコースに対し特異性を有するレクチン類を包含する。他のレクチンおよびその炭水化物特異性も周知されており、遊離レクチンまたは固体支持体に結合したレクチン、たとえばセファロース（登録商標）−レクチンとして入手できる。他の炭水化物特異性支持体はアルミナゲル、燐酸カルシウムゲル、炭酸マグネシウム、珪酸マグネシウム、シリカゲルを包含する。

試料におけるグリコおよび非グリコヘモグロビンは、溶液の光学密度（吸光度）を測定する装置、好ましくは３４０〜６３３ｎｍの波長範囲における吸光度を測定しうる分光光度計を用いて分析的に検出および定量される。好適具体例の装置は、ヨーロッパ特許第０１６０９０１８１号（参考のため、その開示をここに引用する）に記載された自動化アボット・ビジョン（登録商［）アナライザである。

自動化分析装置は、二次元遠心分離の原理を用いて血漿を細胞から分離すると共に試験パック内で流体を測定゛しかつ混合する。試験の開始に際し、回転板により発生した遠心力（１８００ｒｐｍの回転板速度）により試験パック内の各試薬を１個もしくはそれ以上の試薬測定用もしくは保持用チャンバに移動させる。同時に、試料を毛細管もしくは試料穴部から血液分離室まで移動させる。凝固防止されかつ溶血された全血試料の場合、遠心力により溶解した赤血球ストロマを沈降させて、ヘモグロビン含有試料をチャンバの上部に残す。次いで試験パックホルダーによる一連の回転が生ずると共に、回転板が回転し続ける。

試験パックホルダーは試験パックを反時計方向に９０°回転させて１、緩衝試薬および希釈剤緩衝液を反応室中へ注入させると共に試料の１部を第１図に示したように試料保持室に注入させる。次いで試験パックホルダーは時計方向に９０° 回転して、試薬および希釈剤の液体成分をキュベツト中へ移動させると共に試料を測定室に移動させる。次いで試験パックホルダーは反時計方向に９０℃回転して、測定された試料を反応室中へ移動させ、ここで固体試薬ならびにキュベツトから流出する試薬および希釈剤の液体成分と混合する。試験バンクホルダーの時計方向における最後の９０°回転は希釈試料をキュベツトに移動させ、ここで光学系が初期測定および試料と試薬との複数回の回転後における最終測定につき５５３〜６２８ｎｍにて光学密賀を測定する。アボット・ビジョン（登録商標）・アナライザの詳細についてはアボット・ビジョン（登録商標）・アナライザ・マニュアル、第１３．７頁に記載されている。同様な仕様を有する他の自動化分析装置も上記方法に使用することができる。

緩衝剤ｐ　Ｈは、ボレート成分の親和性カラムに対するｃｉｓ−ジオール化合物の結合に影響を及ぼすことが知られている。緩衝液のｐＨが高い（９，６より大）とヘモグロビンの結合および安定性が低下するのに対し、低ｐＨ値では非特異性結合が増大する。非特異性結合は、陰帯電したボロネート成分およびフェニル環により導入された疎水性成分に関連するイオン効果を包含する。分析に使用する緩衝剤を考慮する際、たとえばトリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような複数ヒドロキシル基を有する緩衝剤はボロネート成分に結合するため避けるべきである。ソルビトール、セリン、エタノールアミンおよび硼酸も避けるべきである。生成されるボレート−ジオール錯体を強化するよう作用する緩衝剤が好ましい。この試験システムに適する緩衝剤は約７．５〜１１．０の範囲のｐＫａを有する緩衝剤である。この範囲の緩衝剤は当業界にて公知である。分析に際し３７℃にて約７．８〜９．６のｐ　Ｈ範囲、より好ましくは約８．５〜９．２、特に好ましくは９〜９．２の範囲にｐ　Ｈを維持するには、約８．５〜９．２のｐＫａを有する緩衝剤がより好適である。アミンは錯体を強化するよう作用し、したがってたとえばグリシン、モルホリン、Ｉ（ＥＰＥＳのようｔＩｌ衝剤またはたとえばアンモニウム塩もしくはピペリジンのような添加剤が結合を促進するのに有利である。好適具体例においてｐ　Ｈを維持するよう使用される緩衝剤は、２−アミノエチルスルホン酸（タウリン）であって、２０〜５０ｍＭ（好ましくは２５ｍＭ）の濃度にて９゜０６のｐＫａを有する。

Ｍｉｄｄｌ（ＦＡ等、Ｂｉｏｃｈ２ｍ、１．　２０９ニア７１−７？９　（１９８３）および［生化学分離におけるボロネートリガンド、出版物５０１、アミコン・コーポレーション社（１９８１）Ｊは、二価陽イオン、主としてＭｇＣｅ２から誘導されたＭｇ　を用いて、陰帯電した固定化ボロネートと陰帯電したリガンドとの間の斥力を解消することを記載している。本発明もこの目的でＭｇ２＋を使用する。しかしながら、本発明は好ましくはＭｇＣｌ２の代りにＭｇ５Ｏを用いて、発明を最適に操作しうる。ＭｇＳＯ４の好適濃度は約１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ１特に好ましくは約１００〜１５０ｍＭである。ヘモグロビンは３７℃および高められたｐＨではあまり安定でない。塩化物の存在下で分析を実施すれば、ボロネートアガロースの不存在下で約８９６の吸光度低下が生ずる。これは、試験パックのプラスチック表面に対する沈殿と吸着との組合せに起因する。

吸光度の８％低下という値は、溶液からのヘモグロビンの非特異的損失がない正常なグリコヘモグロビンレベルを有する試料につき予想される信号の約２倍にもなる。換言すれば、パックグラウンドが信号の大きさの約２倍である。ＭｇＣｌ２の代りにＭｇＳＯ４を使用すれば、この損失は約３％まで減少することが判明した。

ゼラチン（魚鱗）およびポリビニルピロリドン（ｐｖｐ）を緩衝剤に混入すると、さらにヘモグロビンが安定化された。

ＭｇＳＯ４と組合せて、これは損失を約１％まで減少させる。

この実験からのデータを第１表に示す。たとえばカゼイン、他の原料からのゼラチン、アルブミンなどの他の蛋白質安定剤および水溶性ポリマーも同様な結果を与えると予想することができる。

第１表緩衝剤の処方　：ＭｇＣｌ２の代りにＭｇＳＯ４の使用＊緩衝剤＝２５ｍＭタウリン、１００ｍＭ２令Ｍｇ　、ｐＨ９，２，２２℃ 試料＝アジド−メト−ヘモグロビン（非グリコ化）分析分析の目的で、既知量の固体基質（１０〜２００　ｕｌの範囲、典型的には６５ μｍ）を乾燥錠剤もしくは湿潤懸濁物のいずれかとして適量の＄ＩＷＲ溶液と共に供給する。緩衝溶液は、反応のｐ　ｉｆを血液試料の添加に際し約８．５〜９，２の範囲の一定値に維持するのに適したｐＫａを有する２０〜５０ｍＭの化合物を含有する。約１０〜５００ｍＭ、より好ましくは約５０〜２００ｍＭ、特に好ましくは約１００〜１５０ｍＭの一定濃度で緩衝剤にＭｇ４＋塩を添加して、固体基質におけるＧ　Ｈｂとボロネートとの間の静電反発力を解消する。ヘモグロビン沈殿を防止する蛋白質安定剤および抗微生物保存料も緩衝剤に含ませることができる。分析温度は約２４〜３９℃、より好ましくは約３０〜３７℃の範囲であり、約３７℃の温度が最も好適である。

血液試料を先ず最初にヘパリンで処理して、凝血を防止すると共にサポニンで処理して赤血球を溶解させる。次いで、試料を遠心分離すると共に試料の１部を樹脂および緩衝剤とざっと混合する。希釈した試料を樹脂から分離し、希釈試料の初期吸光度を得る。次いで、希釈試料を激しく樹脂と、グリコヘモグロビンがほとんど固体基質に結合するまで混合する。樹脂を取出し、最終吸光度の測定を行う。吸光度データを処理して、結合したヘモグロビンの相対量もしくは比率を計算する。グリコヘモグロビンの比率は、結合ヘモグロビン対グリコヘモグロビン％の標準曲線から決定される。標準曲線は、既知比率のグリコヘモグロビンの検量試料を用いて同じ手順により作成される。

既知％のグリコヘモグロビンの対照を用いて、標準曲線の正確性を定期的に試験し或いは確認する。

グリコヘモグロビンのデータ整理標準曲線を作成すると共に、この曲線から未知試料を測定するには、分析器によって次の工程を行う。全ヘモグロビン濃度に比例する初期吸光度測定値（Ａ、）と（合計−非結合）ヘモグロビンに比例する最終吸光度測定値（Ａ１）とを測定して記憶する。結合ヘモグロビン％（％Ｂ）の測定値を次式：％式％）を用いて計算する。この結合％を次の２つの作用につき補正せねばならｔｌい：１．成る程度の結合が初期測定の前に生ずる。

２　平衡に達する前に最終測定を行う。その結果、測定した結合０６は全ヘモグロビン濃度により影響を受ける。測定結合％はヘモグロビン濃度の減少と共に増大する。したがって補正結合０６（０６Ｄ）は、一対の定数（ＥおよびＩ）と初期吸光度測定値（Ａ、）とを用い、測定結合％を調整して得られる９６Ｄ＝９６８−Ｅｘ　（Ａ、−１）ここで、■は約１３　ｇ／ｄｉの濃度における「正常」ヘモグロビンの試料につき得られる初期吸光度測定値に等しい。このパラメータは実際の測定波長、試験パックにおける希釈度、および試験パックにおけるキュベツトの路長に依存する。■に関する２つの異なる数値の一方を、試料が検量手段／対照であるか或いは患者の試料であるかに応じて選択する。希釈度および路長は試験パックの製造に際し調節される。実際の測定波長は装置毎に若干変化する。したがって、１に関する独特の対を各装置に用いる。Ｅは、結合％をヘモグロビン濃度の関数として決定すると共にグリコ化％を一定に維持して実験的にめた恒数である。Ｅに関する２つの異なる数値の一方は、試料が検量手段／対照であるか或いは患者の試料であるかに応じて選択される。

直線的標準曲線は、％ＨｂＡ、−所定の数値を用いて検量手段につき％Ｄと％Ｈｂ　Ａ　ｌｃとの回帰分析から計算される；％ＨｂＡ１．＝（ｍ×％Ｄ）＋Ｂ［式中、ｍは傾斜であり、ＢはＹ輪切片である］。

例：標準曲線：０６　Ｈｂ　、仙、＝　（０，８７４１Ｘ％Ｄ）＋０．９９６Ｅ＝７．７　Ｘｌ０−４１　＝ｉＳＯＯ１１ｂ濃度（ｉ／Ｉｌｌ　Ａｉ　（ｓ＾、１１）％８　９６２　％　１ｌｂＡ、。

１７．０　１９６２　８．８２　９．１８　９．０２１５．０　１７３１　９．００　９．１８　９．０２１３．０　１５００　９．１８　９．Ｈ９，０２１１，０１２６９９，３６９，１１１９，０２９，０１０３８９，５４９，１１１９，０２７，０８０８９，７１９，１８９，０２樟準曲線を第２図にプロブトする。このデータを用いた換算法によれば、大幅に変化するヘモグロビン濃度の試料に対しても％ＨｂＡ、ｃの正確な測定を可能にする。１つの有力な利点は、隈定容積の試料（たとえばネオナタール）を希釈してもまだ精密に分析しうる点である。

検量試料／対照グリコヘモグロビン分析に使用するためのグリコヘモグロビン検量試料および／または対照は、好ましくはヒトもしくは動物の血液から作成された液体材料である。１具体例において、グリコヘモグロビン材料は牛赤血球から作成される。グリコヘモグロビン検量試料は好ましくは低レベル、中レベルおよび高レベルのグリコアジド−メト−ヘモグロビン（実施例３）を好ましくは還元型にて約５〜９、より好ましくは６〜８のｐＨの緩衝溶液中に含有する。検量試料に含有されるグリコヘモグロビン材料のレベルは、全グリコヘモグロビン（ＴＧＨｂ）の比率またはヘモグロビン（ＨｂＡ、ｃ）の比率のいずれかにより示すことができ、これは試料中のヘモグロビンの全量に対するグリコヘモグロビンもしくはヘモグロビンＡ１ｅの量である。低水準の検量試料は約θ〜１０％ＴＧＨｂ即ち０〜８％ＨｂＡｌｃ。

より好ましくは約２〜７％ＴＧＨｂ即ち３〜６％Ｈｂ　Ａ　、。

特に好ましくは４〜５％Ｔ　Ｇ　Ｈｂ即ちＨｂＡ、、の範囲である。

中水率の検量試料は約１０〜２７％ＴＧＨｂ即ち８〜１６％Ｈｂ　Ａ　、、より好ましくは１３〜２１％ＴＧＩ（ｂ即ち１０〜１５％）（ｂＡ　、特に好ましくは約１５〜１８％ＴＧＨｂ即ちＣ１１〜１３％１１ｂＡ、、の範囲とすることができる。高水準の検量試料は約２２〜４４％ＴＧＨｂ即ち１６〜３０％Ｈｂ　Ａ　、。

より好ましくは２６〜３６％Ｔ　Ｇ　Ｈｂ即ち１８〜２５％ＨｂＡ、、特に好ましくは約２７〜３０％Ｔ　Ｇ　Ｈｂ即ち１９〜２１９６１（ｂＡ、ｃｃｏ範囲とすることができる。低、中および高水準の検量試料は、４５９６７　Ｇ　）Ｉ　ｂ即ち３０％ｌ（ｂ　Ａ　ｌｃよりも大きな、より好ましくは約４５〜６０％ＴＧＨｂ即ち３０〜４０９６ＨｂＡ、、のグリコ９６範囲におけるグリコヘモグロビン材料の保存溶液と、非グリコ還元ヘモグロビン溶液との混合物から処方することができる。非グリコヘモグロビン溶液はごく少量であればグリコ化物を含むことができる。

検量試料および対照の安定性は、約８℃もしくはそれ以下で貯蔵する際には約１０ケ月より大、より好ましくは１０〜１４ケ月の範囲、特に好ましくは少なくとも１４ケ月の安定性を有すべきである。

対照は検量試料と同様に作成される。対照レベルは、好ましくはグリコヘモグロビンの正常（４〜６％ＩＩ　ｂ　Ａ　、ρおよび高められた（８％ＩＩｂＡ、、より大）生理的レベルを反映するように選択される。

本発明の１具体例において、安定なヘモグロビン溶液はアジド−メト−ヘモグロビンから作成される。アジド−メト−ヘモグロビンは、洗浄した赤血球から低張性衝撃により放出された脂質フリーのヘモグロビンから作成することができる。

赤血球の原料はヒトまたは動物（好ましくは哺乳動物）であり、より好ましくは牛赤血球である。ヘモグロビンは、たとえばフエ１ノシアン化カリウム、硝酸ナトリウムなどの酸化剤によりメト−ヘモグロビンまで酸化される。次いでメト− ヘモグロビンをアジド塩（たとえばナトリウムアジドなど）と接触させアジド− メト−ヘモグロビンまで変換する。

赤血球におけるヘモグロビンは、非酵素過程によりグルコースの存在下でグリコ化される。先ず最初に、易可逆性反応がグルコースとヘモグロビンβ鎖のＮ−末端バリンとの間で生じて、不安定なアルジミン即ちシッフ塩基を生成する。この迅速な平衡に続いて遅いアマトリ転位が生じ、ヘモグロビンＡｌｃの安定なケトアミン結合を形成する。ヘモグロビンＡ１−測定は長期糖尿病管理の有用な指標である。

本発明の他の具体例において、安定なグリコヘモグロビン溶液はアジド−メト− ヘモグロビンから作成される。非酵素的ヘモグロビン反応を、安定な液体グリコヘモグロビン検量試料および対照材料のインビトロ合成につき用いた。ヒトもしくは牛赤血球からのアジド−メト−ヘモグロビンを好ましくは３７℃にて数日間にわたり種々の濃度のグルコースと共に培養した。

グルツース分子はアミン基と、シッフ塩基物質をヘモグロビン上で形成する。未反応グルコースを除去した後、不安定なシッフ塩基物質を緩和な還元剤（たとえばシアノ硼水素化ナトリウム）での還元、たとえばパラジウムなどの触媒の存在下における接触水素化、硼水素化ナトリウムなどでの還元によって安定化させた。還元の完結は、高められた温度（たとえば約４５℃）にて還元グリコアジド− メト−ヘモグロビンを熱処理（ｈｅｓｉｔＩｒｅ＋＋ｉＢ）　して試験することができる。還元副生物をゲル濾過もしくは透析によって除去した。

グリコヘモグロビンを生成させるべくアジド−メト−ヘモグロビンに添加するグルコースの濃度は約５０〜１０００ｍＭ。

好ましくは約ｉｏｏ〜５００ｍＭ、特に好ましくは約１５０〜３００ｍＭの範囲である。グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンと共に約１〜１ｏ日間にわたり或いは所望のグリコ化％に達するまで培養する。

さらに他の具体例においては、シアノ基をアジドの基の代りに使用するこきができる。シアノ−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンも安定なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビン溶液を形成する。アジド−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンの作成方法を用いて、シアノ−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンを作成することができる。たとえばシアン化ナトリウムのようなシアン化物が、この作成方法でアジド塩の代りに使用される。

さらに他の具体例においてはカルボニル基をアジド基の代りに使用することもできる。カルボニル−ヘモグロビンおよび還元グリコカルボニル−ヘモグロビンも安定なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビン溶液を形成する。カルボニル−ヘモグロビンの作成方法は、−酸化炭素ガスをオキシ−ヘモグロビン溶液中にグリコ化の前に吹込むことを含む。この場合、フェリシアン化カリウムまたは他の酸化剤は必要とされない。何故なら、オキシ−ヘモグロビンはカルボニルヘモグロビン成形のための好適先駆体になるがらである。−酸化炭素の吹込み過程に際し発泡を最小化するには消泡剤が必要とされる。得られるカルボニル−ヘモグロビン物置は、アジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト−ヘモグロビンと同様にグリコ化されて処理さらに本発明は、試料（好ましくはグリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する血液試料）のグリコヘモグロビン含有量を分析する際に使用するための試験キットをも包含する。この試験キットは次の各成分を含む：　（１）約６〜８（好ましくは７．７）のｐＦ（を有し、グリコヘモグロビンのための結合剤（好ましくはジヒドロキシボリル成分、より好ましくは３−アミノフェニルボロン酸を付着させた粒子の懸濁物とＭｇ２＋源とを含有する緩衝試薬溶液、および（２）反応混合物のｐＨを３７℃にて約７．８〜９．６、より好ましくは８．５〜９，５、特に好ましくは９〜９．２の範囲に維持しうると共に、緩′衝剤が約７．５−１１、好ましくは８．５〜９．２のｐＫａを有する希釈剤緩衝溶液。試験に用いる粒子材料および結合剤に応じ、試験キット成分は別々に或いは組合せて供給することができ、或いは予備混合して単一溶液混合物として供給することもできる。

他の具体例において、親和性粒子は抗−グリコヘモグロビン抗体またはレクチンを結合剤として付着させる。

より好ましくは、緩衝試薬溶液はジヒドロキシボリル誘導粒子と約１０〜５００ｍＭのＭｇＳＯ４、特に好ましくは約１００〜１５０ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する。緩衝試薬溶液はさらに抗微生物剤および／または保存料、たとえばゲンタマイシン、ナトリウムアジドなどをも含有することができる。

特に好ましくは緩衝試薬溶液は、８．４ｍＭのＩ（Ｅ　Ｐ　Ｅ　５（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）と１５０　ｍ　Ｍ　ｃ７）　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４と０．４ｇ／リットルのゲンタマイシン硫酸塩と０．０５％のナトリウムアジドとを含有する緩衝試薬溶液（ｐＨ７，７）における、３−アミノフェニルボロン酸誘導アガロースビーズ粒子の懸濁物を含有する。

より好ましくは希釈緩衝剤溶液はさらにたとえばゼラチン、アルブミン、カゼインなど、好ましくは魚鱗ゼラチンのような蛋白質安定剤を約０．５〜５％、より好ましくは１〜２％、特に好ましくは１．６５％の濃度で含有すると共に、たとえばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｋ値９０）のような水溶性ポリマーを約０．５〜５％、より好ましくは１〜２％、特に好ましくは１．６５％の濃度で含有し、さらにたとえばゲンタマイシンおよびナトリウムアジドのような抗微生物剤および保存料をも含有する。好ましくは、約６５μｌの沈降した水和ビーズを含有する約１９０μｌの緩衝試薬溶液を、約４〜７μｌの試料につき用いる。

緩衝試薬溶液および希釈剤緩衝溶液は別々に、或いは２種の試薬として組合せ或いは単一の試薬として、より好ましくは２種の試薬として包装することができる。好適具体例において、緩衝試薬および希釈剤緩衝液は、たとえば試験パックのような形式で供給される。好ましくは各試験パックは次のものを含有する＋８．４ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）と１５０ｍＭのＭｇ５Ｏ，と０．４ｇ／リットルのゲンタマイシン硫酸塩と０．０５％のナトリウムアジドとを含有する緩衝溶液（ｐＨ７，７）における、３−アミノフェニルボロン酸誘導アガロースビーズ粒子（３，５ｍｇ、乾燥重量）の懸濁物を含有する約１９０μ！の緩衝試薬。希釈剤緩衝液は、次の濃度にて安定剤と抗微生物剤とを含有する約１４０μｌの緩衝溶液（ｐＨ９，６）である：９４．２ｍＭのタウリン（２−アミノエチルスルホン酸）、１．６５％の魚鱗ゼラチン、１．６５％のポリビニルピロリドン（Ｋ値９０）　、０．４ｇ／リットルのゲンタマイシン硫酸塩および０．０５％のナトリウムアジド。

ボロネート誘導アガロースは、最終分析条件下で用いる際に、高ｐ　Ｈでは凝集する傾向を有する。これは材料の取扱および分配を困難にする。この問題を解決するには、試薬系を試験パック内の封止２−室装置に設ける。１室は低ｐＨの緩衝液（緩衝試薬）におけるボロネート−アガロースを含有し、他室は希釈剤緩衝溶液を含有する。２個の分室の内容物を分析を行う時点でのみ合し、この時点でボロネートアガロースのｐＨを最終分析ｐＨまで上昇させる。当業゛者は、各成分を個々に或いは組合せて順次にまたは同時に試料へ添加しうろことを認識するであろう。好適具体例において、緩衝試薬溶液および希釈剤緩衝溶液は試料へ同時に添加される。他の好適具体例においては、希釈剤を試料に添加した後に緩衝試薬溶液を添加する。

好ましくは、キットはさらに第３の分離した成分として、たとえば乾燥サポニンを含有する毛細管のような試料用の溶解剤をも含む。

検量試料および対照は、別々に包装して或いはキット内にまとめて或いは試験キットで供給することができる。検量試料は、好ましくは約０〜８％、８〜１６％および１６〜３ｏ％Ｈｂ　Ａ　、ｃ（７）範囲内のグリコ化レベルを有する還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンを含有する。比較は、好ましくは正常および異常な患者範囲におけるグリコ化レベルを持った還元グリコアジド−メト−ヘモグロビンを含有する。

実施例１ボロネートアガロースの作成アガロース、すなわちファルマシア社からのＣＭセファロース（登録商標）ＣＬ６Ｂを蒸留水で洗浄した後、１００ｍＭのＭＥＳ　（２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ４，７）で洗浄した。アガロースを５０％固形分まで懸濁させ、次いで減圧下に０℃まで冷却した。６６ｍＭのｍＡＰＢＡ　（３−アミノフェニルボロン酸）を作成し、減圧下に０℃まで冷却し、次いでアガロースに添加した。８００ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を作成し、反応混合物に添加した。この混合物を減圧下に０℃にて１時間にわたり反応させ、次いで４Ｍの酢酸ナトリウムにより反応停止させた。ｍＡＰＢＡ誘導化アガロースを順次に１００ｍＭ酢酸と５０ｍＭＮａＯＨ／ＩＭ　ＮａＣＪと１００ｍＭ酢酸と５０ｍＭＮａＯＨ／ＬＭ　ＮａＣｌと次いで蒸留水とで洗浄した。洗浄したｍＡＰＢＡ誘導化アガロースを次いでｔ（Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　１ｕｌｌ液で洗浄し、約５５％固形分まで懸濁させた。

最終混合物のｐＨを検査し、必要に応じ７．７のｐＨに調整した。検量操作を実施例２における方法にしたがい空試験パックにおける上記粒子を用いて行い、検量曲線を作成した。

正確な検量曲線を得るため、粒子の固形物％を希釈または粒子の添加によって調整することができる。

実施例２アボット・ビジョン試験パックおよびアボット・ビジョン分析装置を用いるグリコＨｂ法第１図に示したようなビジジン試験パックを冷蔵庫から取出す。試験パックを室温にて最小３０分間にわたり加温させる。

乾燥サポニンおよびヘパリンが充填されかつ試料を含有する毛細管を試験パックの毛細管スロットに挿入する。検量試料と対照とを、試験パックの検量試料および対照穴部に直接に滴下装置を用いて加える。試験パックを分析装置に入れ、「操作」ボタンを押す。

次いで分析器は次の工程を自動的に行う；工程　説　明　註１、ロータが回転し始める。　指定の分析順序を開始する。

バーコードを読む。

２．０−タを１８００　溶解した全血試料を、挿入さＲＰＭまで加速させ、れた毛細管から遠心室（Ａ）４５秒間待つ。　に移す。細胞残渣を沈降させる。試薬溶液と希釈剤緩衝液とを試薬／希釈剤カップ（Ｂ）の試薬および希釈剤室から試薬／希釈剤保持室（Ｃ）に移す。試料および試薬／希釈剤を３７℃まで加温し始める（検量試料および対照は検量試料および対照穴部から同じ手順にしたがう）。

３、試験パックを９０°回転　全血上澄液の１部を試料保持させる。この位置にて　室ＣＤ）に移す。試薬と希釈２５０秒間保つ。　剤とをさらに混合し、試薬／希釈剤混合物を反応室（Ｅ）に移す。加温を終了する。

４、試験パックを一９０°　全血液上澄液の１部を試料容回転させる。この位置に　精測定室（Ｆ）に移す。

５秒間保つ。波長対を　試薬／希釈剤溶液をキュベラ選択する。空気ブランク　ト（Ｇ）に移す。アガロースを測定して記憶する。　ビーズを多孔質フィルタ（Ｈ）希釈剤ブランクを測定し　によって保持する。

て記憶する。

５、（ａ）試験パックを　既知容積の全血上澄液（Ｆ）９０°回転させる。　を試薬／希釈剤溶液に添加し、この位置に３秒間　その際に試薬／希釈剤溶液は保つ。　キュベツト（Ｇ）から反応室（Ｅ）に流入する。全血上澄液をざっと試薬／希釈剤溶液およびアガロースビーズと混合し、これには混合物を反応室（Ｅ）からキュベツト（Ｇ）に移動させ、再び戻す。

（ｂ）試験パックを一９０°回転させる。

（Ｃ）この位置に５秒間保つ。

（ｄ）工程５のａ　−ｃをさらに５回反復する。

６．１５秒間待つ。

７、（ａ）５秒間待つ。　全Ｈｂ濃度に比例した（ｂ）空気ブランクを　初期吸光度測定を行う。

測定する　測定値をさらに空気ブランク（Ｃ）試料吸光度を測　測定値を用いて補正し、定する。　光学ドリフトにつき補償する（ｄ）試料吸光度を空気ブランクドリフトにつき補正する。

（ｅ）補正した試料吸光度を記憶する。

（ｆ）工程７のａ　−ｅをさらに２回反復する。

８、（ａ）試験パックを　全血上澄液を試薬／希釈２５０秒間保させる。　液およびアガロースビーズと（ｂ）この位置に１５　充分混合し、これには混合物秒間保つ。　を反応室（Ｅ）からキュベラ（ｃ）試験パックを　ト（Ｇ）に移動させると共に一９０°回転させる。　再び戻す。

（ｄ）この位置に５秒間保つ。

（ｅ）工程８のａ−ｄをさらに１９回反復する。

９、（ａ）１５秒間待つ。　未結合Ｈｂ濃度に比例した最（ｂ）空気ブランクを　終吸光度測定を行う。測定値測定する。　をさらに空気ブランク測定値（Ｃ）試料吸光度を測定　により補正し、光学ドリフトする。　につき補償する。

（ｄ）空気ブランクドリフトにつき試料吸光度を補正する。

（ｅ）補正した試料吸光度を記憶する。

（ｆ）５秒間待つ。

（ｇ）工程９のｂ−ｆをさらに２回反復する。

１０、回転を停止する。

１１、データを処理する。　最初の３回の試料測定値を平均し、Ａ、とじて記憶する。

最後の３回の試料測定値を平均し、Ａ１として記憶する。

上記データ換算にしたがい計算を行う。

１２、結果を印刷する。

実施例３検量試料および対照材料作成＾、チアジド−トーヘモグロビン（牛）の作成１、牛赤血球から血漿を２０ｍＭの等張燐酸塩緩衝塩水で洗浄除去した。

２、赤血球細胞を、０．ＯＩＭの燐酸塩緩衝液を用（１凍結／解凍することにより低張性衝撃によって溶解させる。

３、ヘモグロビンを１９．５ｇ／ｄｌ　Ｈｂまで分子量１０．０００のカットオフのフィルタによる限外濾過で濃縮した。ｐＨを２Ｎ　ＮａＯＨにより７．２〜７．８に調整した。

４、Ｈｂ溶液における脂質を４０ｇ／Ｌのエアロシル３８０（パン・ウォータース社）により抽出した。この混合物を４℃にて１〜１８時間攪拌した。混合物を４℃にて４２００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離し、ヘモグロビンを回収して濾過した。ヘモグロビンを２０ｍＭの燐酸塩緩衝塩水に対し分子量１０、・０００のフィルタを用いて透析濾過した。

５、ヘモグロビンを１．３・Ｘモル過剰のフェリシアン化カリウムを用いて２〜８℃で３０〜４０分間にわたリメトーヘモグロビンまで酸化させた。

６、メト−ヘモグロビンを、３×モル過剰のナトリウムアジドを添加して２〜８ ℃で１５〜３０分間にわたりアジド−メト−ヘモグロビンまで変換させた。

７、この材料を分子量ｔｏ、ｏｏｏのカットオフフィルタにより透析濾過した。

溶液のｐＨを７，３〜７．５に調整し、抗微生物剤を添加した。

８、濃度を約１９．５ｇ／ｄｊヘモグロビンに調整した。

９、この材料を滅菌濾過し、２〜８℃にて貯蔵した。

Ｂ、グリコヘモグロビン保存溶液の作成１、無水グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンに添加し、２〜８℃で３０分間混合して２５０ｍＭのグルコース最終濃度を得た。

２、この溶液を、３０〜４０％のグリコ化レベルに達するまで３７℃にて保温した。

３、溶液を分子量ｉｏ、ｏｏｏのフィルタにより２〜８℃にて２０ｍＭ燐酸塩緩衝塩水に対し透析して、未反応グルコース（≦５ｍｇ／ｄｌ）を除去した。

４、グリコヘモグロビンを分子量１０．０００〜３０゜０００のカットオフフィルタを用いる透析濾過により約１９．５ｇ／ｄｌまで濃縮した。

５、ヘモグロビン／グルコースアダクトを、１０×モル過剰のシアノ硼水素化ナトリウムを２〜８℃で添加する還元によって安定化させた。

６、還元の完結を、４５℃にて材料を熱処理することにより試験した。必要に応じ、工程５を反復した。

７、ヘモグロビンを燐酸塩緩衝液で透析した。

８、ヘモグロビン濃度を１９．５ｇ／ｄｌに調整した。

９．９）Ｉを７．４に調整し、溶液を滅菌濾過すると共に２〜８℃で貯蔵した。

Ｃ１非グリコヘモグロビン保存溶液の作成この溶液は、グルコースを添加しない以外はグリコヘモグロビン保存溶液と同様に作成した。

Ｄ、グリコおよび非グリコ保存溶液の混合物を作成することにより最終的な検量試料および対照溶液を作成した。

実施例４ヘモグロビンをグリコ化する方法の最適化非酵素的ヘモグロビン反応を用いて、液状の安定グリコヘモグロビン検量試料もしくは対照のインビトロ合成に関する方法を開発した。実施例３における方法にしたがい牛赤血球から作成した新鮮または凍結のアジド−メト−ヘモグロビンを３７℃にて種々の時間にわたり２５０ｍＭのグルコース（１００ｍｊの１９．　５　ｇ／ｄｉ　アジド−メト−ヘモグロビンに対し、４．５３ｇのグルコース）と共に培養した。未反応グルコースをゲル濾過によって除去し、グリコアジド−メト−ヘモグロビンを過剰のシアノ硼水素化ナトリウムで還元した。還元の副生物を２０ｍＭ燐酸塩緩衝塩水に対する透析によって除去し、全グリコヘモグロビン％をｌ５ｏ−ｊａｂ　Ｇｌｙｃ−Ａｆ　ｆ　ｉｎ親和性カラム法によりて分析した。結果を第３表に示す。

第３表牛ヘモグロビンの時間経過第４表ヒトヘモグロビンの時間経過１４４　６３、０ヒトヘモグロビンを同様にグリコ化し、結果を第４表に示す。

凍結貯蔵したヒトヘモグロビンを用い、６３％の最大全グリコ化％が約１４４時間後に観察され、その時点でヒトヘモグロビンは凝集し始めた（第４表）。

全グリコ化％に対するグルコース濃度と牛ヘモグロビンとの経時比較は、グリコ化法における２つの重要な因子を示した（第３図）。第１に最大グリコ化％はグルコース濃度の増加と共に増大し、第２にグリコ化％の速度はより高いグルコース濃度にて加速された。両回子はグリコ化過程を最適化するのに貢献する。

２４時間にわたる４５℃での熱処理がシアノ硼水素化ナトリウム（Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｉｊ３）の効果を示す有効な指標であることを証明するため、高レベルの検量試料を４５℃にて種々の濃度のＮａＣＮＢＨと共に保温した。種々の量のＮ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈ３を検量試料におけるヘム濃度に基づき高レベルの検量試料に添加して、第５表に示す最終濃度を得た。各溶液を２つの部分に分割し、一方を４５℃にて２４時間保温し、他方を２〜８℃で貯蔵した。この実験からのデータを第５表および第４図に示す。

この実験は、適量で存在する場合のグリコヘモグロビンの安定化に関するＮ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈ３還元の効果およびＮ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈ３還元のためのモニターもしくは対照として使用する４５℃熱処理の効果を示す。

第５表グリコヘモグロビン安定性：２４時間の４５℃熱処理ＩＭ濃度ＮｚＣＮＢＨ，２〜８℃比較　２４時間４５℃　、差ストレスＯｍＭ　１１．６８％　１２．６９％　−１４，０％ｌｓＭ　傘１３．９９％　１２．６３％　−１０，０％５ｓＭ　１４．５５％　１３．１４％　−１０，０％１０５Ｍ　１４．６６％　Ｎ、　６０％　−７，０％２０ｍＭ　１４．７４％　１４．１４％　−４，０％３０５Ｍ　１４．８５４１　１４．６０％　−１，６１１％４０ａＭ　ｉ４．９４％　１４．１１１１％　−０４０ｊｌ＊カラム漏れを示す。

グリコ牛アジドーメトーヘモグロビンのシアノ硼水素化ナトリウム還元が非グリコ非還元アジド−メト−ヘモグロビンの安定性と比較してヘモグロビン（Ｈｂ）の安定性を増大させることを証明するため、グリコ化された還元試料につき約１７．　５　ｇｙ’ｄｌ　Ｈｂおよび非グリコ非還元試料につき１８．１ｇ／ｄｌｌの濃度における各１部を４５℃にて保温し、同じ濃度の対照を２〜８℃にて貯蔵した。それぞれの試料を所定の時間間隔で３４日間にわたり定期的に採取し、ヘモグロビン濃度を測定した。第６表および第５図における結果は、グリコ化された還元中アジドーメトーヘモグロビンが非グリコ非還元型よりも安定であることを示す。

還元型のグリコ牛アジドーメトーヘモグロビン検量手段の長期間安定性を一２０ ℃および２〜８℃での保温によって測定した。各標準の１部を全部で３０９日間にゎたりＨｂＡｌｃ％につき毎日試験した。第７表および第６図における結果は、検量手段が一２０℃もしくは２〜８℃のいずれかにおける長時間の貯蔵につき安定であることを示す。悪作用は認められなかった。

了ローＮＰＩ　ｒ’−小＝＝＝＝呂；＝工世；Ｓ　−雪国第７表安定化検量試料の長期安定性一２０℃で貯蔵した検量試料２〜８℃にて貯蔵した検量試料実施例５予想値本発明の方法を用い、グリコヘモグロビン基準範囲は４．１〜５，７標準化％ＨｂＡＩｃであることが決定された。この範■は１０１名の明かに健康な個人（女性４１名、男性６０名）鴫試験して確認された。基準範囲は特定の患者集団に応じて変イ１することがある。

実施例６再現性本発明による方法の再現性を、１つの分析装置を用いて５Ｅ間にわたり４反復で２レベルのグリコヘモグロビン比較をフィールド試験することにより決定した。

総平均および変動係数（％　ＣＶ　）を変動分析から計算した。全％Ｃｖは日内変化及０日間変化に基づくものの合計である。

アボット・ピシリン　平均　日内グｌＪ：ｆｆＨｂ対照　％Ｈｂ＾１．　％ＣＶ　全ＸＣｖ対照Ｉ　５．３　３．２　３．２対照ｎ　ｌ（１２，２２，６実施例７精度％グリコＨｂ試験を決定するための本発明による方法の１　精度を、この試験とＨＰＬＣグリコヘモグロビン分析または１ｓｏｌａｂ　Ｇｌｙｃ　Ａｆｆｉｎ分析（親和性による全グリコヘモグロビン）との比較によりヒト全血液試料のフィールド試験にて決定した。％グリコヘモグロビンを測定するための本発明による方法とグリコヘモグロビンのＨＰＬＣ法との間の相関試験を行った。

□ グリコヘモグロビンを測定する本発明の方法を病院環境で行い、４．５〜１３．３％のグリコヘモグロビン値の範囲にわたる５１人のヒト全血試料を用いて病院で行った。それらの結果を、ＨＰＬＣグリコヘモグロビン法を用いて得られた結果と相関させた。

全試料を現場にて単一試料で分析した。ピシリン・グリコ１１　ｂシステムとＨＰＬＣグリコヘモグロビンシステムとの相関関係を第７図に示す。直線回帰分析は次の結果を与えた：比較：ビジョン・グリコＨｂ（Ｙ輪）対ＨＰＬＣグリコヘモグロビン（Ｘ軸）試料数＝５１傾斜＝０．９８切片＝０．３３相関係数＝０．９８３偏り＝０．２Ｓｄ線＝０．４Ｓｄ差＝０．４ｔ＝０．４０統計的または臨床的な有意差は観察されなかった。

グリコヘモグロビン対Ｔｓｏｌａｂ　ＧＩｙｃＡｆｆｉｎ試験につき本発明の方法を用いて、次の相関関係が観察された：Ｎ＝５１傾斜＝０．６５２切片＝１．４０相関係数＝０．９９１偏り＝−１，６Ｓｄ線＝０．３Ｓｄ差＝１．３対ｔ＝−８，９７非対ｔ＝−２，６９これらデータを第８図にプロットする。

実施例８妨害下記の一般的に処方した薬剤を本発明の方法に対する妨害につき、添加物質を含有する全血試料を試験して検査した。所定濃度における次の物質は、特定レベルのＨｂＡｌ−含有する試料に対し１０％未満の妨害を示した：試験物質　濃　度　％１ｌｂＡ、ｃ内生物質ビリルビン　３Ｇ■＃ＪＩ　４．７グルコース　８００■／ｄ１４．５トリグリセリド　１３００■／ｄｇ　４．８タイプ■糖尿病につき処方した薬剤クロルプロパミド　７５■／ｄ１５．５グリピジド　５０■＃Ｊ　５．５グリブリド　５０■／ｄ１５．５トルブタミド　１．００■＃１　５．１次の物質は、示した試料濃度にて本発明の方法を有意には妨害しなかった。有意の妨害とは、正常範囲の試料につき試験結果にて１０％より大きい差をもたらすものとして規定される。

一般的処方薬剤　試験した濃度アセトアミノフェン（タイレノール）３０■／ｄ１アセチルサリチル酸（アスピリン）　５０ｎｌ／ｄｊ！アスコルビン酸（ビタミンＣ）　１０■／ｄｌカフエイン　６■／ｄ１セホキシチン　２．５■／ｄｊｌンメチジン（タガメット）７．５■／ｄｌＬ−ドーパ　１０■／ｄ１エピネフリン（アドレナリン）０．１■／ｄ１ハイドロクロルチアジド　５■／ｄｌイソニアシト　２５■／ｄｌペニシリンＧ　１０００単位／ｄｌ。

フェニトイン（シランチン）　８■／ｄｌサリチル酸　４０■／ｄ１テオフイリン　８■／ｄｌワルフアリン（クマリノ）１０■／ｄｌ実施例９ヘモグロビン変種（異常ヘモグロビン）グリコヘモグロビンの親和性結合法は、ヘモグロビン変種による最小の妨害を示す［Ｍｉｊｄｌｅ、　Ｆ、＾０等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１．２０９ニア７１−７７９．　１９８３；　Ａｂ目ｈＩ、　Ｅ、Ｃ，’ｉ　Ｊ、’　Ｌ＊ｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、１０２：１ｇ？−１９７，１９８３；　Ｔ山＊＋’、　Ｄ、劃Ｃｌ’ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　Ａ山１２ｇ＋６ト６７゜１９８３；　Ｙ山ｃｏｌｌ、Ｒ，Ｗ等、　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｗ、２９＋５４３−５４５．　Ｈ８３］。

ヘモグロビンＦ（胎児）、ｓおよびＣは、本発明に記載した試験を妨害しないことが判明した。同様に、他の変種も妨害しないと思われる。

ＦＩＧ、　２％ＨｂＡｌｃＦＩＧ、　３時間　（ＨＲ３）ＦＩＧ、４ＮａＣＮＢＨ３（ｍＭ）ＦＩＧ、５時間（日数）ＦＩＧ、６グリコ牛アジドーメトーヘモグロビン検量試料安定性・−２０’Ｃ貯蔵グリコ牛アジドーメトーヘモグロビン検量試料安定性：２〜８℃貯蔵ビジョン−グリコ　Ｈｂ国際調査報告　Ｉｎ＋−８＋、、ｍ＋ｕｌｓｌ、ｌ、１ｗａｙ。、。

国際調査報告　ｌ＝ｔ、、ａ＋＋＋ｕａｎｉ甲嘘＠ｎ〜０フロントページの続き（７２）発明者　イングランド、バーバラ・ジエイアメリカ合衆国、ライスコンシン・５３２１１、ミルウオーキー、イースト・ケンウッド・ブウルバード・１８０８（７２）発明者　アニーノ、メアリー・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・６０００４、アーリントン・ハイツ、ノース・ハイランド・アベニュー・２６１６

Claims

【特許請求の範囲】１．基質結合性および基質非結合性の物質を含有する試料中における、基質結合性物質の相対量を測定するに際し：（ａ）試料を最終測定濃度まで希釈し；（ｂ）希釈試料の初期吸光度を測定し；（ｃ）固体基質と希釈試料とを合し；（ｄ）希釈試料と固体基質とを固体基質に対する基質結合性物質の実質的結合をもたらすのに充分な条件下で混合し；（ｅ）固体基質を分離し；（ｆ）固体基質により結合された基質結合性物質の量を決定することを特徴とする基質供給性物質の相対量の測定方法。２．希釈剤が固体基質を含有するが、基質結合性物質の実質的量が固体基質に結合する前の状態で初期吸光度を測定する請求の範囲第１項に記載の方法。３．方法を自動化する請求の範囲第１項に記載の方法。４．固体基質により結合された基質結合性物質の量を、固体基質の分離後に試料の吸光度を測定して決定する請求の範囲第１項に記載の方法。５．基質結合性物質の相対量を吸光度測定値から計算する請求の範囲第４項に記載の方法。６．試料における基質結合性物質の相対量を、検量試料から作成された標準曲線により決定する請求の範囲第１項に記載の方法。７．工程ａ、ｂおよびｃを実質的に同時に行う請求の範囲第１項に記載の方法。８．結合した基質結合性物質の測定を、初期吸光度測定値を得る前に生じた固体基質に対する基質結合性物質の結合を補償するよう調整する請求の範囲第７項に記載の方法。９．固体基質が、基質結合性物質のための結合剤を付着させた粒子からなる請求の範囲第１項に記載の方法。１０．粒子を吸光度の測定に際し試料から分離する請求の範囲第９項に記載の方法。１１．分離が、試料と粒子との混合物を粒子を保持するような多孔質フィルタに通過させることからなる請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する全血試料中における、グリコヘモグロビンの相対量を測定するに際し：ａ．グリコおよび非グリコヘモグロビンを放出するよう試料を処理し；ｂ．この試料を最終測定濃度まで希釈し；ｃ．希釈試料の初期吸光度を測定し；ｄ．固体基質と希釈試料とを合し；ｅ．希釈試料と固体基質とを、固体基質に対するグリコヘモグロビンの実質的結合をもたらすのに充分な条件下で混合し；ｆ．固体基質を分離し；ｇ．固体基質により結合された基質結合性物質の量を決定することを特徴とするグリコヘモグロビンの相対量の測定方法。１３．固体基質により結合された基質結合性物質の量を、固体基質の分離後に試料の吸光度を測定して決定する請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．グリコヘモグロビンの相対量を吸光度測定値から計算する請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．固体基質がグリコヘモグロビンのための結合剤を付着させた粒子からなる請求の範囲第１２項に記載の方法。１６．結合剤がジヒドロキシボリル成分を有する基である請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．ジヒドロキシボリル成分を有する基が３−アミノフェニルボロン酸から誘導される請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．結合剤が抗−グリコヘモグロビン抗体から誘導される請求の範囲第１５項に記載の方法。１９．結合剤がレクチンから誘導される請求の範囲第１５項に記載の方法。２０．工程ｂ、ｃおよびｄを実質的に同時に行う請求の範囲第１２項に記載の方法。２１．結合したグリコヘモグロビンの測定を、初期吸光度測定値を得る前に生じた固体基質に対するグリコヘモグロビンの結合を補償するよう調整する請求の範囲第２０項に記載の方法。２２．サポニンを試料に添加してグリコおよび非グリコヘモグロビンを遊離させる請求の範囲第１２項に記載の方法。２３．グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する全血試料中におけるグリコヘモグロビンの相対量を測定するに際し：ａ．グリコおよび非グリコヘモグロビンを放出するよう試料を処理し；ｂ．最終測定濃度を有すると共にＭｇＳＯ４を含有する試料の希釈溶液を作成し；ｃ．希釈試料の初期吸光度を測定し；ｄ．希釈試料と、グリコヘモグロビンのための結合剤を付着させた粒子からなる固体基質とを合し；ｅ．希釈試料と固体基質とを、固体基質に対するグリコヘモグロビンの実質的結合をもたらすのに充分な条件下で混合し；ｆ．固体基質を分離し；ｇ．固体基質により結合されたグリコヘモグロビンの量を決定することを特徴とするグリコヘモグロビンの相対量の測定方法。２４．希釈試料におけるＭｇＳＯ４の最終濃度が約１０〜５００ｍＭである請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．希釈剤がＭｇＳＯ４を含有する請求の範囲第２３項に記載の方法。２６．希釈試料が、初期吸光度を測定する前に少なくとも１種の蛋白質安定剤を含有する請求の範囲第２３項に記載の方法。２７．蛋白質安定剤をゼラチン、ポリビニルビロリドン、カゼインおよびアルブミンよりなる群から選択する請求の範囲第２６項に記載の方法。２８．試料におけるグリコヘモグロビンの相対量を分析するためのキットにおいて、別々に包装された成分が：ａ．緩衝剤とＭｇＳＯ４とグリコヘモグロビンのための結合剤を付着させた固体基質とを含有する試薬溶液；およびｂ．試料および試薬溶液と混合した際に約７．８〜９．６の範囲の数値にｐＨを維持しうる希釈剤緩衝溶液からなることを特徴とするグリコヘモグロビンの相対量の分析キット。２９．ＭｇＳＯ４が、試薬溶液と希釈剤緩衝液とで希釈された試料におけるＭｇＳＯ４の最終濃度を約１０〜５００ｍＭにするような濃度で存在する請求の範囲第２８項に記載のキット。３０．希釈剤緩衝液がゼラチン、ポリビニルビロリドン、カゼインおよびアルブミンよりなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質安定剤を含有する請求の範囲第２８項に記載のキット。３１．全血試料からグリコおよび非グリコヘモグロビンを放出する試薬をさらに含む請求の範囲第２８項に記載のキット。３２．１種もしくはそれ以上の検量試料および対照をさらに備える請求の範囲第２８項に記載のキット。３３．ＭｇＳＯ４とグリコヘモグロビンのための結合剤を付着させた固体基質とを含有する試薬溶液からなることを特徴とする試料におけるグリコヘモグロビンの相対量の分析キット。３４．グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定なグリコヘモグロビン溶液を作成するに際し：ａ．赤血球を洗浄し；ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ；ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し；ｄ．ヘモグロビンをメト−ヘモグロビンまで酸化し；ｅ．メト−ヘモグロビンをアジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト−ヘモグロビンまで変換し；ｆ．グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト−ヘモグロビンに添加してグリコアジド−メト−ヘモグロビンもしくはグリコシアノ−メト−ヘモグロビンを生成させることを特徴とする安定なグリコヘモグロビン溶液の作成方法。３５．赤血球が哺乳動物赤血球である請求の範囲第３４項に記載の方法。３６．ヘモグロビンを、フェリシアン化カリウムを用いてメト−ヘモグロビンまで酸化する請求の範囲第３４項に記載の方法。３７．メト−ヘモグロビンを、ナトリウムアジドを用いてアジド−メト−ヘモグロビンまで変換する請求の範囲第３４項に記載の方法。３８．メト−ヘモグロビンを、シアン化物を用いてシアノ−メト−ヘモグロビンまで変換する請求の範囲第３４項に記載の方法。３９．グリコアジド−メト−ヘモグロビンもしくはグリコシアノ−メト−ヘモグロビンを還元剤により還元することをさらに含む請求の範囲第３４項に記載の方法。４０．還元剤がシアノ硼水素化ナトリウムである請求の範囲第３８項に記載の方法。４１．還元の完結を、昇温熱処理試験により試験する請求の範囲第３８項に記載の方法。４２．グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定なグリコヘモグロビン溶液を作成するに際し：ａ．赤血球を洗浄し；ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ；ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し；ｄ．ヘモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換し；ｅ．グルコースをカルボニル−ヘモグロビンに添加してグリコカルボニル−ヘモグロビンを生成させることを特徴とする安定なグリコヘモグロビン溶液の作成方法。４３．グリコカルボニル−ヘモグロビンを還元剤により還元することをさらに含む請求の範囲第４２項に記載の方法。４４．還元剤がシアノ硼水素化ナトリウムである請求の範囲第４３項に記載の方法。４５．グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定な非グリコヘモグロビン溶液を作成するに際し：ａ．赤血球を洗浄し；ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ；ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し；ｄ．オキシ−へモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換し、またはヘモグロビンをメト−ヘモグロビンまで酸化し；ｅ．メト−ヘモグロビンをアジド−メト−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト− ヘモグロビンまで変換することを特徴とする安定な非グリコヘモグロビン溶液の作成方法。４６．グリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定な非グリコヘモグロビン溶液を作成するに際し：ａ．赤血球を洗浄し；ｂ．ヘモグロビンを赤血球から溶液中へ放出させ；ｃ．脂質をヘモグロビン溶液から除去し；ｄ．ヘモグロビンをカルボニル−ヘモグロビンまで変換することを特徴とする安定な非グリコヘモグロビン溶液の作成方法。４７．グリコアジド−メト−ヘモグロビン、グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたはグリコカルボニル−ヘモグロビンからなることを特徴とするグリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定なグリコへモグロビン溶液。４８．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンからなることを特徴とするグリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定なグリコヘモグロビン溶液。４９．アジド−メト−ヘモグロビン、シアノ−メト−ヘモグロビンまたはカルボニル−ヘモグロビンからなることを特徴とするグリコヘモグロビンの分析にて検量試料もしくは対照として有用である安定な非グリコヘモグロビン溶液。５０．試料におけるグリコヘモグロビンの相対量を測定する方法に使用するための別々に包装された安定なグリコヘモグロビン標準のキットにおいて：ａ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約０〜１０％の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有する溶液と：ｂ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約１０〜２７％の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有する溶液と；ｃ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約２２〜４４％の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有する溶液と；ｄ．アジド−メト−ヘモグロビン、シアノ−メト−ヘモグロビンまたはカルボニル−ヘモグロビンの溶液とからなることを特徴とするキット。５１．各成分が：ａ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約２〜７％の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有する溶液と；ｂ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約１３〜２１％の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有する溶液と；ｃ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約２６〜３６％の範囲内で測定可能な全グリコヘモグロビンと共に含有する溶液と；ｄ．アジド−メト−ヘモグロビン、シアノ−メト−ヘモグロビンまたはカルボニル−ヘモグロビンの溶液とからなる請求の範囲第４５項に記載のキット。５２．試料におけるグリコヘモグロビンの相対量を測定する方法に使用するための安定なグリコヘモグロビン標準のキットにおいて：ａ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約４〜６％の範囲内で測定可能な比率のヘモグロビンＡｌｃと共に含有する溶液と；ｂ．還元グリコアジド−メト−ヘモグロビン、還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンまたは還元グリコカルボニル−ヘモグロビンを溶液の全ヘモグロビン含有量に対し約８％より高い測定可能な比率のヘモグロビンＡｌｃと共に含有する溶液とからなることを特徴とするキット。