JP2008527371A - 微小流体輸送導管の中で両親媒性高分子物質と一緒に反応物を共輸送するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微小流体導管(=輸送マイクロ導管)の中で微量の液体アリコートの輸送に関し、該導管は、微小流体装置の一部であってもよく、また分配された液体アリコートを更に加工する微小装置に該アリコートを分配するのに使用される装置の一部であってもよい。輸送は、典型的に、アリコートを加工するための予め決められたプロトコルの一部である。プロトコルは、分取の、分析の、合成の、等であり得る。与えられるプロトコルでは、少なくとも一つのアリコートが、プロトコルで使用される反応物を含有する一方で、他のアリコートは、そのような反応物を欠如しており、例えば、単に洗浄液体および/もしくはコンディショニング液体ならびに/または反応物を含有するアリコートのための希釈液として機能する。
表面対容積の比率は、nl−およびpl−範囲内で小型化しているときに、劇的に増加する。かくして、μl−範囲以下の液体容積、例えばnl−およびpl−容積を取り扱うときには、より大きい容積を取り扱う場合と比較して、効果的な予防策で、望ましくない表面相互作用を妨害することが、より不可欠である。マイクロタイター・ウェルのような静的な系と比較して、典型的に、比較的長い(すなわち輸送される反応物が望ましくない相互作用を受けるさらなる可能性を提供し得る、追加の接触表面を提供する)輸送マイクロ導管が存在する微小流体系については、問題は遥かに大きい。
本発明の実施態様は、検出限界および/もしくは精度および/もしくは回収率を改良するためにならびに/または上記の種類の微小流体のプロトコルにおけるアナライトの損失を防止するために一般的に使用され得る、改良された組成物、薬剤ならびに/または方法を含む。微小流体アッセイプロトコルのための検出限界の改良は、典型的には、天然由来の生物学的流体中、少なくとも≦10−6モル/lの、例えば≦10−9モル/l、もしくは≦10−12モル/l、もしくは≦10−15モル/lのアナライトの測定を含む。アナライトについて要求される検出限界は、原則として常に>10−25モル/lである。精度の改良は、典型的には、関係するアナライトのレベルが、±20%、例えば±15%もしくは±10%もしくは±5%の変動係数(CV)を有して得られることを意味する。回収率の改良は、典型的には、≧60%、例えば≧75%もしくは≧90%もしくは≧95%もしくは本質的におよそ100%の回収率値が達成されることを意味する。
本発明の更に完全な理解のために、添付の図面に関連して、以下の説明が参照される:
図1は、hIL−8アッセイについての本発明の効果を説明している。
図2は、従来の希釈剤および本発明にしたがう希釈剤の間での比較を説明している。
図3は、異なるアナライト(mTNFα、mIL−6、hTNFα、hIL−8、hMCP−1、hIFNγ)を含有する五つの試料を希釈するためのプロトコルエンハンサーの希釈剤の異なる組合せを持つスクリーニング実験の結果である。
I.定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術的なおよび科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されるのと同一の意味を有する。本発明の目的のために、以下の用語が下で定義されている。
有用な両親媒性高分子物質は、典型的に、室温(25℃)で水中で生来ミセル形成性である。これは、適当な物質が、分子の別々の部分および/もしくは末端に親水性のならびに疎水性の領域を含むことにより顕著な界面活性を有するにちがいないことを反映する。ミセル形成性の性質は、それ自体では本発明のためには重要でなく、単に本発明の目的を達成するために重要である基本構造的な特徴を反映していると信じられている。物質の中で別個の親水性領域および疎水性の領域の存在ならびに高分子の特徴(=中程度の〜高分子量)は、荷電していてもしていなくてもよい、非濡れ可能性のならびに濡れ可能性の表面を含んでいるさまざまな種類の表面への総体的に良好な付着のための基本的な基準である。
本発明の最も顕著な利点は、反応物および輸送マイクロ導管の内部表面の間で望ましくない相互作用に対する危険性が高いときに起ると信じられている。我々の実験はこれまで、この種類の相互作用の危険性は、反応物が疎水性の基および荷電された基の中で選択される一つのもしくは複数の基を示す場合に、最も高いことを示唆している。疎水性の基は、典型的には、芳香族基および/または環状の、枝分かれのもしくは直鎖のアルキル基またはアルキレン基を示す。芳香族基は、置換型もしくは未置換型の、フェニル基およびベンジル基で例示され得る。アルキル基またはアルキレン基は、例えばメチル、エチル、プロパ−1−イル、プロパ−2−イル、2−メチル−プロパ−1−イル、ブタ−2−イル、フェニル、ベンジル、CH3−S−CH2−、HSCH2−、1−メチル−プロパ−1−イル等の中における、一つ、二つ、三つもしくはそれ以上のsp3−混成の炭素原子を含有している炭化水素鎖を含み得る。原則として、生体有機分子の炭素鎖は30個未満の炭素原子を有する。荷電基は、正におよび/もしくは負に荷電していて、反応物が両方の種類の基および正味の正電荷、正味の負電荷もしくは正味のゼロ電荷を有することを含んでいる。反応物のもしくは基の正味の電荷はpH依存性であってもよく、例えば、反応物は、等電点(pI)を持つ両性電解質のように、双性イオン性であってもよい。これらの種類の基/反応物は、疎水性の基もしくは反応物の上の荷電基に比較して反対の電荷を有する基を露出する、内部表面と相互作用する可能性がある。相互作用は、もしも内部表面の荷電基が内部表面の下の層内に、例えば、所謂ピンホールの中のような欠損被膜層内に、もしくはマイクロチャネル構造が作られる材料の表面層内に存在する場合にも起こり得る。
(a) N−末端アミノ酸および/もしくはリシン等のような、塩基性アミノ酸残基、
(b) C−末端アミノ酸および/もしくはアスパラギン酸、グルタミン酸等のような、酸性アミノ酸残基、ならびに
(c) ゼロより更に大きい疎水性親水性指標(hydropathy index)を有しているアミノ酸(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157 (1982) 105-132)。
この明細書のいずれかで既に記載されたように、輸送マイクロ導管は、主として、a)分配装置、およびb)微小流体装置のマイクロチャネル構造の中に存在する。
微小流体装置は、そのそれぞれが一つもしくはそれ以上の液体のアリコートを輸送することおよび加工することにより望ましいプロトコルを行うために意図される、一つ、二つもしくはそれ以上のマイクロチャネル構造を含む。マイクロチャネル構造/装置の数は、典型的に≧10、例えば、≧25もしくは≧90もしくは≧180もしくは≧270もしくは≧360である。
上で指示されたように、液体輸送は、典型的に、一つもしくはそれ以上の液体のアリコートが微小流体装置のような微小装置内で加工されるプロトコルの一部である。少なくとも一つのアリコートは、プロトコルの反応物を含有する。プロトコルは、分析的、分取的、合成的等であり得る。原則としては、微小装置の中で行われる任意の種類の合成的なもしくは分取的なプロトコルは、結果を分析して、行われる実際の反応について、関与される反応物について、何かを見出すことを意味する、換言すれば、大抵の分取的なおよび合成的なプロトコルは分析プロトコルの一部である。
この種類のプロトコルは、アナライトおよびアナライトに対する親和性カウンターパート(anti−An)を含んでいる親和性複合体が形成される工程を含む。反応条件の適切な選択により、(a)形成された複合体、および/もしくは(b)複合体形成していないアナライト、ならびに/または(c)複合体形成していないanti−Anの量を、アナライトの出発量、例えば、それからアナライトが由来する流体、例えば生物学的流体、の中のアナライトの濃度/量/活性、と相関する。(a)、(b)もしくは(c)の測定は、しばしば、親和性反応物、例えばanti−Anもしくはアナライト類似体(An類似体)の使用により容易になり、それは、ラベルのような検出可能な基(検出可能な反応物)を含みそして要素(a)〜(c)の適切なものを含有する親和性複合体を形成する能力がある。受容体−リガンドアッセイの内容では、用語“抗体”は、未反応の天然の抗体ならびに抗原に結合しているフラグメントおよびそれらの誘導体、例えばFab、F(ab)2、単鎖の抗体、キメラ抗体、一つもしくはそれ以上の抗体部分を含有しているコンジュゲート、抗体の抗原特異性を模倣しようと試みている合成形を含む。抗体は化学的におよび/もしくは組換え的に製造され得る。
触媒アッセイでは、アナライト(An)は、触媒系の成分である。用語“触媒系”(CS)は、主として、生体触媒系、例えば、酵素的に活性なタンパク質もしくはそれらの合成変異体に基づく酵素系を意図する。用語“触媒系”はまた、一つの触媒系が他の触媒系および/もしくは抗原−抗体反応系のような他の反応系と組み合わされた、所謂カップリング触媒系を包含する。触媒系の成分(=反応物)は、触媒、基質、補基質、補因子、補触媒、阻害剤、促進剤、活性化剤等で例示され得る。酵素系については、これは酵素、基質、補基質、補酵素、補因子等に相当する。
細胞をベースとしたアッセイは、輸送マイクロ導管内で輸送される一つの反応物が細胞の懸濁液であることを意味する。細胞は、典型的には、生存していて、そして、一つもしくはそれ以上の薬剤を作用させて、その結果、場合により受容体−リガンドプロトコル、もしくは当分野で周知のタイプの、例えば上記の触媒プロトコルを利用することにより、または触媒形態学、運動性、増殖等を研究することにより、薬剤の細胞に対する作用を研究する。またUS 6,632,656(出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)を参照されたい。関係する薬剤は、何れの種類であってもよく、またファージ、ウイルス等、温度、時間、湿度、CO2および/もしくはO2圧のようなガス圧、栄養剤、毒素、ビタミン、ホルモン等を含んでいる。細胞は、作用が研究される前に、関係する薬剤(複数を含む)の存在下もしくは不在下に装置の外部でまたは内部で増殖され得る。細胞を薬剤(複数を含む)に供した後で、細胞は、微小装置の内部で、例えば溶菌されてもしくは固定化され、殺されてもよいが、この時、種々の放出されたもしくは結合された細胞成分は、次に、調べられる微小装置の中に保持されている。
検出可能な基は、検出可能な反応物の中に天然で存在するかもしくは反応物上に人によりラベルとして導入されている。前者の場合には、検出可能な基は、タンパク質、多糖、核酸等のような反応物の天然の構造の一部である。典型的な例は、免疫グロブリン/抗体の中のクラス、サブクラスおよび種特異的(IgFc)決定因子である。もしもラベルが人により導入されるならば、最終反応物は、“コンジュゲート”と呼ばれる。コンジュゲートは、組換え技術によりおよび/もしくは有機合成のカップリング化学を用いることにより合成的に得られる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証するために含まれている。以下にある実施例で開示される技術は、本発明の実施で良く機能するように本発明者により見出された技術を提示し、そしてかくして、その実施のための好ましいモードを構成すると考え得ることが、当業者により認識されねばならない。しかしながら、本開示に鑑みて、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱すること無しに、開示される特異的実施態様の中で多くの変更を行い、なお類似のもしくは同様の結果を得ることができることを、認識しなければならない。
hIL−8アッセイに対する効果
本発明者等は、WO 04083108およびWO 04083109(Gyros AB)で記載されたサンドイッチアッセイの性能は、ヒトインターロイキン8(hIL−8)のような或る特定の血清分析のためには検出限界、応答レベル等に関して低いことを見出した。β−カゼイン、ウシ血清アルブミンおよびNaClを含有している緩衝液の中に試料を予め希釈することにより改良が得られた。
ヒトインスリンアッセイに対する効果
材料および方法
希釈剤および他の液体:
●PBS−Tween:15μl Tween 20 10%+14.985ml PBS(1×)。捕捉抗体用の希釈剤および微小流体装置(CD)の中でカラム洗浄用の液体。
●PBS−BSA:1ml BSA 10%+9ml PBS(1×)。検出Ab用の希釈剤。
●発明の希釈剤原液:1%BSA、0.2%β−カゼイン(SIGMA C-6905-1G、ミルク、最低90%純度)、PBS中の1M NaCl
●試料および標準用の発明の希釈剤:0.5%BSA、0.1%β−カゼイン、PBS中の0.5M NaCl、希釈剤原液5ml+5ml MQ水。
●標準用の別の希釈剤:健康な断食している人からの血清試料。健康な断食している人は、生来インスリン2〜25μU/mlを有し、9μU/mlの平均値を有する(Mercodia Insulin ELISA, Uppsala, Sweden)。
●B−1125捕捉Ab:抗ヒトインスリンMAb(ラットIgG1;Research Diagnostic)。原液濃度1.64mg/ml。アッセイ濃度0.1mg/ml
●F−1203検出Ab:抗ヒトインスリンMAb(ラットIgG1;Research Diagnostic)。原液濃度1000nM。アッセイ濃度25nM
●ヘテロフィル(heterophils) Ab用のアッセイでのB−1108捕捉Ab:抗mIFNγMAb(ラットIgG1)。原液濃度0.5mg/ml。アッセイ濃度0.1mg/ml
●R−1614組換えヒトインスリン(Fitzgerald)。原液濃度14.5μU/ml。標準曲線1〜1000μU/ml。Mw=5808g/モル、pI=5.2。高疎水性。1μU/ml=6.95pM=40.3pg/ml
試料:RIAにしたがって9〜209μU/mlからのインスリンレベルを有する13個のヒト血清試料。
機器:Gyrolab Workstation LIF (Gyros AB, Uppsala, Sweden)。
インスリンサンドイッチアッセイおよびヘテロフィル抗体サンドイッチアッセイは、WO 04083108およびWO 04083109(Gyros AB)の中でサンドイッチについて記載された通りである。希釈された試料および標準が、微小流体装置に分配された。
図2を参照されたい。革新的希釈剤は、PBS−BSA希釈剤より遥かに低い検出限界(それぞれ、0.9μU/mlおよび26μU/ml)を与えた。動的な範囲がまた改良される。
全ての人のおよそ30〜40%はヘテロフィル抗体を有する。これらの抗体は、アナライトと一緒に存在するときに、免疫アッセイと相互作用して、アナライトの偽りの濃度を与え得る。アッセイでは、インスリンアッセイの捕捉抗体(抗ヒトインスリンMAb)を、抗mIFNγのラットMAb(IgG1)と置き換えた。ヘテロフィル抗体を中和するために、IgGを洗浄工程を通してかもしくは試料にのいずれかで加えた。この実験では、IgGを捕捉抗体洗浄工程2で加えた。通常では、PBS−Tweenが洗浄溶液として使用され、そしてアッセイでは、ラットIgGに結合している全てのヘテロフィル抗体が測定されるであろう。ウシIgG(1.0mg/ml)およびマウスIgG(0.2mg/ml)の混合液を加えているときには、ヘテロフィル抗体は低いレベルまで低減されるであろう。二回分析された試料は、洗浄溶液としてPBS−Tweenで一回およびIgG混合液で一回。
異なる試料の希釈が標準曲線と平行であったか、即ち、我々は希釈係数が低いときに、マトリックスの問題を有するかどうかを検討するために実験を実施した。高濃度、中程度の濃度および低濃度のインスリンを含む試料を、本発明にしたがう希釈剤(0.5%BSA、0.1%β−カゼインおよび0.5M NaCl)で1:2、1:4、1:8および1:16に希釈した:
分析プロトコル用のエンハンサープロトコルの最適な組合せのためのスクリーニング
アッセイプロトコル:
WO 04083108およびWO 04083109(Gyros AB)で記載されたサンドイッチアッセイ。希釈された試料および標準は、微小流体装置に分配された。
hIFNγ(9.64)、hMCP−1(9.39)、hIL−4(9.26)、hIL−8(9.02)、hTNFβ(8.94)、mIFNγ(8.8)、mIL−4(8.3)、mIL−10(8.2)、hIL−2(7.05)、hIL−5(7.05)、hTNFα(7.0)、mIL−6(6.5)、hIL−6(6.25)、hIL−1β(5.95)、hインスリン(5.2)、rインスリン、hMMP−2(5.02)、mTNFα(5.0)、mIL−2(4.9)、mMIP−1β(4.77)(h=ヒト、m=マウスおよびr=ラット)。濃度:100pMに対して。
プロトコルエンハンサー:
1.両親媒性高分子物質:β−カゼイン、Pluronic F127およびF68 (BASF)(三ブロック共重合体(EO)m(PO)n(EO)m(式中、EOはエチレンオキシドであって、POはプロピレンオキシドである))。
2.塩:NaCl
3.洗剤:非イオン性:Tween20および80(Merck)、Triton X100 (Sigma)、Pluronic F127およびF68 (BASF)、Glucopone (Fluka)、Brij 35 (Aldrich);b) 双性イオン性:CHAPS (Sigma)、Zittergent (Calbiochem)、DPC(ドデシルホスホコリン);c)陽イオン性:CTAB (Sigma)。
評価基準:CVおよび検出レベル。
代表的な結果が、図3に示されており、ここで、0は推薦されないこと、+は許容されること、および++は非常に許容されることを意味する。ネガティブな効果についての危険性は、希釈剤3および4(それぞれ、“Tween”および“Pluronic”)について最小であり、おそらく希釈剤4の方が幾らか望ましいように見える。洗剤についての結果は、非イオン性洗剤が最も全般的な応用性を有することを示した。
Claims (26)
- 両親媒性高分子物質と一緒に反応物を共輸送することを特徴とする、実験プロトコルの反応物を含む液体のアリコートを微小流体輸送導管の中で輸送する方法。
- 当該物質が≧2,000ダルトンの分子量を有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 当該物質がミルクタンパク質もしくはミルクタンパク質の誘導体(フラグメントおよび凝集体を含んでいる)であることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法。
- 当該物質がカゼイン、好ましくはβ−カゼインであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 当該物質が水の中でミセルを生来形成することが可能であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 0.001〜5%の範囲内にある血清アルブミンの濃度において血清アルブミンと一緒に反応物を共輸送することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 0.01〜3M内にある塩の濃度の塩と一緒に反応物を共輸送することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 非緩衝性の無機塩、例えばグループIの金属と強酸の塩(例えば塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム)と一緒に反応物を共輸送することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 典型的に0.001〜5%の範囲内の濃度において、テンシド(Tenside)および天然由来の界面活性剤の中で選択される≦50,000ダルトンの分子量の洗剤と一緒に反応物を共輸送することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫グロブリンと一緒に反応物を共輸送することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 当該マイクロ導管が、典型的に、無機材料(例えば金属、ガラス等)から作られる、分配毛管の一部であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 当該マイクロ導管が、典型的に複数の当該マイクロチャネル構造を含有している微小流体装置のマイクロチャネル構造の一部であり、当該マイクロチャネル構造が、好ましくはプラスチックで作られていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 当該マイクロ導管が、マイクロチャネル構造の入口区分および/もしくは内部区分の一部であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 請求項12〜13のいずれか1項に記載の方法であって、当該マイクロ導管がマイクロチャネル構造の内部区分の一部であること、および当該アリコートが内部区分の上流の区分の中の二つもしくはそれ以上の異なる液体アリコートを内部で加工することにより得られたことを特徴とする、方法。
- 当該アリコートの一つが反応物を含有して一つもしくはそれ以上の残存するアリコートが一つもしくはそれ以上の高分子物質、当該塩、当該洗剤、当該免疫グロブリンおよび当該血清アルブミンを含有することを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 実験プロトコルが分析の、分取のもしくは合成のプロトコルの中で選択されることを特徴とする、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 当該反応物がアナライト、分析的に検出可能な反応物、および固定化可能な反応物の中で選択されることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 当該プロトコルが、a)受容体−リガンドアッセイ、b)触媒アッセイ、もしくはc)細胞をベースとしたアッセイ、であることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 当該反応物が生物学的流体の中で≦10−6モル/lの、例えば≦10−8モル/lの濃度で存在するアナライトであることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 当該反応物がペプチド構造、核酸構造、炭化水素構造および脂質構造から選択される構造を示すことを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 反応物が一つもしくはそれ以上の荷電された基および/もしくは一つもしくはそれ以上の疎水性の基を示すことを特徴とする、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 当該反応物が、それを輸送する液体のpHよりも大きいかもしくはそれに等しいpIを持つ両性電解質であることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 当該反応物が、それを輸送する液体のpHよりも小さいかもしくはそれに等しいpIを持つ両性電解質であることを特徴とする、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 当該マイクロ導管の内部表面が、特に請求項2〜5にしたがう、両親媒性高分子物質で被膜されていることを特徴とする、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 実験プロトコルの反応物を含む液体のアリコートを、微小流体輸送導管の中で輸送する方法であって、当該マイクロ導管の内部表面が、特に請求項2〜5にしたがう、両親媒性高分子物質で被膜されていることを特徴とする、方法。
- 請求項1〜10に記載のプロトコルエンハンサーと一緒に反応物を共輸送すること、および/もしくは該方法を請求項16〜24のいずれか1項に記載された通りに行うことを特徴とする、請求項25に記載の方法。
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