JPH04506866A - 二抗体ｅｉａ検定法におけるヒト抗ネズミ抗体および異好性抗体の干渉の除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 二抗体ＥＩＡ検定法におけるヒト抗ネズミ抗体および興好性抗体の干渉の除去ユ 悲Ω立立 本発明は、二抗体検定法で観察され、ヒト血漿中に存在するヒト抗ネズミ抗体お よび興好性抗体の存在の結果として起こる干渉の除去に関する。この干渉の結果 として、癌胎児抗原（ＣＥＡ）などの分析物について人為的濃度の測定値が生じ る。

光９しと星丞 ＣＥＡについての臨床的二抗体検定法は、結腸直腸癌患者での疾患の再発を監視 するのに日常的に用いられている。この検定の結果によって治療計画が影響され ることがあるので、この腫瘍関連抗原についての正確な信頼できる測定値は極め て重要である。単クローン性抗体（ＭＡＢＳ）を用いる面相エンザイムイムノア ッセイ（ＥＩＡｓ）における興好性抗体干渉は、他の血液分析物について観察さ れたが、ＣＥＡそのものについてのエンザイムイムノアッセイまたはラジオイム ノアッセイでは報告されていなかった。これらの興好性抗体干渉の問題について の免疫応答の原因は今のところはまだ明らかに説明されていない。

ネズミ単りローン性抗体産生が可能となり並びに腫瘍組織に対して薬剤および放 射能を集中させるためにこれらの抗体を用いることによって、新たな問題が生じ ることになった。これは、自然免疫応答の結果として引起こされるヒト抗マウス 抗体（ＨＡＭＡ）の産生である。抗体の投与量が増加しく＞２０ｍｇ）または多 数の注射が行われた場合に、ＨＡＭＡの発生率が増大する。ＣＥＡの血漿濃度の 正確な測定でのＨＡＭＡの干渉は実証されており、ディルマン・アール・オー（ Ｄｉ　ｌ　１ｍａｎ、Ｒ，Ｏ，）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｓ　ｏｒＩｓｅ　Ｍｏ ｄ、。

う：３９４〜４１０　（１９８６）：ジェファース・ジー・ジエイ（Ｊａｆｆｅ ｒｓ、Ｇ、Ｊ、）ら、工ｒａｎｓ　１ａｎｔ、４１：５７２〜９（１９８６）； ：７−トニー・ラック−Ｘヌ−Ｘス（Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ、Ｎ、Ｓ、 ）ら−Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、±６：６４８９〜９３（１９８６）を参照され ない、この検定はＣＥＡ＆生腫瘍全腫瘍る患者の処１に対して決定的であるので 、この干渉の除去が極めて重要になっている。この分類に属する結腸直腸癌患者 の存在頻度は、シティ・オブ・ホープ・ナショナル・メディカル・センター（Ｔ ｈｅ　Ｃ１ｔｙ　ｏｆ　Ｈｏｐｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ ｅｒ＞、カリフォルニア州、デュアルテにおいて、１週間当り１人〜２人の患者 または１年間では５０人〜ｌｏｏ人の患者である０診断および治療用にネズミ単 りローン性抗体を用いることが更に定着するにしたがって、この患者数は増加す るし、そしてこの問題は更に一般的になるであろう。

ＨＡＭＡの影響を未然に防ぐように考案されたＣＥＡ用免疫検定の改良として、 血漿と多クローン性ネズミＩｇＧとのブレインキュベーション［モートン・ビー ・エイ　（Ｍｏｒｔｏｎ、Ｂ、Ａ、）ら、Ａｒｃｈ、Ｓｕｒ　、、ユ≦２３＋１ ２４２〜６　（１９８８）を参照されたいコおよび血漿の熱抽出Ｃハンセン・エ イチ・ジェイ（Ｈａｎｓｅｎ’、Ｈ，Ｊ、）ら、ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、３５ 　（１）＝１４６〜５１　（１９８９）を参照されたいコが挙げられる。ｆｋ近 、商業的に入手可能なＣＥＡ−０シユ（Ｒｏｃｈｅ）’ＥＩＡが、単一のＭＡＢ を加えることによって改良されて、潜在する興好性抗体の干渉を減少させた。研 究を遺影術のなめにインジウム−１１１を標識しな抗ＣＥＡネズミ単りローン性 抗体を予め与えられた３０人の患者でのこの改良およびＨＡＭＡ干渉に対するそ の効果についての評価が、シティ・オブ・ホープ・ナショナル・メディカル・セ ンターで行われた。改良されたキットにおけるＣＥＡ値の偽上昇の全体の発生率 は、非改良キットによって示された７５％から４７％に低下した。偽陽性のＣＥ Ａ力価の発生率は３６％から２１％に低下したが、完全には除去されなかった。

立型Ω翼致 ＣＥＡ−ロシュ■ＥＩＡそれ自体に関して現在性われていることには、単一の単 クローン性抗体をそのキットに加えることがある。これによってもなお、診断お よび治療用にネズミ単りローン性抗体を与えられた患者の２２％で偽陽性のＣＥ Ａを生じ、プライス・ティー　（Ｐｒ　ｉｃｅ、Ｔ、）ら、ＣＩ　ｔ　ｎ、Ｃｈ ｅｍ、。

１９９０年提出を参照されたい、血清の熱抽出はＣＥＡ検定のための干渉の除ｌ ｓに有効であると考えられるが、熱感受性である他の分析物には適当でないこと がある０種々の種からの非特異性免疫グロブリンを患者の検体と一緒に加えるこ とが報告された。

本発明によつ、二抗体ＥＩＡ検定における分析物の偽高濃度を、ヒト血漿検体に 対してＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＴｇＧ２ｂの混合物を加え乙ことによって補 正する。

ＣＥＡなどの血液分析物のための二車クローン性抗体検定で見出された干渉を除 去するなめに単クローン性抗体の混合物を加えることの利点は、下記の通りであ る。すなわち、（１）それによって熱抽出が避けろｔＬ　：　（２）　−”−ｉ Ｌに、１−）てＨＡＭＡおよび異好性抗体の干渉が多クローン性抗体と同程度ま で完全に除去され：そして（３）単クローン性抗体は商業的に利用するのに原価 効率よく多量に製造することができることであり、多クローン性抗体（特に、ネ ズミ）はそれができない。

区厘Ｏ訳悲 図４（ａ）および（ｂ）：ＣＥＡ値の相関関係は、改良および非改良ＣＥＡ−ロ シュ■Ｅ　Ｉ　Ａを用いて得られた。（ａ）ネズミ単りローン性抗体を全く与え ろれなかった遺影術未経験対照患者（ｎ＝１５）；　（ｂ）　Ｉｎ凛識抗ＣＥＡ ネズミ単クり−ン性抗体２０〜４０ｍｇを与えられた遺影術経験患者（ｎ＝５８ ＞、（ＣＥＡ検出可能性の限界未満の観測値はこのグラフから省略、されたか。

本文中に記載したように相関関係を算定するのに用いた４）図２：非改良Ｅ　Ｔ Ａ−ｉ−ｍＩ　ｇＧ　（ＩＩＥＩ）および改良Ｅ　Ｉ　Ａ　（ロ）を用いて得ら れた血漿ＣＥＡ値（ｎｇ／ｍｌ）を、四つの患者群それぞれについて非改良ＥＴ Ａ（０）だけで測定されたＣＥＡｉｉ！ｉｆの比として表示した。患者群は、遺 影術未経験対照である群１：真正陽性のＣＥＡ力価を有する遺影術経験患者であ る群２；偽陽性のＣＥＡ力価を有する遺影術経験患者である群３：ン５よび部分 的に抑制可能なＣＥＡ力価を育する遺影術経験患者である群４；であった、図３ （ａ）および（ｂ）：真正陽性（区；Ｊ　Ｙ、　（ｈＩｌｉ性（己コ）および部 分的に抑制可能（Ｋ３．の種類のＣＥＡｌｌｉ性＜＞　５　ｎ　ｇ／’ｍ　＋　 ）の検体の百分率を、非改良ＣＥＡ−ロシュ■ＥＴＡ（ｎ＝う８）（ａ）および 改良ＣＥＡ−ｏシＦＥＴＡ　（ｎ＝４７）（ｂ）について示す。

鰹ル包ｎ瞠漬列 二抗体免疫検定法における異好性抗体の干渉は、診断上の目的でホルモン、酵素 および細胞表面抗原を定量化する場合に認められた問題であった。この干渉によ って、偽陽性の結果かまたは偽陰性の結果を生じることがある。ボスカド（Ｂｏ ｓｃａｔｏ）およびスチュアート（Ｓｔ、＋＋ａｒｔ）により、正常血漿の４０ ％が、広範に特異性抗体に結合することができ且っ二抗体免疫検定法において干 渉する可能性がある検出可能な非分析物質を含んでいることが報告されており、 ボスカド・エル・エム（Ｂｏｓｃａｔｏ、Ｌ、Ｍ、）ら、Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、、３２　（８）：　１４９１〜５　（１９８６）を参照されたい。

様々な癌の診断および治療のなめにネズミ単りローン性抗体を患者に投与するこ とはこの問題を増大させた。ヒト抗ネズミ抗体の発生は、血液腫瘍および充実性 腫瘍の評価または治療のためにネズミＭＡＢｓを与えられている患者で実証され た。最初のＭＡＢｓによる干渉の可能性および可能なアナフィラキシ−合併症と 同時に、ＨＡＭＡは、現在臨床的に用いられているＣＥＡのための二抗体免疫検 定法での偽陽性の結果の原因であると考えられる。

本発明により、二抗１ＥＴＡ検定におけるＨ　Ａ　Ｍ　Ａおよび興好性抗木の干 渉は、検定を行う前のヒト血ａまなは血清検体を、ＩｇＧインタイブ、すなわち ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびｆｇＧ２ｂの混合物と一緒にインキュベートするこ とによって低減または除去される。

検定は、既知の方法、例えば、商業的に入手可能なＣＥＡ−ロシュＥｉＡキ・・ ｌトを、その添付使用説明書に記載された方法で用いることによって行２つｚこ る。こめようなキットからの一般に入手可能な添付説明書は本出願と一緒に堤出 さｔしており、本明細書中に参考文献として記述される。ＣＥＡ−ロシュＥｒＡ ：す１；・には、ＡＴＣＣに畜託番号ＨＢ８７４７として寄託されているバイブ １月；−マまたは細胞系が含まれ、１９８９年１０月１０日に発行された米国特 許第４．８７３゜３１３号明細書でＴ８４．６６として記載され且つ請求の範囲 に記載された。

本発明の実施において、単りローン性１ｇＧイソタイ乙例えば１ｇ２ａ、［ｇＥ ａおよび１ｇ２ｂの混合物（約１５〜約２５μｌ）を、稀釈した血漿または血清 検体約７５〜約１５０μｍと一緒に、約３０’Ｃ〜５０°Ｃで、好ましくは３７ ℃で、適当な時間、例えば１５〜９０分開、好ましくは約３０〜６０分間インキ ュベートする。単クローン性抗体混合物は各ＭＡＢを等重量比で含むのが好まし いが、このことは必須ではない。

惠五見 １１１　Ｉ　ｎ＊ｖａ抗ＣＥＡネズミ単クローり性抗体ＺＣＥＯ２５［ハイブリ チク・インコーホレーテッド（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、）、カルフォルニ ア州、サン・ディエイ］を用いて診断用イムノシンチグラフィーを予め施された ３０人の結腸癌患者で、血漿ＣＥＡの理由不明の上昇が示された。ＣＥＡ濃度は 、二抗（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ）、ニュー・シャー シー州、ナｙトリーコを用いて通常通りに測定された。ＨＡＭＡ測定用に貯蔵さ れたこれらの３０人の患者からの６１個の血漿試料は、この既往の研究用に利用 可能であった。これらの血漿試料の内の５８個が、陽性ＣＥＡ値（＞５ｎｇ／ｍ １　）を有することが分かった。ＣＥＡ陽性の５８個の試料について再検定を、 検定を行う前の血漿に多クローン性ｍＩｇＧを２００μｇ加えて行った結果、血 漿試料は、加えられたｍＩｇＧ存在下のＣＥＡ濃度によって決定される三種類に 分離された。

その三種類は、 １、真正陽性ＣＥＡ：ｍＩｇＧの添加によって影響されなかった高ＣＥＡ値（＞ ５ｎｇ／ｍｌ）を有する血漿； ２、偽陽性ＣＥＡ：ｍＩｇＧの添加によって正常の濃度（≧５ｎｇ／ｍｌ＞まで 低減され、それによって、ＣＥＡ陰性であると臨床的に分類された高ＣＥＡ値を 有する血漿； ３、部分的に抑制可能なＣＥＡ：ｍｒｇＧの添加によって低減されたが、それで もなお前記の正常のＣＥＡ値（＞５ｍｇ／ｍＩ　）を維持し、したがってＣＥＡ 陽性であると臨床的に分類された高ＣＥＡ値を有する血漿：であった。

ネズミ抗体を全く与えられたことがなく且つＣＥＡ値が正常値（≧５ｎｇ／ｍｌ ）〜５３．９ｎｇ／ｍｌであった１３人の患者の血漿試料を対照として用いた。

（−緒に提出された添付説明書を参照されたい）および単一のＭＡＢを含むこと によって改良されたこのキットの変型の双方を用いて測定した。非改良ＥＩＡを 用いるＣＥＡの測定では、血漿試料全部を、ＰＢＳ２０μｌかまたは多クローン 性ｍＩｇＧ２０μｌ　（２００μｇ）と−緒に３７℃で１時間インキュベートし た後に検定を行った。計算においては適当な稀釈環補正を行った。改良ＥＩＡキ ットを用いて得られたＣＥＡ測定値を血漿試料全部について、本明細書中に参考 文献として記述される一緒に提出された添付説明書にしたがって行った。各試料 を２種類の興なる稀釈環で二重に試験した。ロシュ改良ＥＩＡによって偽高ＣＥ Ａ結果を与え続ける７個の血漿試料を更に試験して、多クローン性ｍＩｇＧと一 緒にかまたは３種類のサブクラス（ＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）の別々 の若しくは混合物としての無関係なネズミ単りローン性抗体と一緒にインキニー ベーシヨンを行った。これらの検定において、血漿試料は、ＥＩＡの前に、マウ ス多クローン性１ｇＧ１００μｇ、各ＩｇＧサブクラス１００μｇまたはＩｇＧ １十ＩｇＧ２ａ＋ｒｇＧ２ｂのＬ　：　１　：　１！金物１００μｇと一緒にイ ンキニーベートされた。試料を自動ＥＩＡ読取り機（ロシュ・ダイアグノスティ ｙり・システムズ、二ニー・シャーシー州、ナラトリー）を用いて読取り、キッ ト使用説明書にしたがってＣＥＡ値を計算した。この研究の目的用に、低い方の 検出限界をＣＥＡ２．５ｎｇ／ｍｌと見なした。

旦ΔＭΔ棟主 各試料中のヒト抗ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）の濃度を、非競合的ＥＩＡを用いて測 定した。プレートに免疫原である単クローン性抗体ＺＣＥＯ２うを塗布し、各血 漿試料を連続稀釈したものを用いて室温で２時間インキュベートした０次に、こ れを、アフィニティー精製アルカリ性ホスファターゼ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧと一 緒に３７℃で１時間インキュベーションした。＃零基質を添加した後、０Ｄ４ｏ ５での光学濃度を、アップル■プラス（Ａｐｐｌｅ　Ｉｔ　Ｐｌｕｓ）コンピュ ーター［アップル・コンピューター・カンパニー（ＡｐｐｌｅＣｏｍｐｕｔｅｒ 　Ｃｏ、）、カリフォルニア州、カペルティノ］に接続しなＭＲ８０ミクロエラ イザ（ＭｉｃｒｏＥＩＬＩＳＡ）！！取りＩＩ［ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ）　、カリフォルニア州、アレクサンドリア］で読み取っな。

次に、ＨＡＭＡの比濃度を、従来開発されたロジットログ（１ｏｇｉｔ＝ｌｏｇ ）曲線分析コンピュータープログラムを用いて決定したが、ビーティ・ジェイ・ ディー（Ｂｅａｔｔｙ、Ｊ、Ｄ、）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、ユゴ しα＝１６１〜７２　（１９８７）を参照されたい、このプログラムを改良して 、分析用に完全な曲線を与えなかった試料の値について一点測定法を行うための 選択肢を含めた。陽性の対照は、既知の濃度のヒトＩｇＧ標準に対して標準化さ れた（アミノ酸分析）ＨＡＭＡ陽性患者の血漿であった。ビーティらの上記を参 照されたい。

統計学 対になっている群の間でのデータの比較統計学的分析を、バーゾンの（Ｐｅａｒ ｓｏｎ”　ｓ）相関係数（ｒ）およびそれと対になったスチューデントの（Ｓｔ ｕｄｅｎｔ’　ｓ）を試験を用いて行った。対にして行うｔ試験を行う前に、実 験群の全体の間での相違を、分散測定分析を繰り返し用いて調べ、対にして行う 試験は多数の比較のなめに修正された。相関関係の推定に必要な仮定を満足させ るために、ＣＥＡ検出能力の限界（２，５ｎｇ／ｍｌ＞未満の観測値は、それら の期待値がその中点値であるように、０およびこの限界の間の範囲の値に無作為 にふり分けた０分析はいずれもデータの自然対数で行って、ＣＥＡ測定値に固有 のひずみを減少させた。

結果 体を全く与えられなかった１３人の患者の限定された母集団から得られた血漿試 料を、非改良ＥＩＡｔｍＩｇＧおよび改良ＥＩＡで試験してＣＥＡ値を比較し且 つｍｌｇＧを２００μｇ加えることによってＣＥＡの測定値が影響を受けるかど うか調べた。結果を表１に報告する。

３種類の検定全部の間での高度な相関関係を表１のデータによって実証する。

非改良ＥＩＡ＋ｍ１ｇＧを用いて得られたＣＥＡ値の間の相関関係は、ｒ＝０． ９９であり、非改良ＥＩＡ＋ｍＩｇＧおよび改良ＥＩＡの間では、ｒ＝０．９９ 、そして非改良および改良ＥＩＡ／）間では、ｒ＝０．９７であった（図１ａ） 、非改良ＥＩＡ、非改良ＥＩＡ＋ｍＩｇＧおよび改良ＥＩＡで得られた平均ＣＥ Ａ値±ＩＩ準偏差は、それぞれ１８．０±１７．９．１８．３＋１９．２および １８．１±２０．８であった。これらの結果により、ＣＥＡ検定を行う前にこれ らの患者の血漿にｍｌｇＧを２００μｇ加えても、測定されたＣＥＡ濃度は有意 に変更されなかったことが示される。

ｔ　ＣＥＡ（’告　／′−経　５、） 腫瘍イムノシンチグラフィーのなめにｔｘｔＩｎ標識抗ＣＥＡ　ＭＡＢ２０〜４ ０ｍｇを与えられ、しかもＣＥＡの上昇性力価を生じた３０人の患者からの血漿 試料をこの分析で用いた。これらの患者から得られた血漿試料６１個の内、５８ 個で、非改良ＥＩＡを用いて測定した場合のＣＥＡ値が上昇したことが分がっな （〉５、Ｏｎｇ／ｍｌ）、３個の試料のＣＥＡ値は≦５．０ｎｇ／ｍｌであり、 それらについてはそれ以上試験を行わなかった。これらの５８個の試料を改良Ｅ ＩＡを用いて検定した場合、高ＣＥＡ試料の数が４７個に減少した（８１％）、 非改良ＥＩＡを行う前に、血漿にｍｌｇＧを２００μｇ加えた結果、ＣＥＡ陽性 （＞５．０ｎｇ／ｍｌ）の試料が３７個だけ生じた（６４％）、シたがって、非 改良ＥＩＡにおいてＣＥＡに陽性であった２１個の試料は、ｍＩｇＧ存在下の非 改良ＥＩＡ試験においてはＣＥＡについて正常であることが証明された。

これらの２１個の試料の内の１０個（４８％）は、改良ＣＥＡ−ロシュ■ＥＩＡ において陽性のＣＥＡ値を与え続けたが、それらは、非改良検定と比較した場合 、全体平均９１．０％の抑制を示した。この群の５８人の患者についての非改良 キットおよび改良キットの間の相関係数は、対照群に対するよりも有意に低いも のであった（ｒ＝０．４８；ｐ＜０．００１＞。

非改良ＥＩＡを用いてＣＥＡに陽性と決定された５８個の血漿試料は、下記に記 載したように、結果として生じた血漿ＣＥＡ値に対するｍＩｇＧインキュベーシ ョンの効果に基づいて３種類に分類された。第一の種類には１５個の試料が含ま れ（２６％）、そのＣＥＡ値は、表２のデータによって示されたように、ｍＩｇ Ｇの添加によってほとんど影響されなかった（ｐ＞０．０５）。

これらの検体にｍｌｇＧを２００μｇ加えることにより、全部の場合に１０％未 満のＣＥＡ値の抑制が生じ、非改良ＥＩＡと比較したところ全体平均増加６．５ ％が得られた。これにより、ｍｒｇＧを添加しておよび添加なしで非改良キット を用いて得られたＣＥＡ値の間にｒ＝０．９９６の相関間係か得られた。

これらの試料を「真正陽性のＪ　ＣＥＡ試料と称した。同様に、改良検定と。

ｍｌｇＧを添加した（ｒ＝ｏ、９９４Ｉかまたは添加なしくｒ＝０．９９７）の 非改良検定との間には、十分な相関間係が見られた。しかしながら、対にして行 ったｔ試験分析では、改良検定によって得られたＣＥＡ値が、ｍＩｇＧを添加し たまたは添加なしの非改良検定によって得られた値よりも有意に低い（ｐ＜０． ００１＞ことが示された。

５８個の高ＣＥＡ試料の内の２１個は（３６％）は、非改良検定で試験した場合 にｍＩｇＧの添加によって正常濃度（≦５．０ｎｇ／ｍｌ）に抑制され、したが って、偽陽性のＣＥＡ上昇と見なされた０表３を参照されたい。

これらの同じ試料は、改良ＥＴＡを用いて検定した場合、２１個の試料全部の抑 制が更に示された。最初の非改良ＥＩＡと比較した場合の全体平均抑制％は、マ ウスＩｇＧを加えた非改良ＥＩＡでの抑制９８．９％に対して、改良ロシュＥＩ Ａでは９５．３％であった。この２１人の患者の群において、１１個の試料が改 良ロシュＥＴＡキットにおいて５％ｇ／ｍ１末溝のＣＥＡ値を示し、残りの１０ 個の試料（４７，６％）は偽陽性Ｄ５ｎｇ／ｍｌ）のままであった、したがって 、非改良検定を単独でかまたは改良検定を用いて得られたＣＥＡ値は、ｍＩｇＧ 存在下の非改良検定とほとんど相関しなかった（それぞれ、ｒ＝０．２０および ｒ＝０．３６）。

残りの高ＣＥＡ血漿試料においては、非改良検定にｍＩｇＧを加えることによっ て、ＣＥＡ値は有意に低下したが＜ｐ＜０．００００１）、それらは正常値まで 回復されなかった０表４を参照されたい。

これらの試料は、それらかＣＥＡ陽性血漿であったか、実際のＣＥＡＪ度は、非 改良検定を用いて得られた見掛の濃度よりも実質的に低かったので、部分的に抑 制可能であると称した。非改良検定に対してｍＩｇＧを添加することによって、 この群の試料は、ＣＥＡＩの抑制≧１８％を示し、全体平均は６５．７％であっ た。この群の試料について改良キットによって得られた平均抑制％は５６．８％ であり、これは、非数Ａ−ｆｆット＋ｍ１ｇＧによって得られた抑制よりも有意 に小さいものであった（ｐ＝０．０２３）、改良ＥＩＡと、非改良ＥＩＡ＋ｍ１ ｇＧを用いて得られたＣＥＡ値の間の相関係数は０，７３であった。この相関間 係は偽陽性の群（ｒ＝０．３６）で見出された関係よりも優れていた。対にした ｔ試験を用いて、この群の患者の２２個の試料の内の１２個（５４，５）で、改 良検定によるＣＥＡ値が非改良検定法＋ｍＩｇＧによるものよりも有意に高かっ た（１）＜０．０５）、したかって、部分的に抑制可能な試料の約半分は、改良 ＥＩＡによる偽高ＣＥＡ力価を与え続けた。

１６個の血漿試料に対して加えて、多クローン性ｍＩｇＧを、改良ＥＩＡを用い て検定した場合のＣＥＡ値は、非改良ＥＩＡ＋ｍＩｇＧを用いて得られた値と比 較したところ有意に高い値を示した＜ｐ＜０．００１＞、表５を参照されたい。

改良ＥＩＡによってＨＡＭＡ干渉が示されたままであるこれらの試料は、偽陽性 のＣＥＡおよび部分的に抑制可能なＣＥＡの双方の試料を含んでいた。これらの 試料を、ｍＩｇＧと一緒にインキュベーションを行う改良ＥＩＡによって再検定 した場合、ＣＥＡ力価は、非改良−？ｍＩｇＧ検定で見られた値に四散するかま たはそれよりも低い値まで低下した６改良ＥＩＡによって陽性のままであった偽 陽性ＣＥＡ血漿全部で、多クローン性ｒｎＩｇＧを更に加えることによって陰性 であることか示された。同様に、部分的に抑制可能なＣＥＡ検体では、ｍＩｇＧ を添加し、たことによって、添加しないよりも有意に低い（ｐ＜０．０２５）Ｃ ＥＡ力価が得られた。これらの礫正された値（改良ＥＩＡｆｍＩｇＧ）は、非改 良ＥＩＡ＋ｍＩｇＧで得られた値（ｐ＝０．１２）とほとんど差がなかった。

単一の無関係な単りローン性ネズミｍＩｇＧの添加が、改良検定でなお生じてい る干渉を減少させるのに多クローン性ｍＩｇＧの添加と同程度に有効であること ができるかどうかという問題について、７個の試料で実験しな、再度、表５を参 照されたい、これらの検体の内の５個が偽陽性血漿試料であり、２個が部分的に 抑制可能な血漿試料であった０次に、等量（１００μｇ）の多クローン性ｍ　Ｉ 　ｇ　Ｇかまたは種々のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）の単 独若しくは一緒に混合した無関係な単クローン性抗体を、血漿と一緒にインキュ ベートした後、検定を行った０表６に示した結果により、改良ＥＩＡで残ってい る人為的ＣＥＡ値を最も一貫して除去することは、多クローン性ｍＩｇＧの添加 かまたは単クローン性抗体ＩｇＧＬ　ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの組合わせに よって行われた０個々の単クローン性抗体の添加によっても、それぞれの場合に 測定されたＣＥＡＪ度が低減されたが、しかしながら、有効性のばらつきが大き かった。

旦へＭΔ厘 この研究で用いられた間接ＥＩＡのなめのＨＡＭＡの正常の範囲は、ネズミ抗体 を全く与えられたことかなく且つ血漿ＣＥＡＪ度が正常であった４４人の患者の 試料を採取することがら決定された。平均ＨＡＭＡ値にｍｕｍ差の２倍を加えて 得られた正常範囲は０．３６μｇ／ｍｌであった６表１で示されたように、造影 術未経験対照患者全員のＨＡＭＡ値が正常範囲であった。真正陽性ＣＥＡ群（表 ２）の試料も全部正常のＨＡＭＡ値を示した。

偽陽性ＣＥＡ群（表３）の血漿のＨＡＭＡ値は、正常濃度（＝０．３６ｔｔｇ／ ｍｌ）から８４．５μｇ／ｍｌまでの広範な範囲を示した。５個の試料は０．３ ６μｇ／ｍ１未満であった。非改良ＥＬＡにおけるＣＥＡの偽上昇の程度は、線 状回帰分析を用いて測定された血漿ＡＨＭＡの濃度に対して有意の関係を示さな かった＜ｐ＝ｏ、０６５）、改良ＥＩＡによって陽性のＣＥＡ値（＞５．０ｎｇ ／ｍｌ＞を与え続けた試料でのＨＡＭＡ力価は、概して、陰性（≦５．Ｏｎｇ／ ｍｌ　＞のＣＥＡ値を与えた試料の力価（６，９９±８．１７＞よりも高いもの であっな（１８，９±２４．９＞、Ｌかしながら、この相違は、広範囲に及ぶ値 および付随的に高い標準偏差ゆえに統計学的に有意ではなかった。

したがって、ＨＡＭＡＪ度と、偽陽性のＣＥＡ値を補正する改良ＥＩＡの能力と の間の統計学的相関関係は得られなかった。

部分的に抑制可能なＣＥＡ群（表４）でも、ＨＡＭＡ値は、正常濃度（２個の試 料）から高い値＜６５．６μｓ／ｍｌ）までであった、この患者母集団では、Ｈ ＡＭＡＪ度と、非改良ＥＩＡでのＣＥＡの偽上昇の程度との間に、非改良ＥＩＡ ＝ｍ１ｇＧ（Ｐ＝０．０１３）にも改良ＥＩＡ（ｐ＝０．００７）にも相対的な 有意の関係か存在した。非改良キットでのＨＡＭＡ干渉の程度も、表３および表 ４からの試料を組合わせ且つ線状回帰分析によって同様に分析した場合（非改良 ＥＩＡ−’、ｍｒｇＧによりｐ＝０．００１９および改良ＥＩＡによりｐ＝０． ００１３、ｎ＝４３）　、ＨＡＭＡ濃度と有意の関係を有することが示された。

おもしろいことに、ＨＡＭＡ濃度と、改良検定および非改良検定−ｔ−ｍＩｇＧ （ｐ＞０．０３＞によって得られたＣＥＡ濃度の抑制の相違との間には、統計学 的に有意の関係は見られなかった４改良ＥＩＡでのＣＥＡ（ｉａか、非改良ＥＩ Ａ＝ｍＩｇＧでの値よつし有意に高いこのような部分的に抑制可能な試料では、 そのＨＡＭＡ値は低かったが、その程度はＣＥＡ［がこれらの検定の間で十分に 補正された試料の場合はど有意ではなかった（ｐｒｏ、１５）、したがって、改 良ＥＩＡかこれらの検体中のＣＥＡ値を正しく低下させることができなかったこ とは、ＨＡＭＡの濃度とは無関係であった。

改良ＥＩＡおよび非改良ＥＩＡ＋ｍ１ｇＧによって得られた試料のＣＥＡ値を、 標準非改良ＥＩＡ単独で得られた対応する値の比として示した（図２）、これを ４人の患者群のそれぞれについて行った。血漿ＣＥＡ値は、ネズミ抗体を与えら れなかった患者（対照群１）または測定可能なＨＡＭＡがほとんど若しくは全く なかった患者（真正陽性群２）についての３種類の検定全部で同様であった。し かしながら、測定可能なＨＡＭＡを有する患者〈群３およびｔ１４）については 、非改良検定を用いて得られたＣＥＡ値と、他の２ｓ類の検定によって得られた 値との間に実質的な相違が存在したｌも顕著な相違は、改良ロシュＥＩＡおよび 非改良ロシュＥＩＡ十ｍＩｇＧによってそれぞれ９５．３％および９８．９％の 全体平均抑制％が得られた偽陽性の群である群３で見られた（表３）。

（検定用に稀釈後の）患者の血漿試料に対する多クローン性マウスＩｇＧ（ｍＩ ｇＧ）２００μｇの外因的添加により、いかなるＨＡＭＡの作用も除去され、結 果として真正ＣＥＡ測定値を生じることが示された。このｍＩｇＧの量は、血漿 試料を、それらのＣＥＡｅ５および２０ｎｇ／ｍｌの間（標準曲線の線状部分） にした後にｍＩｇＧを加えるように、それらの見掛けのＣＥＡ力価にしたがって 稀釈するので、存在する任意のＨＡＭＡ濃度を十分に越えるように選択された。

見掛けのＣＥＡが完全にＨＡＭＡによるものであるとしても、このｍＩｇＧの量 は、稀釈された血漿試料中に存在するＨＡＭＡを遥かに趣えている。したがって 、試料に加えられるｍＩｇＧｆｉ度は見掛けのＣＥＡ値を減少させる能力の制限 因子であるとは考えられない。

ｍｌｇＧを添加しても、ＨＡＭＡ不在ではそれ自体の検定に影響を及ぼさないこ と（表１および表２）が示された。ＣＥＡ値は、対照群（ｎ、＝１３＞でも真正 陽性群（ｎ−１５）でも、非改良検定にｍＩｇＧを加えることによって実質的に 変化しなかった（ｒ＝０．９９、ｐｒｏ、０５）、しがしながら、ＨＡＭＡ存在 下では、非改良検定にｍＴｇＧを加えてＪ（ＡＭＡの干渉を阻害することにより 、ＣＥＡ値が減少し、結果として、２１１５８　（３６，２％）の偽陽性の検体 および２２１５８　（３７゜９％）の部分的に抑制可能な検体を生じた（図３ａ ）。

従来公表された結果に、診断を下す目的でインジウム−１ｔｘａ織抗ＣＥＡ単ク ロ一ン性抗体を与えられた結腸癌患者での偽高ＣＥＡ値の発生率が報告されてお り、モートン・ビー・エイ（Ｍｏｒｔｏｎ、Ｂ、Ａ、）ら、Ａｒｃｈ。

旦且二盈工、１ヱユ：Ｌ２４２〜６　（１９８８）を参照されたい、ＣＥＡの偽 上昇が示された２０ｍｇを上回るＭＡＢを与えられた（他の疾患症状がないＬ’ Ａ者８人のうち６人（７５％）が測定可能なＨＡＭＡを有していた。用いられた ＣＥＡ検定法は、ロシュニ抗体ＥＩＡであった。この研究において、非改良ＥＩ ＡでのＣＥＡ力価の偽上昇が示された３６／４３（８４％）の患者が測定可能な ＨＡＭＡを有していた。従来、モートンらの上記文献に記載されたように、これ は、測定可能なＨＡＭＡの存在とＣＥＡ濃度の偽上昇との闇の強い相関間係を示 している。更に、ＨＡＭＡの濃度とＣＥＡの偽上昇の程度との間の有意の関係は 、偽陽性および部分的に抑制可能なＣＥＡ試料を組み合わせた群で示された（ｐ ＜０．００５）、この関係は、部分的に抑制可能な試料でなお一層強く且つ実際 に、偽陽性の試料（ｐ＝０．０６５）で有意であるには若干不十分であった。こ の関係を更に注意深く研究するには、一層大きな試料の大きさが必要である。し かしながら、これらの観測値は、ＨＡＭＡ力価と、３種類の商業的に入手可能な ＣＥＡ免疫検定でのＣＥＡ測定値の干渉の程度との間の直接の相関関係を示した ハンセン・エイチ・ジェイ（Ｈａｎｓｅｎ、Ｈ，Ｊ、）ら、ＣＩ　ｉ　ｒｔ、　 Ｃｈｅｍ、　。

ユ旦工工ｌ：１４６〜５１　（１９８９＞のらのに一致している。この群で、非 改良ロシュＥＩＡがＨＡＭＡ干渉に対して最も感受性であることが分かった０本 願書で記載したデータは、ＨＡＭＡ力価１度と、偽陽性ＣＥＡ群かまたは部分的 に抑制可能な群での偽高ＣＥＡ値を補正する改良ＥＩＡの能力との間のいずれの 関係も立証していない。

この研究から集められたデータにより、新規に修正されたＣＥＡ、−ＥＩＡ検定 キットは、偽陽性の結果の発生率力吠いに改良されているが、それは、ｍｉｇＧ を添加した非改良検定か可能である程度までＨＡＭＡ干渉を十分に抑制すること はできないことが明らかに示される。全体として、改良検定によって、１０／４ ７　（２１，５％）の偽陽性のＣＥＡ測定値および１２／４７　（２５，５％） の部分的に抑制可能なＣＥＡ力価が得られた（図３ｂ）、非改良検定を用いてＣ ＥＡに偽陽性であることが分かった２１個の試料の群において、１０個（４８％ ）で、改良検定によって偽陽性のＣＥＡｆｉｉが示されたままであった。改良ロ シュＥｒＡによって陽性のＣＥＡ力価〈〉うｎｇ／ｍｌ）を与え続けたが、ｍＩ ｇＧの添加に対して陰性であった造影術経験患者のこのサブグループが問題の患 者群である。臨床的には、ＣＥＡの血漿濃度は、潜在的に治療効果のある方法を 施された患者の追跡処置で用いられる。ＣＥＡ力価の上昇は、残留性または再発 性の結腸直腸癌の早期指標であり、そのままで更に、疾患の部位の局在性につい ての診断用試験または外科的診査（すなわち、二次的な一見のための開腹術）の 必要性を意味することがあり、シヴアリー・ジエイ・イー（Ｓｈｉｖｅｒｙ、Ｊ 。

Ｅ、）ら、Ｃｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｏｎｃ、Ｈｅｍ、、２：３５５Ｎ３９９（１９８ ５＞を参照されたい、　ｐＡえば、血ａｌｃＥＡの偽上昇は、広範な不必要な試 験または不必要な外科的方法さえも導くことがある。したがって、偽陽性ＣＥＡ 値の除去は臨床的に最も望ましい。

部分的に抑制可能な２２個の検体の群において、１２個（５５％）で、改良検定 を用いるＣＥＡ値が、非改良検定工ｍＩｇＧによって示された値と比較した場合 に、有意に一層高い値を示し続けたが（ｐ＜０．０５）、おもしろいことに、こ の相違はＨＡＭＡの濃度には直接関係していなかっな、したがって、偽陽性群で ら、部分的に抑制可能な群でも、改良ＥＩＡによって、試験された試料の約半分 のＨＡＭＡ干渉が訂正された。非改良検定＋ｍ１ｇＧおよび改良検定の間の値に 不一致が存在した１６個のこれらの患者の血漿試料について、多クローン性ｍＩ ｇＧをその血漿に加えた後に改良キットで試験して再検定した。それぞれの場合 において、ｍＩｇＧを改良検定に加えることは、非改良検定にｍＩｇＧを加えて 得られたＣＥＡに匹敵する１度まてＣＥＡを回復させた。このａ測の結果として 、手術の前に＠瘍シンチグラフィー用に放射標識抗ＣＥＡ単りローン性抗体を与 えられ且つ手術後に見掛けの高ＣＥＡ値を示す患者全員に対してｍＩｇＧを加え て改良ＥＩＡで再試験を行うことが望ましい、この方法で、偽高血漿ＣＥＡ値を 避けることができる。

患者に投与された遺影剤はネズミＩｇＧＬ単りローン性抗体であったので、改良 ＥＩＡにおいて残留する湯高ＣＥＡ試料を補正するためにネズミ単りローン性抗 体を加えることの有効性を試験した。各単クローン性抗体を単独で加えることは ＣＥＡ濃度を減少させるのに若干の効果があることが分がっな、しがしながら、 ３種類のモノクローナルの例示された組合わせ（１：　１　：　１、総量１００ μｇ）では、多クローン性ｍＩｇＧを加えることによって生じたＣＥＡ値を最も 一貫して反映しなＣＥＡ値か得られた。おもしろいことに、ＩｇＧＩ　ＭＡＢを １００μｇ加えることは、患者に与えられた免疫原がｒｇＧＩ単クローり性抗体 であったとしても、ＨＡＭＡ干渉を除去することにおいては混合物はど有効では なかった。ＨＡＭＡ干渉の除去が、多クローン性ｍＩｇＧまたは単りローン性Ｉ ｇＧサブクラスの混合物を用いるとどうして一層有効であるのがということはま だ明らかにされていない。

これらのデータの臨床的な意義は、予めネズミ抗体にさらされたこの特有な患者 母集団について、従来のＣＥＡロシュ■ＥＩＡで測定した場合には、ＣＥＡ測定 値の誤差４７％と一緒に偽陽性発生率が２１％存在していることである。血漿ま たは血清中のＣＥＡ濃度は結腸直腸癌患者の再発性疾患を評価するための診断上 の道具として用いられるので、抗原に関係したこの腫瘍についての検定が可能な かぎり正確であるということが重要である。ネズミ単りローン性抗体を与えられ 、そしてそのＣＥＡ力価が二抗体法によって測定される患者においてＨＡＭＡの 存在によって生じた偽陽性の結果は、ｍＩｇＧを加えて阻害することによって除 去することができる。ここで示した結果により、ＨＡＭＡを効果的に阻害するこ とは、単一の単クローン性抗体ｒｇＧによっては行われないが、ＩｇＧサブクラ スの混合物または多クローン性ＩｇＧが必要であることが示される。ＨＡＭＡ干 渉をｍＩｇＧによって阻害することの、熱抽出法にまさる利点は、分析物がＣＥ Ａ程熱耐熱耐性いことがある池の二抗体検定法で用いることができることである ６ 高濃度の多クローン性ｍＩｇＧをキット構成成分に加えることは、商業的に適当 ではない。したがって、本発明によって、関係のない単クローン性ｍＩｇＧの混 合物を用いることにより、一層適当な方法を提供する。

ＦＩＧ、２ 国際調査報告 （’ｔｒｌｕ＋　ｅｅｌｏｔｔｓＥ／ １ｍ＆Ｍ１ｍ＋ｔａｌ　Ａｅａｋａ＋１ｏｎ　Ｎ。Ｐｅｙ／ｕｓ　’？ｅ　／ｘ ｚ３ｊ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト血漿試料またはヒト血清試料の二抗体検定法においてヒト抗ネズミ抗体 または異好性抗体の存在の結果として起こる干渉を低減または除去するための方 法であって、前記の試料を多数の単クローン性抗体インタイプと一緒にインキュ ベートした後に前記の検定法を行うことを特徴とする前記の方法。
2. ２．前記の検定法がエンザイムイムノアッセイである請求項１に記載の方法。
3. ３．前記の検定法が癌胎児抗原（ＣＥＡ）のためのものである請求項１または２ に記載の方法。
4. ４．ヒト血漿試料またはヒト血清試料の二抗体エンザイムイムノアッセイにおい てヒト抗ネズミ抗体または異好性抗体の存在の結果として起こる干渉を低減また は除去するための方法であって、前記の試料を少なくとも３種類の抗体イソタイ プの混合物と一緒にインキュベートした後に前記の検定法を行うことを特徴とす る前記の方法。
5. ５．前記のイソタイアがＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂである請求項４ に記載の方法。
6. ６．前記の血漿試料または血清試料約１００μ１〜１５０μ１を、前記の抗体イ ソタイプの混合物約７５μ１〜約１５０μ１と一緒に約３０℃〜約５０℃の温度 で約１５分間〜約９０分間インキュベートする請求項５に記載の方法。
7. ７．それぞれの抗体イソタイプが、およそ等重量比で前記の混合物中に存在して いる請求項６に記載の方法。