CN1489693B - 用于量化糖化的蛋白质的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于量化生物样品中糖化的蛋白质定的方法，所述方法使用固体载体基质，在糖化的和非糖化的蛋白质都结合在该载体上的条件下进行第一结合蛋白质测量，在糖化的蛋白质结合在该载体上而非糖化的蛋白质基本上不结合的条件下进行第二结合蛋白质测量。还提供了包含本发明方法的诊断装置和试剂盒。

Description

用于量化糖化的蛋白质的方法和装置
优先权信息
本申请要求美国专利申请序列号60/265,229(提交于2001年1月31日)的优先权。
发明领域
本发明涉及用于定量测定生物样品中的糖化的蛋白质的含量的方法，该生物样品适合用于比如糖尿病患者用来自行监测血糖浓度的反射计。
发明背景
控制糖尿病患者的血糖浓度已表明能降低该疾病的慢性的微血管和神经性的并发症的发病频率和严重程度。血液中糖化的血红蛋白和蛋白质的测量可用来测定血糖浓度在一段较长的时间里被控制得如何。
糖化的血红蛋白的生成速度和血液中葡萄糖的浓度直接相关。红血细胞的平均寿命为120天，因此，血红蛋白糖化的百分数的定量测定已经和前2至3个月的平均葡萄糖浓度的量度相关联，该量度是这一时期血糖控制的量度。(见“糖尿病控制和并发症试验研究组，糖尿病的深度治疗对胰岛素依赖性糖尿病的慢性并发症的发病进程的作用(Diabetes Control andComplications Trial ResearchGroup，The effect of intensive treatment of diabetes on the development ofprogression of long-term complications in insulin-dependent diabetesmellitus)”，New England Jourual of Medicine，329，977-986(1993)，和“美国糖尿病协会，糖尿病中高血糖症的试验(American Diabetes Association，Tests ofGlycemia in Diabees”，Diabetes Care，20(增补本1)，S18-S20(1997))。
葡萄糖也连接到血液中的非血红蛋白的蛋白质上，如白蛋白。因为白蛋白是含量最丰富的血清蛋白质，它的循环寿命是大约20天，所以，糖化的蛋白质的浓度是在前2至3周中平均葡萄糖浓度的量度。葡萄糖的量度直接给出测量时的葡萄糖浓度。
已报道一种固定化的二羟基硼基化合物用来与糖化的蛋白质的碳水化合物的1，2顺二醇结合，使它们能与非糖化的蛋白质分离。将这一技术用在柱色谱法中用来测定糖化的百分数已有报道(参见Dean的发表于1981年5月26日的美国专利号4,269,605和Rosenthal的发表于1994年2月8日的美国专利号5,284,777)。据说这些方法使用了固定在柱中的琼脂糖珠上的硼酸酯衍生物，以将样品中糖化的蛋白质与非糖化的蛋白质分离。这些方法需要特殊的稀释度并将样品吸移，使得固定在琼脂糖珠上的亲和结合基的容量不被过载。使用固定在琼脂糖珠上的硼酸酯衍生物使该技术不能用于条带。
Kricka等的在1992年5月5日发表的美国专利号5,110,745据说叙述了检测样品中的糖化的蛋白质的多种方法，其中使样品与溶液中的确定过量的硼酸酯化合物接触。据说未结合的硼酸酯的测量可通过使其与固定在载体基质上的糖化的分子结合并测量未络合的糖化的分子的量而进行。该方法看来需要许多步骤，包括：在进样到固体载体之前先在溶液中进行分开的反应，稀释样品以确保加入生物样品中的结合分子的量是过剩的，进行分开的测试以测定蛋白质糖化的百分数以及多次结合和洗涤步骤。
据说在1989年8月29日授予Waguer的美国专利4,861,728中叙述了一种用于测量糖化的血红蛋白的尺量法。据说此方法包括使连接在固体载体上的血红蛋白结合剂与事先已和连接有荧光标记的二羟基硼基化合物混合的经溶解的血液样品接触。据说该载体结合非糖化的血红蛋白和荧光标记的糖化的血红蛋白。据说该荧光标记是通过二羟基硼基化合物结合在糖化的血红蛋白上的。固相与样品分离，总血红蛋白用反射光度学测量，同时糖化的蛋白质用荧光测量。据说这个方法需要将一定量的荧光标记的二羟基硼基试剂加入至样品中，并且在将它从样品中分离之后需要一次洗涤步骤。它还需要两种不同的用来定量的测量方法。
在其它测试中(例如参见日本专利号号6,058,936，欧洲专利号455255和已出版的PCT申请WO96/03657)，据说使用了一种偶联在可检测标记物(如荧光化合物、化学发光化合物、同位素、酶或其它标记物)的硼酸酯衍生物。糖化的和非糖化的蛋白质都用一种通用的亲和结合剂(如抗体)结合在固体载体上。加入硼酸酯一标记物络合物，测量仍旧与固体载体结合的标记物的量。这些种类的方法每种都需要标记糖化的蛋白质的额外步骤。此外，为了定量总的和糖化的蛋白质，这些测试使用了不同的测量方法。
已出版的PCT申请WO9840750(于1998年9月17日出版)据说叙述了测定糖化的血红蛋白的百分数的一种方法，其中用固定化的硼酸酯结合样品中糖化的血红蛋白。据说结合的糖苷化的血红蛋白的量与样品中糖苷化的血红蛋白的分数成正比。据说此方法免除了为了测定糖化的百分数而测量非糖化的血红蛋白的需要。然而，看来此方法的结果可能随因糖苷化的蛋白质与硼酸化的载体共温育的时间而发生变化。
因此，需要一种简单、快速并有效的方法来定量测定生物样品中的糖苷化的蛋白质的量，该方法不需要稀释样品，只需最少的测定步骤，可以和简单的检测仪器(例如手提反射计)联合使用，并可用于标准的条带测试。
发明概述
本发明涉及用于定量测定生物样品中的糖化的蛋白质的方法，使用这些方法的装置，以及包含这些装置的试剂盒。
葡萄糖、糖化的蛋白质和糖化的血红蛋白的测量结果可以提供血糖控制的更完整的图像。即时葡萄糖浓度的测量可用来调节用药、膳食或锻炼。对于中期血糖控制的测量，糖化的白蛋白浓度的测量可使人们能够跟踪最近的生活方式改变的影响。对于长期的血糖控制的测量，糖化的血红蛋白浓度的测量使人们能够监测变化的总效果。如果有一种方案一次试验可以得到所有三个结果，这将是很方便的。它可被用于医生的诊室实验室中，这样就可以在病人看病的时候和病人讨论这些结果，或者，可由病人在家里使用。目前，血糖可用手提血糖计进行日常监测且易于使用条带。但是，类似的用于糖化的蛋白质和血红蛋白的试验尚不可得。
本发明方法提供定量测定生物样品中的糖化的蛋白质的方法。使生物样品在一定条件下与固体载体基质接触，在该条件下糖化的和非糖化的蛋白质都结合到固体载体基质上。加入一定量足以洗去未结合的蛋白质的第一缓冲液。进行第一次结合蛋白质的测量以测定总的(糖化的非糖化的)结合蛋白质。将第二缓冲液加入固体载体基质，将条件改变为糖化的蛋白质被结合而非糖化的蛋白质基本上不被结合，并且加入的量要足以洗去未结合的(非糖化的)蛋白质。进行第二次结合蛋白质的测量。用第一次和第二次结合蛋白质的测量定量测定糖化的蛋白质。
本发明一方面涉及定量测定样品中的糖化的蛋白质的方法，该方法包括：(a)使含有带负电荷的基团和羟基硼基化合物并具有一定的测量区域的固体载体基质与足以覆盖所述测量区域的生物样品接触；(b)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第一缓冲液接触，其中所述第一缓冲液具有经过选择以使糖化的和非糖化的蛋白质都结合在所述的固体载体基质上的pH值；(c)利用对所述蛋白质被选性质的测量来量化结合到所述测量区域的蛋白质以得到第一结合蛋白质读数；(d)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第二缓冲液接触，其中所述的第二缓冲液具有经过选择以使糖化的蛋白质结合在所述固体载体基质上，而非糖化的蛋白质基本上不结合在所述固体载体基质上的pH值；(e)利用对步骤(c)所测性质的测量来量化结合到所述的测量区域的蛋白质以得到第二结合蛋白质读数；(f)用所述第一和第二结合蛋白质读数计算糖化的蛋白质的百分数。
本发明的另一方面涉及定量测定样品中的糖化的蛋白质的方法，该方法包括：(a)使含有带负电荷的基团和羟基硼基化合物并具有一定的测量区域的固体载体基质与足以覆盖所述测量区域的生物样品接触；(b)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第一缓冲液接触，其中所述第一缓冲液的pH约为5.0-7.0；(c)量化结合到所述测量区域的蛋白质以得到第一结合蛋白质读数；(d)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第二缓冲液接触，其中所述的第二缓冲液的pH约为8.0-10.0；(e)量化结合到所述的测量区域的蛋白质以得到第二结合蛋白质读数；(f)用所述第一结合蛋白质读数和第二结合蛋白质读数计算所述样品中糖化的蛋白质的百分数。
优选，并为了方便，第一和第二结合蛋白质读数测量相同的性质。较好的是，所测性质是光学读数。更优选的是，光学读数是特定波长的吸收值或反射值。
按照本发明的一个优选的方面，提供了用于定量测定生物样品中的糖化的血红蛋白的方法，它包括：(a)使该生物样品与固体载体基质接触，该固体载体基质包含带负电荷的基团和二羟基硼基化合物，并具有一定的测量区域，进样点与固体载体基质相通；(b)在所述进样点加入一份第一缓冲液，其中所述第一缓冲液的pH约为5.0-7.0；(c)在血红蛋白吸收光的波长下做出所述测量区域的第一光学读数；(d)在所述进样点加入一份第二缓冲液，其中所述第二缓冲液的pH约为8.0-10.0；(e)在血红蛋白吸收光的波长下做出所述测量区域的第二光学读数；(f)用所述的第一和第二光学读数计算所述血液样品中的糖化的血红蛋白的百分数。此处生物样品是包含红血细胞的血液样品，在进行第一光学读数之前该样品先与红血细胞溶解试剂接触。在与固体载体接触之前血液样品可用红血细胞溶解试剂预先处理。或者，第一缓冲液还包含红血细胞溶解试剂，或在与生物样品进行接触之前，固体载体基质可用红细胞溶解试剂进行处理。
按照本发明的另一个优选方面，提供了定量测定糖化的非血红蛋白的方法，包括：(a)使生物样品与和固体载体基质相通的进样点进行接触，固体载体基质包含带负电荷的基团和二羟基硼基化合物，并具有一定的测量区域；(b)在所述进样点加入一份第一缓冲液，其中所述第一缓冲液的pH约为5.0-7.0；(c)在所述蛋白质吸收光的波长下做出所述测量区域的第一光学读数；(d)在所述进样点加入一份第二缓冲液，其中所述第二缓冲液的pH约为8.0-10.0；(e)在所述蛋白质吸收光的波长下做出所述测量区域的第二光学读数；(f)用所述的第一和第二光学读数计算所述生物样品中的糖化的蛋白质的百分数。适用于本发明该方面的生物样品包括血浆和血清样品。用于本发明这方面的定量测定的适合的糖化的蛋白质是白蛋白。对于某些糖化的蛋白质的定量，优选的是这些蛋白质被合适的蛋白质特异性标记试剂标记。
用作第一缓冲液的优选的缓冲系统包括MES[2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，MOPS[3-(N-吗啉代)丙烷磺酸和HEPES[N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸]。
用作第二缓冲液的较好的缓冲液包括乙酸铵和牛磺酸缓冲液。
按照本发明的另一方面，提供了利用上述方法进行糖化的蛋白质的定量测定的诊断装置。较好的所述蛋白质是血红蛋白或白蛋白。
另一方面，还提供了试剂盒，它包含上述的诊断装置，第一缓冲液(pH约5.0-0)；和第二缓冲液(pH约8.0-10.0)。
定义
按照本发明在本文中的使用，除非另有说明，将下列术语定义为下列含义：
术语“烷基”指饱和脂族基团，包括直链、支链和环状(包括多环)基团。
术语“羧酸基”或“羟基”指基团-COOH。
术语“磷酸基”指基团-PO4。
术语“硫酸基”指基团-SO4。
术语“亚磺酸基”指基团-SH2H。
术语“磺酰基”指基团-SO3H。
“Hb”指血红蛋白。
“HEPES”指[N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸]
“K”，当用在测量光吸收或反射的场合时，指吸收系数。
“MES”指[2-(N-吗啉代)乙烷磺酸。
“MOPS”指[3-(N-吗啉代)丙烷磺酸。
“S”，当用在测量吸收或反射的场合时，指散射系数。
附图简述
图1是在测试中结合在固体载体上的糖化的血红蛋白(实心三角形)和总血红蛋白(空心三角形)的吸收值对浸泡时间的曲线图和糖化的血红蛋白与总血红蛋白之比(空心圆圈)对浸泡时间的曲线图。使用了不同的载体，已用硼酸酯衍生化以增加时间长度。
图2是键合的血红蛋白在415nm的光吸收值对一个糖尿病样品的血液溶解产物的温育时间的曲线图，将单一测量测试(*代表糖化的)与本发明方法(圆圈代表总Hb，空心三角形代表糖化的Hb)作比较。
图3是糖化的血红蛋白或糖化的血红蛋白部分在415nm的光吸收值对一个糖尿病样品的血液溶解产物的温育时间的曲线图，将单一测量测试(采用已发表的PCT申请WO98/40705“*”的方法)与本发明方法(空心三角形)作比较。
图5是在一定pH范围内结合在硼酸酯化的载体上的血红蛋白(实心圆圈)和白蛋白(空心三角)的吸收值曲线图。
图6A、6B和6C是三种条带构造，可用于本发明的方法。
图7是K/S对糖化的血红蛋白的百分数(*)的曲线图，表明在使用本发明方法的一个条带测试方案中本发明的测试结果与样品中糖化的血红蛋白的浓度成正比(空心三角表示总血红蛋白)。
图8是糖化的血红蛋白的K/S分数(糖化的血红蛋白除以总血红蛋白)对糖化的血红蛋白百分数的曲线图，表明在使用本发明方法的一个条带测试方案中该分数与样品中的糖化的血红蛋白的浓度成正比。
图9是总白蛋白(空心三角)和糖化的白蛋白(“*”)在280nm的光吸收值对在样品中的相对果糖胺含量的曲线图(与糖化的白蛋白的分数量成正比)。
图10是糖化的白蛋白与总白蛋白之比(在280nm的吸收值)对样品中的相对果糖胺含量的曲线图(与糖化的白蛋白的分数量成正比)。
图11是结合的总血红蛋白(实心三角)和糖化的血红蛋白(空心三角)在415nm的光吸收值对侧向流动装置中的总血样体积的曲线图。(见图6A)。
图12是糖化的血红蛋白与总血红蛋白之比对侧向流动装置中总血样体积的曲线图。(见图6A)。
图13是血红蛋白(空心三角)和糖化的血红蛋白(“*”)在415nm的光吸收值对糖尿病血样溶解物的稀释度的曲线图。
图15是糖化的血红蛋白除以总血红蛋白在415nm的光吸收值对正常的(“*”)和糖尿糖的(空心三角)血样溶解产物的稀释度的曲线图。
图16A和16B是曲线图，表明使用本发明的测试和两种其它可购得的用于血红蛋白AlC的测试的全血测试结果之间的关联。图16A是用本发明的测试(见实施例9)所得的结果对用Integra 400(Roche Diagnostics)所得的结果的曲线。图16B是用本发明测试(见实施例9)所得的结果对用DCA 2000(Bayer)所得的结果的曲线。
发明详叙
本发明的一个方面是提供生物样品中的糖化的蛋白蛋的量化的方法，其中样品和试剂都施加到固体载体基质上，所述基质优选包含带负电荷的基团和羟基硼基化合物。在固体载体的单一位置进行总蛋白质和糖化的蛋白质的商量。该测量可通过测量蛋白质的一种选定的性质来方便进行。有利的是，此方法不需要测量生物样品的体积。
本发明的一个方面涉及样品中的糖化的蛋白质的量化的方法，其中固体载体基质(包含带负电荷的基团和羟基硼基化合物并具有一定的测量区域)与一份足以覆盖该测量区域的生物样品接触。然后使固体载体基质与第一缓冲液接触，选择第一缓冲液的pH使得糖化的和非糖化的蛋白质都能结合在固体载体基质上，第一缓冲液的量要足以洗去未结合的蛋白质。结合在测量区域上的蛋白质的量通过测量蛋白质的选定的性质来量化，得到第一结合的蛋白质读数。然后使固体载体基质与第二缓冲液接触，选择第二缓冲液的pH使得糖化的蛋白质能够结合在固体载体基质上而非糖化的蛋白质基本上不能结合在固体载体基质上，第二缓冲液的量要足以洗去未结合的蛋白质。结合在测量区域上的蛋白质的量通过测量同一个选定的性质(如用来获得第一结合蛋白质读数一样)来量化，得到第二结合蛋白质读数。糖化的蛋白质的百分数用第一和第二结合蛋白质读数计算。
另一方面，本发明涉及样品中的糖化的蛋白质的量化的方法，其中固体载体基质(包含带负电荷的基团和羟基硼基化合物，并具有一定的测量区域)与一份足以覆盖该测量区域的生物样品接触。然后使固体载体基质与第一缓冲液(pH约5.0-7.0)接触，缓冲液的量要足以洗去未结合的蛋白质。结合在测量区域上的蛋白质的量被量化，得到第一结合蛋白质读数。然后使固体载体基质与第二缓冲液(pH约8.0-10.0)接触，第二缓冲液的量要足以洗去未结合的蛋白质。将结合在测量区域上的蛋白质的量量化，得到第二结合蛋白质读数。生物样品中的糖化的蛋白质的百分数用第一结合蛋白质读数和第二结合蛋白质读数计算。
本发明方法可方便地用来量化糖化的血红蛋白或糖化的非血红蛋白(如百蛋白)的量。
在糖化的血红蛋白的量化中，一般使用血液样品。在进行第一结合蛋白质读数之前，血液样品先与红血细胞溶解试剂接触。可在加到固体载体上之前使样品与红血细胞溶解试剂接触(如通过样品的预处理)。红血细胞溶解试剂也可以通过预淋洗被加到固体载体上，然后把样品加入载体。或者，第一缓冲液可以包括红血细胞溶解试剂。适合的红血细胞溶解试剂在本领域技术人员中是已知的，包括Triton X-100和Igepal CA-630。
较准的是，第一和第二结合蛋白质读数是光学读数。更佳的是，所选择的被测量性质是在特定波长的吸收值或反射值。
按照本发明优选的方面，所述的固体载体基质的二羟基硼基化合物具有下列结构：
Figure G028043723D00081
其中，R选自苯基、取代的苯基、氢和1-6个碳原子的烷基。当R为烷基时，合适的烷基包括乙基、1-丙基、和3-甲基-1-丁基。优选的R是间氨基苯基。
合适的固体载体基质包括选自纤维素、硝基纤维素、乙酸纤继素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和聚丙烯酰胺的共聚物、琼脂糖、淀粉、尼龙、尼龙聚酯、葡聚糖、交联的葡聚糖、葡聚糖-丙烯酰胺共聚物、交联的甲基丙烯酸羟乙酯取代的交联聚苯乙烯、聚乙烯醇、羊毛、金属氧化物、用亲水有机聚合物涂布的多孔陶瓷和玻璃。较佳的是，固体载体基质包含带负电荷的基团。优选的固体载体基质是纤维素。较佳地，带负电荷的基团包括磷酸基、硫酸基、磺酸基、亚磺酸基和羧酸基(或羧基)。优选的带负电荷的基团是羧酸基。
I测试
按照本发明方法的一个方面，在一种pH条件下将糖化的和非糖化的蛋白质结合到包含带负电荷的基团和固定化听含二羟基硼基化合物的固体载体基质上。在结合之后在第一pH条件下进行总蛋白质的测量。在第二pH条件下淋洗载体结合的蛋白质络合物以除去未结合的蛋白质之后，进行糖化的蛋白质的测量。从第二次测量相对于第一次测量的百分数计算百分糖化作用。这个测试对于测量血液、血清和血浆样品中的糖化的血红蛋白和糖化的蛋白质特别有用。
本方法可用于诸如毛细管血、全血、血清或血浆等生物样品。按照一个优选的方面，可用一个波长进行两个测量(总的和糖化的)。本测试很容易适应使用与糖尿病用来自行监测血糖相同的血糖计。因为可以在固体载体的同一个位置进行两种测量(见实施例5)，所以载体上不同位置之间的差异不会影响测量结果。
II固体载体基质和固定化的结合剂
固体载体基质可以是天然的或合成的聚合物材料之一种，在它们上面可连接带负电荷的基团和二羟基硼基化合物，样品和试剂流过该固体载体基质。适合的载体基质包括，例如，纤维素、尼龙、硝基纤维素、乙酸纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖聚丙烯酰胺共聚物、琼脂糖、淀粉、尼龙聚酯、葡聚糖、交联的葡聚糖、葡聚糖丙烯酰胺共聚物、交联的甲基丙烯酸羟乙酯取代的交联聚苯乙烯和聚乙烯醇。其它可用于本发明的载体包括在美国专利号4,269,605中所列出的那些。此外，其它适合的载体在本领域中是已知的。优选的固体载体基质是纤维素纸。
二羟基硼基化合物(优选苯基硼酸、硼酸或其它有机硼酸，更优选间氨基苯基硼酸)可通过机械的、物理的或化学的方法，优选通过共价化学键与固体载体结合。可通过本领域已知的方法进行对固体载体的连接。这种方法包括，例如，列举在美国专利号4,269,605(授予Dean等，1989年5月26日)中的那些。
在将二羟基硼基化合物连接在载体上之后，载体可用缓冲液或水淋洗。如果待测试的生物样品含有红血细胞，如果该测试是要测量糖化的血红蛋白，可将洗涤剂或其它红血细胞溶解剂包括在淋洗液中。(可用作红血细胞溶解剂的)合适的洗涤剂包括Triton X-100。在载体中存在溶解剂可帮助红血细胞从全血样品中溶解出来。或者，样品可用红血细胞溶解剂进行预处理，或者可将红血细胞溶解剂包含在第一缓冲液中。
III固体载体基质的构造
按照本发明的一个方面，固体载体基质与其它组件一起被置成条带状构造以便操作样品和缓冲液的流动。样品和缓冲液流过固体载体基质，在此发生结合，然后流入吸收材料，吸入过剩听溶液，使适当体积的缓冲液流过。溶液流过条带可延着固体载体基质的长度进行，如在侧向流动装置中的那样，或者通过固体载体的厚度进行，如在垂直流动装置中的那样(这些条带的构造示于图6A，6B和6C)。
在固体载体中适用的材料包括，例如，纤维素(包括纤维素纸)，硝基纤维素、乙酸纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖聚丙烯酰胺共聚物、琼脂糖、淀粉、尼龙、尼龙聚酯、葡聚糖、交联的葡聚糖、葡聚糖丙烯酰胺共聚物、交联的甲基丙烯酸羟乙酯取代的交联的聚苯乙烯、聚乙烯醇、羊毛金属氧化物、用亲水有机聚合物涂布的多孔陶瓷和玻璃。
IV样品和优选的缓冲液
适用于本发明方法的生物样品包括全血、血清、和血浆。如果需要，可用本领域已知的方法除去红血细胞。方法包括用玻璃纤维(美国专利号4,477,575授予Vogel等，10/16/84)，含碳水化合物的载体(美国专利号4,678,757，授予Rapkin，7/7/87)或含多元醇的基质(美国专利号5,725,774，授予Neyer，3/10/98)。
按照一个优选的方面(特别是用于非血红蛋白的糖化的蛋白质的量化)，样品可用蛋白质特异性结合剂(如“染料”)预处理以标记蛋白质，这可以帮助它们的浓度的测量。本发明可以使用各种本领域已知的这种染料。例如，可使用荧光染料如荧光素异硫氰酸酯(“FITC”)。
将样品加到固体载体上并让它流过载体。流动可以是通过载体的长度或通过其厚度。加入的样品的体积可有一定的范围，即从刚好足够匀覆盖测量区域的体积(如约3-5微升)至在合理的时间内会流过载体的体积(约40微升)。实际体积限度取决于固体载体和其它条带组件的尺寸。较大的(较宽的或较长的)条带能够处理较大体积的样品，但需要较大的最小体积去覆盖测量区域。较小的条带只需小体积，但不能够处理大体积。
在样品已被吸收入条带之后，加入第一缓冲液。第一缓冲液的pH优选在约5.0至约7.0之间。更优选的，第一缓冲液的pH为约5.5-约7.0(用来糖化的血红蛋白的量化)和约5.0-约6.5(用于糖化的血红蛋白的量化)。缓冲液含有适当的缓冲剂，它具有合适的PKa用于把PH控制在给定的范围，但它不会影响蛋白质的结合。适用于第一缓冲液的缓冲剂是本领域已知的。用于第一缓冲液的优选的缓冲剂包括MES、MOPS和HEPES。缓冲剂的存在浓度要足以将PH保持在需要的范围内。缓冲剂的适当的浓度为5mM-500mM。如果生物样品包括红血细胞，缓冲液可还包含细胞溶解剂，例如Triton X-100或Igepal CA-630。加入的缓冲液的体积可标准化为特定的滴数，适于洗出过剩的非结合的样品。也可以通过反射计来监测淋洗是否充分，办法是进行多次测量，最后的一次测量的改变基本上为零。
第二缓冲液优选的pH为约8.0-约10.0。第二缓冲液含有适当的
缓冲剂，其PK适于将pH控制在给定的范围内，但又不影响糖化的蛋白质结合在固定化的二羟基硼酸酯化合物上。适用于第二缓冲液的缓冲剂在本领域是已知的。适用于第二缓冲液的优选的缓冲剂包括乙酸铵和牛磺酸。缓冲剂的存在浓度要足以将pH保持在所需的范围内。缓冲剂的适当的浓度为约5mM-500mM，或者，高至缓冲剂的溶解度极限。可如第一缓冲液一样监测淋洗是否充分。任选地，缓冲液可含有二价金属离子(如Mg++)，以帮助使蛋白质结合到硼酸酯上稳定化。
V.量化
在各次淋洗之后结合在载体上的蛋白质的量可用本领域已知的测量方法量化，包括测量在一定波长的光吸收或反射。
按照本方法的优选方面，在加入样品并且过量样品用第一缓冲液淋洗去之后，进行固体载体的第一次反射值测量。该反射值测量用于计算总蛋白质浓度，使用从校正的数据得到的计算方法，或使用“K/S”值作为与浓度成正比的值。在用第二缓冲液从固体载体洗去非糖化的蛋白质之后，进行第二反射值测量。该测量和与第一测量相同的方法用来计算糖化的蛋白质的浓度。百分糖化的蛋白质是作为糖化的蛋白质浓度对总蛋白质浓度之比×100计算的。
当光线进入透明的介质时，一部份被吸收一部分通过介质。比尔定律告诉我们，光线被吸收的量(“A”)是吸收光线的材料的浓度(“c”)和光线通过介质的路程(“d”)的乘积(即，A＝ecd，其中e是吸光材料的消光系数)。当光进入固体时，反射出固体的量是由被固体所吸收的部份和被固体所散射的部份决定的。用来定义这一关系的模型是KubelKa-Munk理论。该模型定义了二个微分方程来表示当光通过固体后光强度的变化和光从固体散射回来后光强度的变化。议程式包括符号“K”(它是在固体中的吸收系数)和符号“S”(它是散射系数)。在简化的形式中，方程式简化为下列：K/S＝[(1-R)^2]/(2R)，其中R是测得的反射值，K/S正比于吸收/散射材料的浓度。在一些图中(例如见图7和8)，用反射计取得的数据作为K/S的Y值作图，它与分析物的浓度成正比。
在本测试中使用的方法学可改造为用于与葡萄糖测试的手持反射计一起使用的条带中。
结合到固体载体上的蛋白质的总量是由固定在载体上的带负电荷的基团的结合容量控制的。我们观察到，糖化的和非糖化的蛋白质以与在样品中相同的比例迅速结合到衍生化的载体上。因为任何过量的样品都要被淋洗出去，所以无需测量加至载体上的样品的体积。
报告的百分糖化作用是从在条带中的固体载体上同一个位置所作的二次测量之比计算的。因此，由不同的条带结合的蛋白质总量的变化不会影响报告的结果。因为总的和糖化的蛋白质是同相同的方法在固体载体上的相同的位置上测量的，所以影响测量的变量对二次测量有相同的影响，从而使“噪音”最小化。
为了帮助理解，本发明进一步用下列实施例加以说明。这些实施例，由于它们和本发明有关，当然不应被看作具体地限制本发明。同样，本发明的变体，无论是现在已知的或后来发展的(它们可能在本领域技术人员的视野范围之内)，都认为是处在本发明的范围之内，如在此或在此后所要求的。
实施例
实施例1
硼酸酯化的固体载体基质的制备
按照本发明检测方法的优选方面，适用于条带构造的固体载体基质可通过将硼酸酯衍生物，间氨基苯基硼酸酯用常规的连接化学共价连接到羧基纤维素基的材料上。
材料
1、固体载体基质：共价连接羧酸基团的纤维素基的固体(Sartobind C膜Sartoricus)。
2、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)(Pierce)
3、硼酸酯衍生物间氨基硼酸(Sigma-Aldrich)
4、缓冲液：0.1M MES缓冲液，pH6.5
方法
将46.7mg间氨基苯基硼酸溶于25ml 100mM MES缓冲液中。在硼酸溶解后钭pH重新调节至6.5。将28.9mg EDC溶于MES-硼酸溶液中。在固体载体基质浸在该溶液中一段需要的时间(25ml溶液足够处理一块30cm2的基质)。将基质从溶液中取出并在MES缓冲液中漂洗，风干。
用在实施例2中叙述的洗脱试验来测定上述的用不同的浸泡时间制备的硼酸化的固体载体基质的结合特性。所得的总的(空心三角)和糖化的血红蛋白(实心三角)的结合表示在图1。空心圆圈表示糖化的对总的血红蛋白的比。
随着更多的硼酸基团被加到固体载体基质上，越来越少的羧基留下来用于离子心结合。糖化的血红蛋白对总血红蛋白之比增加，直到存在足够的硼酸基团，这时即使总结合量降低了，但比值保持不变。
实施例2
可变的温育时间的作用
将用实施例1的硼酸化的载体进行的单一测量测试(“单一测量法”)与本发明方法进行比较，以确定可变的温育时间对各方法所得的浓度结果的影响。
进行下列的测试以比较这两种方法。在单一量法测试中，从非糖尿病个体和糖尿病个体得到的血液溶解样品用含50mM Mg++的500mM乙酸铵缓冲液(pH＝9.5)作1∶1的稀释，然后让样品与在实施中例1中制备的硼酸化的固体载体基质接触不同的时间段。温育之后，硼酸化的固体载体用乙酸铵缓冲液(pH＝9)淋洗。糖化的血红蛋白用含200mM山梨醇的tris缓冲液(pH＝8.0)洗脱。洗脱液的吸收值在415nm测定。
在相应于本发明方法的第二测试中，从非糖尿病个体和糖尿病个体得到的血液溶解样品用mM MES缓冲液(pH6.5)1∶1稀释。使样品与硼酸化的固体载体基质以与用于第一测试相同的时间段接触，并保温与第一测试相似的时间段。温育后，弃去稀释的样品，用MES缓冲液(pH＝6.5)淋洗硼酸化的固体载体基质。然后用500mM含50mM Mg++的乙酸铵缓冲液(pH9.5)第二次淋洗固体载体基质。相应于非糖化的血红蛋白，在415nm测量淋洗液的吸收值。从糖尿病患者样品得到的数据提供在表I
表I：糖尿病血液溶解产物样品
该数据的线性回归分析清楚地表明，用单一测量法所得的结果强烈地依赖于温育时间。然而，当使用本发明方法时，所得结果与温育时间无关，相信这可提供更加可靠的结果，使得测试更加坚实可靠并适合于经训练的使用者。
实施例3
pH对结合的影响
缓冲液的pH影响血红蛋白结合到硼酸化的载体的量。如果pH低，则糖化的和非糖化的血红蛋白都被结合，如果pH高，只有糖化的血红蛋白会被结合。图4表明按照在实施例2所述的测试程序血红蛋白结合到羧基纤维素膜上(不存在硼酸基团)。当不存在硼酸时，膜在pH6和7之间失去它的血红蛋白的离子结合能力。
图5表明按实施1所述制备的带有加入的硼酸基团的羧基纤维素载体的血红蛋白和人血清白蛋白结合性质。由于带负电荷的羧基基团，蛋白质的结合在较低的pH发生。由于苯基硼酸而在较高pH结合的蛋白质是样品中的糖化的蛋白质。
实施例4
示例性的条带设计构造的叙述
含带负电荷的基团的硼酸化的固体载体基质可被用于任何需要将糖化的蛋白质与非糖化的蛋白质分离的测试场合。按照本发明优选的测试方法，硼酸化的固体载体基质与其它组件结合使用以定向样品和缓冲液的流动。这些组件可以是条带的形状，可以放入小的手持的反射计用来量化。用于条带的合适的其它构造表示在图6A、6B和6C。
在侧向流动条带构造中(图6A)，液体通过硼酸化的载体的长度运动(与载体的表面平行)。在垂直流动(图6B)和组合的条带构造(图6C)中，液中的运动更多是通过固体载体基质的厚度(垂直于表面)。
所表示的每种构造都有进样位置(1、11或21)，那是在一块塑料中的一个孔(该塑料为了清楚超见通常是白色的)，(4、14或24)。硼酸化的固体载体(2、12或22)与芯给材料(6、16或26)接触。在图6A所示的构造中，液体从进样区(1)流过芯给材料(6)到达载体(2)，再通过载体流至贮槽(3)。在图6B和6C所示的构造中，液体从进样区(11或21)和硼酸化的载体(12或22)流至芯给材料(16或26)和贮槽(13或23)。所有的组件都放在底部的一块塑料的顶部，白色的(15)或透明的(5或25)，取决于构造。硼酸化的载体的反射值是通过将一束选定波长的光照射到载体表面上然后测定其强度(7，17或27)。在图6B和6C表示的构造中，有一块白色的反射材料(18或28)放在载体的后面，将穿过载体的光反射回载体以减少强度的损失。
实施例5
测试比例：糖化的血红蛋白
测实施例4叙述的和图6B所示的垂直流动条带设计用于正常的和糖尿病的血液样品的血液溶解物的混合物的测试。将大约8微升血液溶解物放置在按实施例1制备的硼酸化的固体载体基质上。然后用约50微升MES缓冲液(pH＝6.5，100mM)淋洗进样点，记录在430nm的反射值。然后进样点用约50微升乙酸铵缓冲液(500mM，pH＝9.5，含50mM Mg++)淋洗，在进样点在430nm记录第二反射值。将反射值转换成K/S值，它是与被测量的血红蛋白的浓度成比例的。数据示于下表II(见图7和8)。
表II
数据作用的回归统计示于下表III。
表III
  曲线   泄漏   截距   S<sub>y.x</sub>   CV<sup>*</sup>
  总Hb   0.031   1.48   0.255   14.7
  糖化的Hb   0.026   0.24   0.076   15.9
  糖化/总   0.010   0.18   0.010   3.8
曲线、Sy.x和得到的C.V.’表明，所测总的和糖化的值各个条带都不相同。然而，当取二个值的比值时，大的偏离降低了，证明使用本发明方法的优点。结果显示，计算的糖化的分数值是与样品中的百分糖化的血红蛋白或正比的。
术语CV是偏离系数，是围绕平均值的重复测量的分散性的量度。该系数是从重复测量的标准差(“SD”)和平均值(“M”)计算的(即，CV＝100×SD/M)。使用该值的好处是，因为它是以百分数表示的，它可和其它CV值比较而无需知道平均值。
术语Sy.x是用于线性回归计算中的变化性的量度。它是在除去“X”的影响之后“Y”的变化性的量度(即，它量度数据围绕回归线的变化性)。
实施例6
测试的比例性：糖化的蛋白质
从非糖尿病个体的血清获得一份正常的白蛋白样品。从体外糖化的人血清白蛋白制备高糖化的白蛋白样品(见美国专利5,589,393，授予Michael D.Fiechtner等，1996年12月31日)。
基于Tietz，Textbook of Clinical Chemistry(临床化学教科书)，2ndED.(W.B.Saunders Co.，Carl A.Burtis，Edward Ashwood，编，1994)，986-988页，用手工的果糖胺测试法测试二个样品的果糖胺量。发现高糖化的白蛋白样品所含的果糖胺浓度为正常白蛋白样品的5.5倍。按表IV所示的比例将样品混合在一起(见图9和10)。得到的样品按实施例2所述测试，如上记录A280吸收值。
表IV
  相对果糖胺浓度   测得的总-糖化   测得的糖化   计算的总   糖化/总
  1.0   0.065   0.027   0.092   0.029
  1.0   0.067   0.028   0.095   0.029
  2.1   0.056   0.037   0.093   0.040
  2.1   0.052   0.037   0.089   0.042
  3.3   0.045   0.058   0.103   0.056
  相对果糖胺浓度   测得的总-糖化   测得的糖化   计算的总   糖化/总
  3.3   0.049   0.045   0.094   0.048
  4.4   0.040   0.053   0.093   0.057
  4.4   0.038   0.054   0.092   0.059
  5.5   0.033   0.063   0.096   0.066
  5.5   0.030   0.072   0.102   0.071
以上曲线的回归统计表示在下表V中。
表V
  组分   斜率   截距   R^2
  总   0.001   0.091   0.177
  糖化的   0.009   0.020   0.908
  糖化/总   0.008   0.022   0.962
观察计算的糖化的白蛋白分数是与果糖胺含量成正比的。如R^2的回归统计所示的，从低样品浓度到5.5倍该低浓度，该结果是成比例的。因此，用来测量糖化的血红蛋白的测试方法也适用于糖化的白蛋白的测量。
实施例7
样品体积的影响
按照实施例5所述的方法，用实施例4所述，图6A所示的侧向流动条带模式以不同的样品体积测试非糖尿病和糖尿病全血，以确定样品体积对测试的影响。测得的吸收值(415nm)示于表VI中(见图11和12)。
表VI
吸收值(415)
  微升样品   总Hb   糖化的Hb   糖化/总
  10   1.164   0.183   0.157
  20   1.053   0.167   0.159
  30   1.233   0.164   0.133
  微升样品   总Hb   糖化的Hb   糖化/总
  40   1.206   0.195   0.162
回归统计示于表VII。
表VII
  组分   斜率   截距   S<sub>y.x</sub>   斜率＝0？
  总Hb   0.0031   1.088   0.084   是(P＝0.502)
  糖化的Hb   0.0003   0.169   0.017   是(P＝0.706)
  糖化/总   -0.0001   0.156   0.016   是(P＝0.893)
结果证明在全血测试中，当样品体积的范围为约10微升至40微升时，在测试中总血红蛋白和糖化的血红蛋白的结合与样品的体积无关。
实施例8
总血红蛋白浓度的变化的影响
测试中变化总血红蛋白量的影响用实施例2所述的测程序测试稀释的血液样品来确定。表VIII列出了非糖尿病和糖尿病血液溶解物以2、4、8和16的因子稀释的测试所得的吸收值(415nm)(见图13-15)。
表VIII
曲线的回归统计列于下表区。
表VIII
  样品   斜率   截距   S<sub>y.x</sub>   斜率＝0？
  正常   0.00060   0.067   0.035   是(P＝0.202)
  样品   斜率   截距   S<sub>y.x</sub>   斜率＝0？
  糖尿病   0.00058   0.172   0.049   是(P＝0.329)
结合在固体载体基质上的总血红蛋白和糖化的血红蛋白的量随着总血红蛋白浓度的降低而减少，然而，如在回归统中看到的，计算的糖化的血红蛋白/总血红蛋白在所有测试的稀释中是恒定的(即，斜率实际上为零)。这证明了本发明方法的优点(即，使用二个测定的比来得到与样品稀释度或血红蛋白浓度无关的结果。
实施例9
与其它商业测试的比较
用示于图6C，描述于实施例4，并按照实施例5所述的测试方法，测试了二十五个全血样品。这些样品也用二种商购的用于血红蛋白Alc的试验。
与本发明方法作比较的商购试验是：
1、Roche Integra 400(Roche Diagnostics)
按照制造商的说明书，用台式的多样品分析仪使用血红蛋白的B-链的糖化的N-端缬氨酸或HbAlc的免疫度计测定进行测试。用此方法每个样品测试一次。
2、DCA 2000(Bayer)
按照制造商的说明书，用台式的单测试分析仪使用HbAlc的免疫浊度计测定进行测试。用此测试方法每个样品测试一次。
结果作图在图16A和16B。结果显示，从用来作比较的方法和本发明的方法所得的结果是关联的。

Claims (32)

1.一种量化样品中糖化的蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)使含有带负电荷的基团和羟基硼基化合物并具有一定的测量区域的固体载体基质与足以覆盖所述测量区域的生物样品接触；
(b)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第一缓冲液接触，其中所述第一缓冲液具有经过选择以使糖化的和非糖化的蛋白质都结合在所述的固体载体基质上的pH值；
(c)利用对所述蛋白质被选性质的测量来量化结合到所述测量区域的蛋白质以得到第一结合蛋白质读数；
(d)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第二缓冲液接触，其中所述的第二缓冲液具有经过选择以使糖化的蛋白质结合在所述固体载体基质上，而非糖化的蛋白质基本上不结合在所述固体载体基质上的pH值；
(e)利用对步骤(c)所测性质的测量来量化结合到所述的测量区域的蛋白质以得到第二结合蛋白质读数；
(f)用所述第一和第二结合蛋白质读数计算糖化的蛋白质的百分数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被测性质是光学读数。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光学读数是特定波长下的吸收值或反射值。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖化的蛋白质是糖化的血红蛋白。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖化的蛋白质是糖化的白蛋白。
6.一种量化生物样品中糖化的蛋白质的量的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)使含有带负电荷的基团和羟基硼基化合物并具有一定的测量区域的固体载体基质与足以覆盖所述测量区域的生物样品接触；
(b)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第一缓冲液接触，其中所述第一缓冲液的pH值为5.0-7.0，从而使糖化的和非糖化的蛋白质与带负电荷的基团结合；
(c)通过测定蛋白的性质来量化结合到所述测量区域的蛋白质以得到第一结合蛋白质读数；
(d)使所述固体载体基质与一份足以洗去未结合的蛋白质的第二缓冲液接触，其中所述的第二缓冲液的pH值为8.0-10.0，从而使结合的糖化的和非糖化的蛋白质从带负电荷的基团上释放并使糖化的蛋白质与羟基硼基化合物结合；
(e)通过测定所述结合的糖化的蛋白质的性质来量化结合到所述的测量区域的糖化的蛋白质，以得到第二结合蛋白质读数；
(f)用所述第一结合蛋白质读数和所述第二结合蛋白质读数计算所述样品中糖化的蛋白质的百分数，
其中所述第一结合蛋白质读数和所述第二结合蛋白质读数测量相同的性质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述所测性质是光学读数。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述光学读数是特定波长下的吸收值或反射值。
9.如权利要求6所述的方法，该方法是量化生物样品中糖化的血红蛋白的量的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将所述样品加入与所述固体载体基质相通的进样点，所述固体载体基质含有带负电荷的基团和羟基硼基化合物，其中所述羟基硼基化合物是二羟基硼基化合物；
(b)在所述进样点加入一份所述第一缓冲液；
(c)在血红蛋白吸收光的波长下做出所述测量区域的第一光学读数；
(d)在所述进样点加入一份所述第二缓冲液；
(e)在血红蛋白吸收光的所述波长下做出所述测量区域的第二光学读数；
(f)用所述的第一和第二光学读数计算所述生物样品中的糖化的血红蛋白的百分数。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述二羟基硼基化合物的结构式为
其中R选自苯基、氢和1-6个碳原子的烷基。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，R选自苯基、间氨基苯基、氢、乙基、1-丙基和2-甲基-1-丁基。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，R是间氨基苯基。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述带负电荷的基团选自羧酸基、硫酸基、磺酸基、亚磺酸基和磷酸基。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述带负电荷的基团是羧酸基。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述固体载体基质选自纤维素、硝基纤维素、乙酸纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖聚丙烯酰胺共聚物、琼脂糖、淀粉、尼龙、尼龙聚酯、葡聚糖、葡聚糖丙烯酰胺共聚物、交联的甲基丙烯酸羟乙酯取代的交联的聚苯乙烯，和聚乙烯醇。
16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述固体载体基质是羧基纤维素。
17.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲液选自MES、MOPS和HEPES。
18.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二缓冲液选自乙酸铵或牛磺酸。
19.如权利要求6所述的方法，该方法是量化生物样品中糖化的白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将所述样品加入与所述固体载体基质相通的进样点，所述固体载体基质含有带负电荷的基团和羟基硼基化合物，其中所述羟基硼基化合物是二羟基硼基化合物；
(b)在所述进样点加入一份所述第一缓冲液；
(c)在进样点提供标记试剂，在所述标记试剂吸收光的波长下做出所述测量区域的第一光学读数；
(d)在所述进样点加入一份所述第二缓冲液；
(e)在所述标记试剂吸收光的所述波长下做出所述测量区域的第二光学读数；
(f)用所述的第一和第二光学读数计算所述样品中的糖化的白蛋白的百分数。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述二羟基硼基化合物的结构式为
其中R选自苯基、取代的苯基、氢和1-6个碳原子的烷基。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，R选自苯基、间氨基苯基、氢、乙基、1-丙基和2-丙基-1-丁基。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，R是间氨基苯基。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述带负电荷的基团选自羧酸基、硫酸基、磺酸基、亚磺酸基和磷酸基。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述带负电荷的基团是羧酸基。
25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述固体载体基质选自纤维素、硝基纤维素、乙酸纤维素、聚丙稀酰胺、琼脂糖聚丙稀酰胺共聚物、琼脂糖、淀粉、尼龙、尼龙聚酯、葡聚糖、葡聚糖丙稀酰胺共聚物、交联的甲基丙稀酸羟乙酯取代的交联的聚苯乙烯，和聚乙烯醇。
26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述固体载体基质是羧基纤维素。
27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲液选自MES、MOPS和HEPES。
28.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第二缓冲液选自乙酸铵或牛磺酸。
29.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述样品被蛋白质特异性标记试剂标记。
30.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述样品是血清或血浆。
31.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述固体载体基质是交联的葡聚糖。
32.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述固体载体基质是交联的葡聚糖。
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