CN115825293B

CN115825293B - 一种用于糖化血红蛋白测试的试剂盒

Info

Publication number: CN115825293B
Application number: CN202310140999.9A
Authority: CN
Inventors: 秦艳; 高科翔; 孙玉龙; 张莉
Original assignee: Acon Biotech Hangzhou Co Ltd
Current assignee: Acon Biotech Hangzhou Co Ltd
Priority date: 2023-02-21
Filing date: 2023-02-21
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2043-02-21
Also published as: CN115825293A; WO2024174492A1

Abstract

本发明提供了一种用于糖化血红蛋白测试的试剂盒，包括测试卡、试剂R1和试剂R2，所述测试卡包括过滤膜，所述试剂R1包括缓冲体系、表面活性剂和活性反应物，试剂R1的表面活性剂包括非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂，所述试剂R2包括缓冲体系和表面活性剂。本发明的试剂盒具有较好的热稳定性，可在常温下运输和保存。

Description

一种用于糖化血红蛋白测试的试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及糖化血红蛋白测试的试剂、试剂盒和测试方法。

背景技术

糖尿病已经成为世界第一大慢性疾病，而中国由于人口众多，并处在经济转型的关键时期，糖尿病的发病率也呈现快速增加的趋势。糖尿病的治疗与检测密不可分。随着人们对糖尿病知识的逐步了解，多数人已意识到空腹和餐后2小时血糖监测的重要性，并常常把二者的测定值作为控制血糖的标准。其实不然，空腹和餐后2小时血糖是诊断糖尿病的标准，而衡量糖尿病控制水平的标准是糖化血红蛋白。空腹血糖和餐后血糖是反映某一具体时间的血糖水平，容易受到进食和糖代谢等相关因素的影响。糖化血红蛋白可以稳定可靠地反映检测前2-3个月内的平均血糖水平，且受抽血时间，是否空腹，是否使用胰岛素等因素干扰不大。因此，国际糖尿病联盟推出的亚太糖尿病防治指南，明确规定糖化血红蛋白是国际公认的糖尿病监控“金标准”。

糖化血红蛋白的检测方法主要包括亲和层析法、色谱法、免疫法、化学发光法、酶法、等电点聚集法、电泳法等。亲和层析法具有不受变异体干扰，反应时间快，测试方便等特点。

硼酸亲和层析法的原理是硼酸活性物质对血样中糖化血红蛋白进行定向标记，通过微孔截留技术截留血液中糖化血红蛋白与总血红蛋白，在特定波长下分别进行检测，将信号转化为糖化血红蛋白结果，并显示在测试仪的显示屏上。其具有测试便捷、占用空间小、结果准确等特点。但是该类方法检测糖化血红蛋白的试剂的运输和储存通常需要冷藏条件，且保质期不长，此运输条件过于苛刻，在运输过程中必须保证温度在2-8℃范围内，需要实时监管，从而造成运输过程成本高、监管难等情况；冷链运输需要寻找具有资质的代理商，但是具有冷链运输资质的代理商较少，导致产品的市场推广和销量受限，这在一定程度上大大限制了市场供给。

发明内容

针对现有技术中存在的保存条件苛刻的问题，本发明在配方方面进行优化，经过不断的研究发现不同类型的表面活性剂配合使用，可以大幅改善配方的高温耐受性，极大的降低了运输成本，有利于更好的推广和拓展产品在各个地区的销路，同时提高了用户使用体验的便捷性。因此，本发明提供了一种用于糖化血红蛋白测试的试剂盒，包括测试卡、试剂R1和试剂R2，所述测试卡包括过滤膜，所述试剂R1包括缓冲体系、表面活性剂和活性反应物，试剂R1的表面活性剂包括非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂，所述试剂R2包括缓冲体系和表面活性剂。

在进一步的方案中，试剂R1中的非离子表面活性剂选自TritonX-100，阴离子表面活性剂选自SDS。

在进一步的方案中，试剂R1中TritonX-100的含量为0.01%-0.5%（w/w），SDS的含量为0.01%-0.5%（w/w）。

优选的方案中，试剂R1中TritonX-100的含量为0.05%-0.5%（w/w），SDS的含量为0.01%-0.1%（w/w）。

在一个优选的方案中，所述试剂R1的表面活性剂还包括两性离子表面活性剂。

在进一步的方案中，试剂R1中的两性离子表面活性剂选自Tetronic 1307、CHAPS中的一种或两种。

在进一步的方案中，试剂R1的两性离子表面活性剂的含量为0.01%-0.5%（w/w）。

优选的方案中，试剂R1的两性离子表面活性剂的含量为0.01%-0.1%（w/w）。

在进一步的方案中，活性反应物为硼酸共轭物。

优选的方案中，硼酸共轭物的含量为0.01%-0.06%(w/w)。

本发明的有益效果是：本发明通过不同类型的表面活性剂按照一定比例搭配使用，使得糖化血红蛋白测试卡（硼酸亲和层析法）的热稳定性得到有效改善，同时运输和储存条件得以改善并延长。以往，硼酸亲和层析法的糖化血红蛋白测试卡通常需要采取冷链运输和冷藏储存，经过本发明配方优化和稳定性实验验证，利用表面活性剂之间的协同作用，可以促使配方体系的热稳定性得到整体提升，硼酸亲和层析法的测试卡在此条件下，常温条件下保存效期延长至6个月，冷藏保存效期达到18个月，其性能测试结果与标准仪器偏差都在可接受范围。

附图说明

图1 是实施例5中HbA1c测试值与标准仪器G8的测试值的线性关系。

图2 是实施例5中试剂盒常温储存6个月后HbA1c测试值与标准仪器G8测试值的线性关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。

本发明用于糖化血红蛋白测试的试剂包括试剂R1和试剂R2。本发明用于糖化血红蛋白测试的试剂盒包括糖化血红蛋白测试卡、试剂R1和试剂R2。

糖化血红蛋白测试卡：包括过滤膜和塑料板。过滤膜可以是任意具有适合的孔径大小的膜，例如玻璃纤维、硼硅酸盐膜或纤维素膜，膜的孔径大小0.5-1.5μm，优选的0.8-1.0μm。过滤膜安装在塑料板中，塑料板上设有加样口，待测样本和测试试剂通过加样口到达过滤膜。

试剂R1包含缓冲体系和活性反应物。试剂R2包含缓冲体系和表面活性剂。

在一个优选的方案中，试剂R1的缓冲体系中包含缓冲液、金属离子、表面活性剂、有机溶剂。

缓冲液选自HEPES、乙酸铵中的一种，金属离子包括锌离子、钠离子、镁离子。

试剂R1中的表面活性剂选自非离子表面活性剂如TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚）、阴离子表面活性剂如SDS（十二烷基硫酸钠）、两性离子表面活性剂如Tetronic 1307（乙二胺烷氧基酯嵌段共聚物），CHAPS（3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐）中的一种或几种类型的表面活性剂，优选的是试剂R1包含非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂的双表面活性剂体系，更优选的是试剂R1包含非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂的三表面活性剂体系。更进一步的，双表面活性剂体系为Triton X-100和 SDS；或者三表面活性剂体系为Triton X-100、SDS和Tetronic 1307。其中在双表面活性剂体系中TritonX-100在终溶液中占含量约为0.01%-0.5%（w/w），SDS占含量为0.01%-0.5%（w/w），优选的含量是TritonX-100为0.05%-0.5%（w/w），SDS为0.01%-0.1%（w/w）；在三表面活性剂体系中TritonX-100在终溶液中占含量约为0.01%-0.5%（w/w），SDS占含量为0.01%-0.5%（w/w），Tetronic 1307占含量为0.01%-0.5%（w/w），优选的含量是TritonX-100为0.05%-0.5%（w/w），SDS为0.01%-0.1%（w/w），Tetronic1307为0.01%-0.1%（w/w）。

试剂R1的活性反应物包含浓度为0.01%-0.06%(w/w)的硼酸共轭物。

试剂R1的有机溶剂选自二甲基亚砜。

试剂R2的缓冲体系选自HEPES、乙酸铵中的一种，表面活性剂包括浓度为0.25%(w/w)的非离子表面活性剂。

测试原理：

本发明的糖化血红蛋白测试基于色谱法原理，将样本加入试剂R1后，硼酸共轭物与糖化血红蛋白结合，一定量的试剂R1混合物加入到测试卡的反应孔内，所有血红蛋白及与糖化血红蛋白结合或未结合的硼酸共轭物残留在测试卡的膜上，未结合的硼酸共轭物通过试剂R2移除。使用糖化血红蛋白分析仪，分别检测糖化血红蛋白和总血红蛋白的量，进而计算出糖化血红蛋白的百分比。

具体反应原理如下：

硼酸共轭物+糖化血红蛋白 → 糖化血红蛋白硼酯

测试步骤：

取5微升的全血样本加入到200微升的试剂1中，摇动5-10次，静置3分钟，再摇动5-10次，取25微升的试剂1的混合液加入到测试卡的反应孔内，等待15秒，再取25微升试剂2加入到测试卡的反应孔内，等待1分钟，从糖化血红蛋白分析仪中读出625nm和 470nm处的结果。

实施例1 试剂R1配方中的表面活性剂仅包含非离子表面活性剂

本实施例中，试剂R1使用的是单表面活性剂体系，主要是可用于裂解样本的非离子表面活性剂，如TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚），NP-40（乙基苯基聚乙二醇）。具体的试剂配方如下。

试剂R1 包含0.2M HEPES缓冲液，0.2%（w/w）锌离子，0.1%（w/w）镁离子，1.7%（w/w）钠离子，0.2%（w/w） TritonX-100，20% （w/w）DMSO（二甲基亚砜），0.04%（w/w）硼酸共轭物，并由上述组分混合制备而成，pH值调为8.10。

试剂R2包含0.2M HEPES缓冲液和0.25%（w/w）Triton X-100，并由上述组分混合制备而成，pH值8.50。

糖化血红蛋白测试卡，包括上盖和下壳，玻璃纤维（厂家：Pall，型号：A/B或A/D）安装在上盖和下壳之间，上盖上开设了加样口，试剂和待测样本通过加样口到达过滤膜。

糖化血红蛋白分析仪：艾科糖化血红蛋白分析仪。

测试步骤：

试剂R1、试剂R2和测试卡在2-8℃条件下保存，并在保存的第1个月、第6个月、第12个月和第15个月取出，在15-30℃下复温15分钟，测试全血样本中的糖化血红蛋白含量。以标准仪器Tosoh G8全自动糖化血红蛋白分析仪（下文中简称标准仪器G8或对照G8或G8；厂家：日本东曹株式会社）的测试值作为对照。测试数据见表1。

表1：2-8℃存储稳定性评估

上述数据可以发现，在2-8℃条件下，12个月以内，其测试结果与标准仪器TosohG8的偏差都在可接受范围内，超出12个月后，部分浓度样本的测试结果超出±15%的偏差，表明在2-8℃下保存超过12个月其测试结果超出可接受范围。

试剂R1、试剂R2和测试卡在常温下保存，并在第1个月和第2个月，用以测试全血样本中糖化血红蛋白含量。以标准仪器Tosoh G8全自动糖化血红蛋白分析仪（厂家：日本东曹株式会社）的测试值作为参考对照。测试结果见表2。

表2：常温存储稳定性评估

上述数据可以发现当在常温下保存了1个月，采用不同浓度的糖化样本的测试结果与标准仪器G8的测试值比较，其测试结果与标准仪器G8的偏差都在可接受范围内，而超出一个月后，部分浓度样本的测试结果超出±15%，表明此体系在常温下保存不能超过1个月的时间。

试剂R1、试剂R2和测试卡在37℃条件下保存，通过阿伦尼乌斯定律分析，37℃8天相当于4℃下储存一年；37℃16天相当于4℃下储存两年。以标准仪器Tosoh G8全自动糖化血红蛋白分析仪（厂家：日本东曹株式会社）的测试值作为对照，结果见表3。

表3：加速稳定性评估

上述数据可以发现当在37℃条件下放置了8天时间后，根据阿伦尼乌斯定律，37℃条件下放置了8天相当于在冷藏条件下可保存一年的时间，其性能都在可接受范围内。37℃条件下放置16天，相当于在冷藏条件下可保存2年时间，但是其测试结果与标准仪器之间的偏差超出±15%，表明放置超过一年，部分浓度样本的测试结果偏差较大。

实施例2试剂R1的配方中包含非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂

本实施例中，试剂R1配方中采用双表面活性剂体系，分别是非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂。具体的试剂配方如下。

试剂R1 包含0.2M HEPES缓冲液，0.2%（w/w）锌离子，0.1%（w/w）镁离子，1.7%（w/w）钠离子，0.1%（w/w） TritonX-100，20% （w/w）DMSO（二甲基亚砜），0.04%（w/w）硼酸共轭物，0.05% （w/w）SDS（十二烷基硫酸钠），并由上述组分混合制备而成，pH值8.10。

试剂R2和测试卡同实施例1。

试剂R1、试剂R2和测试卡在37℃条件下保存，通过阿伦尼乌斯定律分析，37℃8天相当于4℃下储存一年；37℃16天相当于4℃下储存两年。以放置在4℃下的试剂盒的测试结果作为参考对照，结果见表4。

表4加速稳定性评估

根据Kubelka-Munk理论，由于不同浓度的糖化血红蛋白的k/s值（K：固体中的吸收系数，S：散射系数）和总血红蛋白的k/s值的比率与糖化血红蛋白浓度值（%）之间存在着一定的相关性，其比率与4℃下的结果之间的偏差可以很好的反映出不同温度不同时间下的测试结果与4℃下保存的测试卡的结果之间的偏差，故本次研究数据采用的是糖化血红蛋白的k/s值与总血红蛋白的k/s值的比率进行比较，结果发现试剂盒放置不同温度不同时间，不同浓度样本与放置在4℃下的测试结果比较偏差不会超出±15%，即表明最终测试结果与对照的偏差在±15%的范围内。

实施例3

本实施例中，试剂R1配方中SDS的含量为0.01%（w/w），试剂R1的其他成分和浓度，以及试剂R2和测试卡均与实施例2相同。

试剂R1、试剂R2和测试卡在37℃条件下保存，通过阿伦尼乌斯定律分析，37℃8天相当于4℃下储存一年；37℃16天相当于4℃下储存两年。以放置在4℃下的试剂盒的测试结果作为参考对照，结果见表5。

表5：加速稳定性评估

本次研究数据采用的是糖化血红蛋白的k/s值与总血红蛋白的k/s值的比率进行比较，结果发现试剂盒放置不同温度不同时间，不同浓度样本与放置在4℃下的比较偏差不会超出±15%。

实施例4试剂R1配方中的表面活性剂仅包含阴离子表面活性剂

本实施例中，试剂R1包含0.2M HEPES缓冲液，0.2%（w/w）锌离子，0.1%（w/w）镁离子，1.7%（w/w）钠离子，0.1% （w/w）SDS（十二烷基硫酸钠），20% （w/w）DMSO（二甲基亚砜），0.04%（w/w）硼酸共轭物，并由上述组分混合制备而成，pH值8.10。试剂R2和测试卡均与实施例1相同。

试剂R1、试剂2和测试卡按照实验步骤进行不同浓度的测试，发现试剂R1中仅含有阴离子表面活性剂SDS时，其测试结果不理想，不同浓度之间没有梯度，基本都在一个水平，说明仅用SDS不适合本系统。结果见表6。

表6：

实施例5试剂R1的配方中包含非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂

本实施例中，试剂R1配方中采用三种表面活性剂，分别是非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。所述两性离子表面活性剂如Tetronic 1307，CHAPS等。

本实施例的具体的试剂配方如下。

试剂R1 包含0.2M HEPES缓冲液，0.2%（w/w）锌离子，0.1%（w/w）镁离子，1.7%（w/w）钠离子，0.1%（w/w） TritonX-100，20% （w/w）DMSO（二甲基亚砜），0.04%（w/w）硼酸共轭物，0.05% （w/w）SDS（十二烷基硫酸钠），0.03%（w/w）Tetronic 1307，并由上述组分混合制备而成，pH值8.10。

试剂R2和测试卡同实施例1。

试剂R1、试剂2和测试卡在2-8℃条件下保存，并在保存的第1个月、第6个月、第12个月和第15个月取出，在15-30℃下复温15分钟，测试全血样本中的糖化血红蛋白含量，以标准仪器Tosoh G8全自动糖化血红蛋白分析仪（厂家：日本东曹株式会社）的测试值作为对照，测试结果见表7和图1。

表7：2-8℃存储稳定性评估

根据表7和图1的数据可以发现试剂盒放置在2-8℃条件下，经过18个月后不同浓度样本与G8比较偏差±10%以内，测试结果较好；且其线性方程y=1.0456x-0.3388的斜率在0.90-1.10之间，R²≥0.99，表明其结果与标准仪器G8的测试值之间有很好的线性相关性以及较高的准确度。

试剂R1、试剂2和测试卡在常温下保存，并在保存的第1个月、第3个月、第6个月时用于测试全血样本中糖化血红蛋白含量。以标准仪器Tosoh G8全自动糖化血红蛋白分析仪（厂家：日本东曹株式会社）的测试值作为对照，测试结果见表8和图2。

表8：常温储存稳定性评估

根据表8和图2的数据可以发现试剂盒放置在常温条件下，经过6个月后不同浓度样本与G8比较偏差在±10%以内，测试结果较好；且其线性方程y=1.0934x-0.0577的斜率在0.90-1.10之间，R2≥0.99，表明其结果与标准仪器G8的测试值之间有很好的线性相关性以及较高的准确度。

试剂R1、试剂2和测试卡在37℃条件下保存16天，以Tosoh G8（厂家：日本东曹株式会社）全自动糖化血红蛋白分析仪的测试值作为对照。根据阿伦斯尼乌定律，37℃16天相当于4℃下两年。测试结果见表9。

表9：加速稳定性评估：

表10：加速稳定性（Ratio k/s）

根据表9的数据可以发现当在37℃条件下放置了8天时间后，根据阿伦尼乌斯定律，8天相当于在冷藏条件下可保存一年的时间，其性能都在可接受范围内；当在37℃条件下放置16天后，不同浓度样本与G8比较偏差在±10%以内，测试结果较好。表10的数据采用的是糖化血红蛋白的k/s值与总血红蛋白的k/s值的比率进行比较，结果发现试剂盒放置不同温度不同时间，不同浓度样本与放置在4℃下的比较偏差不会超出±15%。且结果比两表面活性剂体系的偏差较小。

实施例6

本实施例中，试剂R1配方中Tetronic 1307的含量为0.1%（w/w），试剂R1的其他成分和浓度，以及试剂R2和测试卡均与实施例5相同。

试剂R1、试剂2和测试卡在37℃条件下保存，通过阿伦尼乌斯定律分析，37℃8天相当于4℃下储存一年；37℃16天相当于4℃下储存两年。以放置在4℃下的试剂盒的测试结果作为参考对照，结果见表11。

表11：加速稳定性评估：

实施例7

本实施例中，试剂R1配方中Tetronic 1307的含量为0.01%（w/w），试剂R1的其他成分和浓度，以及试剂R2和测试卡均与实施例5相同。

试剂R1、试剂2和测试卡在37℃条件下保存，通过阿伦尼乌斯定律分析，37℃8天相当于4℃下储存一年；37℃16天相当于4℃下储存两年。以放置在4℃下的试剂盒的测试结果作为参考对照，结果见表12。

表12：加速稳定性评估：

实施例8 试剂R1配方中的表面活性剂仅包含两性离子表面活性剂

当试剂R1配方中仅将Tetronic1307替代TritonX-100时，Tetronic1307的含量为0.1%，R1的其他成分和浓度，以及R2和测试卡同实施例1。由于Tetronic1307是非溶血的两性离子表面活性剂，所以加入到配方体系内，会对测试梯度有一定的影响，使得整个梯度变小甚至没有梯度。

Claims

1.一种用于糖化血红蛋白测试的试剂盒，包括测试卡、试剂R1和试剂R2，所述测试卡包括过滤膜，所述试剂R1包括缓冲液、金属离子、表面活性剂和硼酸共轭物，所述金属离子包括锌离子，所述试剂R2包括缓冲体系和表面活性剂，其特征在于，试剂R1的表面活性剂包括非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂；试剂R1中的非离子表面活性剂选自TritonX-100，阴离子表面活性剂选自SDS。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1中TritonX-100的含量为0.01%-0.5%（w/w），SDS的含量为0.01%-0.5%（w/w）。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1中TritonX-100的含量为0.05%-0.5%（w/w），SDS的含量为0.01%-0.1%（w/w）。

4.根据权利要求1至3之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的表面活性剂还包括两性离子表面活性剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1中的两性离子表面活性剂选自Tetronic 1307、CHAPS中的一种或两种。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1的两性离子表面活性剂的含量为0.01%-0.5%（w/w）。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1的两性离子表面活性剂的含量为0.01%-0.1%（w/w）。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，硼酸共轭物的含量为0.01%-0.06%(w/w)。