JPH09152431A

JPH09152431A - 糖化ヘモグロビンの測定方法

Info

Publication number: JPH09152431A
Application number: JP31245595A
Authority: JP
Inventors: Makoto Takahara; 誠高原
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1995-11-30
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 1997-06-10

Abstract

(57)【要約】【課題】血液中の糖化ヘモグロビンを簡便に、且つ測
定精度、再現性良く測定する方法を提供する。【解決手段】ボロン酸化合物（例、アミノフェニルボ
ロン酸）が固定化され、且つ磁性体（例、Ｆｅ₂Ｏ₃）
を含む微粒子に、血液中の糖化ヘモグロビンを特異的に
結合させた後、該微粒子を磁力により分離することによ
り、糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンとを分離さ
せて測定することを特徴とする糖化ヘモグロビンの測定
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査分野等に
おいて使用される、糖尿病の診断マーカーとして有用な
糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中のグルコースは、赤血球内に存在
するヘモグロビンと非酵素的に結合することが知られて
いる。その反応により、まず、不安定型ＨｂＡ_1cと呼ば
れる前駆物質が生成され、更にアマドリ転移を経て安定
型ＨｂＡ_1cが生成される。この糖化ヘモグロビン（Ｈｂ
Ａ_1c）の量は、ヘモグロビンが血液中に存在していた期
間の血液中のグルコース量に比例しているため、現在、
糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ_1c）値が、糖尿病の診断マー
カーとして、あるいは血糖コントロールの指標として広
く利用されている。

【０００３】従来の糖化ヘモグロビンの測定方法として
は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫
法、比色法、アフィニティクロマトグラフィー法などが
ある。

【０００４】ＨＰＬＣ法は、最も普及しており、充填剤
としてイオン交換樹脂を使用した専用の高速液体クロマ
トグラフによりおこなわれる（例えば、特開昭６３−２
９８０６３号公報、特開平２−３０９２５３号公報な
ど）。この測定法によるＨｂＡ _1c値は総ヘモグロビン量
に対するＨｂＡ_1c量の相対パーセントで示されるため、
測定値が検体中に含まれるヘモグロビン量の影響を受け
ない、測定精度や再現性が良い、という特徴がある。し
かし、単位時間当たりの処理検体数が少ないという問題
点がある。

【０００５】免疫法（例えば、特開平２−８７４３号公
報）は、ＨｂＡ_1cに対する特異的抗体を用いて抗原抗体
反応により測定する方法であるが、単位時間当たりの処
理検体数が多い、という特徴がある。しかし、測定精
度、再現性が比較的悪い、という問題点がある。

【０００６】比色法も、単位時間当たりの処理検体数が
多いが、測定精度、再現性が比較的悪い、という問題点
がある。

【０００７】アフィニティクロマトグラフィー法は、操
作が煩雑であり、自動化が難しく、単位時間当たりの処
理検体数が少ないという問題点がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、以上
の問題点を克服し、血液中の糖化ヘモグロビンを簡便
に、且つ測定精度、再現性良く測定する方法を提供する
ことである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の糖化ヘモグロビ
ンの測定方法は、ボロン酸化合物が固定化された磁性体
含有微粒子に、血液中の糖化ヘモグロビンを特異的に結
合させた後、該微粒子を磁力により分離して、糖化ヘモ
グロビンと非糖化ヘモグロビンとを分離することを特徴
とする。

【００１０】本発明で用いられるボロン酸化合物が固定
化された磁性体含有微粒子は、例えば、以下の方法で調
製される。（１）磁性体含有微粒子（以下、磁性微粒子という）の
作製磁性微粒子は、公知の方法により作製することができ、
例えば、特開昭６２−７５２６７号公報、特開平３−４
６５６５号公報に記載された方法が挙げられる。

【００１１】特開昭６２−７５２６７号公報に記載の方
法を用いると、磁性体と重合性単量体とを含む混合物
を、懸濁重合させることによって、磁性微粒子を作製で
きる。上記磁性体としては、一般に強磁性体と言われる
ものであればいずれも用いることができ、例えば、Ｆｅ
₃Ｏ₄またはＦｅ₂Ｏ₃の酸化鉄、またはこれらと他の
酸化物、例えば、コバルト、マンガン、バリウム、亜
鉛、希土類の酸化物との混合物；鉄、ニッケル、コバル
ト、マンガンなどの金属単体またはこれらの金属同士の
合金；二酸化クロム等が挙げられる。

【００１２】上記重合性単量体としては、アミノ基と化
学的に結合できる反応性官能基を有するものであれば、
特に限定されない。上記反応性官能基としては、例え
ば、カルボキシル基、アミノ基、トシル基、チオール基
等が挙げられる。上記カルボキシル基を有する重合性単
量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、マレイン
酸、フマール酸等が挙げられる。上記アミノ基を有する
重合性単量体としては、例えば、アリルアミン、Ｎ，Ｎ
−ジメチルビニルアミン等が挙げられる。

【００１３】また、この重合に際して、さらに必要に応
じて、重合性架橋剤を混合し、共重合させてもよい。上
記重合性架橋剤としては、例えば、（ポリ）エチレング
リコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレン
グリコールジ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼ
ン、ジビニルトルエン等が挙げられる。

【００１４】また、特開平３−４６５６５号公報に記載
の方法を用いると、磁性体を重合体によりコーティング
することによって、磁性微粒子を作製できる。上記重合
体とは磁性体を被覆することのできる高分子化合物であ
り、アミノ基と化学的に結合できる反応性官能基、例え
ば、カルボキシル基、アミノ基、トシル基、チオール基
等を有するものであれば、重合体材料中に上記官能基を
有するもの、およびポリマー形成後に上記官能基をもつ
スペーサーを導入したものであってもよい。

【００１５】（２）磁性微粒子へのボロン酸化合物の固
定化本発明で用いられるボロン酸化合物は、ボロン酸の３つ
の水酸基のうち、１つもしくは２つが置換され、その置
換基の末端が上記磁性微粒子表面と化学的結合させるた
め、アミノ基であればよい。ボロン酸化合物としては、
例えば、アミノフェニルボロン酸が挙げられる。磁性微
粒子へのボロン酸化合物の固定化は、上記微粒子表面の
反応性官能基とボロン酸化合物のアミノ基とを公知の化
学的結合法によって結合させればよい。

【００１６】次に、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方
法を説明する。（１）まず、サンプルカップに一定量の血液検体を分注
する。サンプルカップとしては、検体の吸光度を測定可
能な透明なものが好ましい。サンプルカップが不透明な
場合には、後述の吸光度測定の際には検体を測定用セル
に移し変えて測定する必要がある。

【００１７】（２）血液検体の溶血化次に、血液検体を溶血させて赤血球内に存在する糖化ヘ
モグロビンおよび非糖化ヘモグロビンを溶出させる。溶
血方法としては、上記（１）の血液検体が分注されてい
るサンプルカップに、溶血試薬を一定量添加すればよ
い。溶血試薬としては、公知の水系の緩衝液が使用可能
であるが、ボロン酸化合物と糖の結合性を高めるため、
溶血試薬のｐＨは７〜９．５が好ましい。溶血試薬とし
ては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液等が挙
げられる。また、溶血能力を上げるため、界面活性剤を
少量添加してもよい。

【００１８】（３）溶血液の吸光度測定次に、上記サンプルカップ中の溶血処理済検体をよく攪
拌した後、４１５ｎｍの吸光度を測定する。この吸光度
測定値をＯＤ１とする。

【００１９】（４）糖化ヘモグロビンとボロン酸化合物
固定化磁性微粒子の反応次に、上記（３）の操作を終えた後、このサンプルカッ
プに、ボロン酸化合物が固定化された磁性微粒子を、検
体中の糖化ヘモグロビン量に対してボロン酸化合物が過
剰量となるように一定量添加し、糖化ヘモグロビンとボ
ロン酸化合物を反応させて糖化ヘモグロビンを磁性微粒
子に結合させる。次いで、サンプルカップ内の液をよく
攪拌し、４１５ｎｍの吸光度を測定する。この吸光度測
定値をＯＤ２とする。

【００２０】（５）Ｂ／Ｆ分離上記（４）の操作を終えた後、このサンプルカップのい
ずれかの側面に磁石を近づけ、サンプルカップに磁力を
かけ、磁性微粒子をカップ内の一部分に集める。次い
で、この部分以外の箇所にて吸光度を測定し、磁性微粒
子と結合していないヘモグロビン（非糖化ヘモグロビ
ン）の４１５ｎｍの吸光度を測定する。この吸光度測定
値をＯＤ３とする。

【００２１】（６）糖化ヘモグロビン値の算定上記のＯＤ１、ＯＤ２およびＯＤ３から、血液検体中の
全ヘモグロビン（糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビ
ンの合計量）に対する糖化ヘモグロビン量の割合であ
る、糖化ヘモグロビン値を以下の式または式によっ
て求める。糖化ヘモグロビン値（％）＝〔（ＯＤ１−ＯＤ３）／ＯＤ１〕×１００・・・糖化ヘモグロビン値（％）＝〔（ＯＤ２−ＯＤ３）／ＯＤ２〕×１００・・・

【００２２】また、測定装置上の制約がある場合、また
は測定精度を高めるなどの必要に応じて、下記の操作を
行い、糖化ヘモグロビン値（％）を求めることもでき
る。（７）上記（４）の操作を終えた（ただし、吸光度測定
値ＯＤ１およびＯＤ２を求める必要はない）後、このサ
ンプルカップのいずれかの側面に磁石を近づけ、サンプ
ルカップに磁力をかけ、磁性微粒子をカップ内の一部分
に集める。この磁力をかけた状態で、このサンプルカッ
プから上清のみを別のサンプルカップに移し、よく攪拌
した後、この上清の４１５ｎｍの吸光度を測定する。こ
の吸光度測定値をＯＤ４とする。

【００２３】（８）次に、上記（７）の操作を終えて、
上清が分離されて残ったサンプルカップに緩衝液を添加
し、サンプルカップから磁石を遠ざけ、磁力がかからな
い状態で、サンプルカップ中に残った磁性微粒子（糖化
ヘモグロビンが結合している）と緩衝液をよく混合した
後、上記（７）と同様にして磁力をかけた状態で上清の
みを取り除き、磁性微粒子と結合していない非糖化ヘモ
グロビンを除く。この操作で使用される緩衝液として
は、ｐＨが７〜９．５の緩衝液であればよく、例えば、
リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン−塩酸緩衝液等が挙げられる。

【００２４】（９−１）次に、上記（８）の操作を終え
た、磁性微粒子（糖化ヘモグロビンが結合している）の
入ったサンプルカップに一定量の緩衝液を添加し、サン
プルカップから磁石を遠ざけ、磁力がかからない状態で
よく混合し、この液の４１５ｎｍの吸光度を測定する。
この吸光度測定値をＯＤ５とする。ここで使用する緩衝
液は、上記（８）の操作で使用される緩衝液と同様のも
のが使用される。

【００２５】また、上記（９−１）の操作の代わりに、
以下の（９−２）で示す操作をしてもよい。（９−２）上記（８）の操作を終えた、磁性微粒子（糖
化ヘモグロビンが結合している）の入ったサンプルカッ
プに一定量のソルビトール含有緩衝液を添加し、サンプ
ルカップから磁石を遠ざけ、磁力がかからない状態でよ
く混合し、ボロン酸化合物に結合していた糖化ヘモグロ
ビンを解離させる。次いで、このサンプルカップに磁力
をかけ、磁性微粒子をカップ内の一部分に集める。次い
で、この部分以外の箇所にて４１５ｎｍの吸光度を測定
し、解離された糖化ヘモグロビンの吸光度を測定する。
この吸光度測定値をＯＤ６とする。ここで使用されるソ
ルビトール含有緩衝液は、ソルビトールを含有するｐＨ
５〜９．５の緩衝液であればよく、例えば、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液またはトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン−塩酸緩衝液等にソルビトールが添加され
たものが挙げられる。サンプルカップへのソルビトール
添加量は、サンプルカップ中の磁性微粒子に固定化され
ているボロン酸化合物量に対し過剰量であればよい。

【００２６】（１０）糖化ヘモグロビン値の算定上記のＯＤ４、ＯＤ５およびＯＤ６から、血液検体中の
全ヘモグロビン（糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビ
ンの合計量）に対する糖化ヘモグロビン量の割合であ
る、糖化ヘモグロビン値を以下の式または式によっ
て求める。糖化ヘモグロビン値（％）＝〔ＯＤ５／（ＯＤ４＋ＯＤ５）〕×１００・・・糖化ヘモグロビン値（％）＝〔ＯＤ６／（ＯＤ４＋ＯＤ６）〕×１００・・・

【００２７】（作用）ボロン酸化合物は、弱アルカリ性
の条件下でボロン酸陰イオンとなり、シスジオール基を
持つ物質と安定な結合体を形成する。糖化ヘモグロビン
の糖の部分にはシスジオール基が存在するので、糖化ヘ
モグロビンはボロン酸化合物に結合する。一方、非糖化
ヘモグロビンは、分子内に糖鎖を持たないのでボロン酸
化合物に結合しない。本発明の糖化ヘモグロビンの測定
方法は、糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンのボロ
ン酸化合物に対するこの反応性の違いを利用して、糖化
ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンとを分離するもので
ある。

【００２８】

【発明の実施の形態】本発明の実施例につき説明する。（実施例）（１）ボロン酸化合物固定化磁性微粒子の調製磁性体として、Ｆｅ₂Ｏ₃「Pherrico5070」( 関東電化
工業社製）１５ｇ、重合性単量体として、メタクリル酸
（和光純薬社製）１００ｇ、重合性架橋剤として、トリ
エチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社
製）５０ｇ、重合開始剤として、過酸化ベンゾイル（ナ
カライテスク社製）１ｇを十分に攪拌混合した後、２重
量％ポリビニルアルコール水溶液１リットル中に添加し
た。これを、ホモジナイザーで６０００ｒｐｍで１０分
間攪拌した後、３リットルのセパラブルフラスコへ移
し、窒素雰囲気下でゆっくりと攪拌しながら、８０℃で
５時間、懸濁重合を行った。

【００２９】次に、重合生成物をイオン交換水でよく洗
浄した後、乾燥、分級を行い、磁性微粒子を得た。この
微粒子の粒子径は３〜８μｍであった。得られた磁性微
粒子１０ｇを、アミノフェニルボロン酸（和光純薬社
製）を６０ｍＭで含有する０．１Ｍフタル酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝４．５）の５０ｍｌ中に分散させ、攪拌しながら６
０℃で１０時間かけて反応を行い、アミノフェニルボロ
ン酸が固定化された磁性微粒子を得た。得られた微粒子
のアミノフェニルボロン酸量を測定（測定法は後述）す
ると、微粒子１ｇあたり０．０５ミリモルであった。こ
の微粒子０．１ｇを牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）
含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）の１０
０ｍｌに分散させ、ボロン酸化合物固定化磁性微粒子懸
濁液を調製した。

【００３０】なお、上述の、微粒子のアミノフェニルボ
ロン酸量の測定は、以下のようにして行った。すなわ
ち、アミノフェニルボロン酸が結合された微粒子１ｇに
３０重量％過酸化水素水１０ｍｌを加え、５時間反応さ
せることにより、ホウ素−炭素間の結合を切断した。次
に微粒子を遠心分離し、その上清を採取した。これを脱
炭酸後、糖を加えることによってホウ酸エステルを形成
させ、強酸化し、水酸化ナトリウムで滴定することによ
りホウ酸を定量した。

【００３１】（２）糖化ヘモグロビン値（％）の測定操
作血液（全血）５μｌと溶血試薬（ｐＨが７．５の１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液）４５μｌとをサンプルカップ
に入れ、溶血希釈した。これに、上記（１）で得られた
ボロン酸化合物固定化磁性微粒子懸濁液３００μｌを添
加し、よく攪拌した後、４１５ｎｍの吸光度を測定し
た。この吸光度測定値をＯＤ２とする。その後、５分間
攪拌を行った後、サンプルカップの底部に磁石を近づ
け、磁力により磁性微粒子を底部に集め、上清の４１５
ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度測定値をＯＤ３と
する。ＯＤ２とＯＤ３を式に代入し、糖化ヘモグロビ
ン値（％）を算出した。

【００３２】上記測定法にて、３種類の血液検体を測定
した。測定は各検体について、繰り返し回数５で行い、
その平均値と変動係数（％）〔（標準偏差／平均値）×
１００〕を求めた。結果を表１に示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】表１より、各検体について変動係数が小さ
く、この方法は測定精度および再現性が良いことが分か
る。

【００３５】

【発明の効果】本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法の
構成は、上記の通りであり、本発明を用いると、血液中
の糖化ヘモグロビンを簡便に、且つ測定精度、再現性良
く測定することができる。本測定方法は簡便なので単位
時間当たりの処理検体数を多くすることができる。ま
た、本測定方法は自動分析機にも適応でき、迅速な測定
が可能になる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ボロン酸化合物が固定化された磁性体含
有微粒子に、血液中の糖化ヘモグロビンを特異的に結合
させた後、該微粒子を磁力により分離して、糖化ヘモグ
ロビンと非糖化ヘモグロビンとを分離することを特徴と
する糖化ヘモグロビンの測定方法。