CN109828112B - 糖化白蛋白抗体复合物制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖化白蛋白抗体复合物及制备方法及应用，糖化白蛋白抗体复合物包括聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球上结合鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体。制备方法为制备聚苯乙烯微球；对制备好的聚苯乙烯微球进行羧基化修饰；利用活化剂对聚苯乙烯微球上的羧基进行活化；在聚苯乙烯微球上偶联鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，形成微球‑鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体复合物。糖化白蛋白抗体复合物用于检测血清中糖化白蛋白含量。聚苯乙烯微球通过与鼠抗人糖化白蛋白抗体先结合，再与糖化白蛋白结合，较现有技术中无差别的吸附白蛋白，特异性明显增强。

Description

糖化白蛋白抗体复合物制备方法及应用

技术领域

本发明涉及大健康免疫体外诊断技术，具体是一种糖化白蛋白抗体复合物及制备方法及应用。

背景技术

糖化白蛋白（GA）是血清白蛋白与葡萄糖发生非酶促反应的产物，通过定量测定血清中的糖化白蛋白，能够反映测定前2-3周血糖的平均水平，在临床上可以评价短期糖代谢控制情况，辅助鉴别应激性高血糖，以及筛查糖尿病等。中国专利申请“血清糖化白蛋白含量测定方法及测定试剂盒201510391944.0”公开了血清糖化白蛋白含量的测定方法，先将待测血清样本加入亲水性聚苯乙烯颗粒缓冲液中，让血清中的白蛋白和糖化白蛋白无差别吸附在亲水性聚苯乙烯颗粒表面，然后再加入鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，形成聚苯乙烯颗粒-糖化白蛋白-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体复合体，然后再加入羊抗鼠糖化白蛋白抗抗体发生凝聚反应，通过测量所得混合体系的吸光度的变化量，测得血清样本中糖化白蛋白的含量占比。

由于现有技术中使用的亲水性聚苯乙烯颗粒是无差别地吸附血清中的白蛋白，在后面形成糖化白蛋白的抗体复合体时会有血清中其他物质的干扰，影响测定的准确性。鉴于此，本发明旨在提供一种更优化的糖化白蛋白抗体复合物及制备方法及应用。

发明内容

本发明提供了一种糖化白蛋白抗体复合物及制备方法及应用，能提高聚苯乙烯颗粒的吸附特异性，排除血清中其它物质的干扰，提高测定的准确性。

一种糖化白蛋白抗体复合物，包括聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球上结合鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体。

所述聚苯乙烯微球为羧基化聚苯乙烯微球。羧基位于聚苯乙烯微球表面。

羧基化聚苯乙烯微球粒径为95-110nm。

羧基化聚苯乙烯微球和鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体通过酰胺键结合。聚苯乙烯微球表面的羧基与鼠抗人糖化白蛋白抗体上的氨基结合形成-CO-NH-。

一种糖化白蛋白抗体复合物制备方法，包括如下步骤：

步骤一、制备聚苯乙烯微球；

步骤二、对制备好的聚苯乙烯微球进行羧基化修饰；

步骤三、利用活化剂对聚苯乙烯微球上的羧基进行活化；

步骤四、在聚苯乙烯微球上偶联鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，形成微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体复合物。

制备聚苯乙烯微球的方法为将去离子水、壳聚糖和聚苯乙烯单体加入容器中，搅拌并将体系的温度升温至沸腾恒定，加入过硫酸铵反应得到聚苯乙烯乳液。

步骤二在乳状液中加入甲基丙烯酸甲酯，对聚苯乙烯微球进行羧基化修饰。

步骤三中采用EDC（碳化亚胺）或NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）对羧基化聚苯乙烯微球进行羧基活化。

步骤四中在经过活化的羧基化聚苯乙烯微球中加入等量的鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，在 37 ℃恒温水浴锅中反应3 h，多次洗涤后获得微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体复合物。

一种糖化白蛋白抗体复合物的应用，用于检测血清中糖化白蛋白含量。

复合物与血清反应后，加入酶标抗体及底物，测定吸光度变化来检测糖化白蛋白含量。

酶标抗体为过氧化物酶标记兔抗人糖化白蛋白抗体。

有益效果：一是聚苯乙烯微球通过与鼠抗人糖化白蛋白抗体先结合，再与糖化白蛋白结合，较现有技术中无差别的吸附白蛋白，特异性明显增强，在测定时采用酶标抗体，与底物显色，进一步排除干扰物对测定结果的影响。二是羧基化的聚苯乙烯微球与鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体的结合更为紧密。三是通过沸腾无皂化两步乳液聚合法可制备了表面含有较大比例羧基的羧基化聚苯乙烯微球。

附图说明

图1是糖化白蛋白抗体复合物制备及应用流程。

具体实施方式

一种糖化白蛋白抗体复合物包括聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球结合鼠抗人糖化白蛋白抗体。

优选的聚苯乙烯微球是羧基化聚苯乙烯微球，羧基位于聚苯乙烯微球表面，羧基化聚苯乙烯微球上的羧基与鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体上的氨基结合形成酰胺键，从而将鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体更紧密地结合到聚苯乙烯纳米微球上，形成能特异性检测糖化白蛋白的复合物。

如图1所示，糖化白蛋白抗体复合物的制备方法具体为：将10ml苯乙烯单体、90ml去离子水、1.25g的壳聚糖加入装有回流冷凝管和机械搅拌器的三口烧瓶中，以150r/min转速搅拌并将体系的温度升温至沸腾恒定，加入0.4g过硫酸铵，沸腾状态下稳定反应30min，冷却得到聚苯乙烯乳液。

在聚苯乙烯乳液中再加入一定量的甲基丙烯酸甲酯与苯乙烯单体混合物（比如1ml的甲基丙烯酸甲酯和10ml的苯乙烯单体），对其进行羧基化修饰。反应完毕后，将微球进行超速离心，弃去清液，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤下层液，重复多次，最后真空干燥得到亲水改性的羧基化聚苯乙烯微球，经红外分析，所得聚苯乙烯微球表面上结合了羧基基团。

取羧基化聚苯乙烯微球在水中分散形成溶液（先称取羧基化的聚苯乙烯微球，溶于水中分散），向其中加入等量的EDC（碳化亚胺）或NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）对其进行羧基活化，室温放置15min，然后迅速加入等量的鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，在 37 ℃恒温水浴锅中反应3 h，用0.1mol/L的磷酸缓冲溶液洗涤三次，除去未结合的抗体。

上述聚苯乙烯微球制备时，壳聚糖是作为一种环境友好的聚合稳定材料，能提高微球粒径的可控性。在制备聚苯乙烯微球的过程，现有技术采用通入氮气排除氧气的制备方法。本发明人采用的方法为使液体沸腾，并在沸腾条件下调整转速为150r/min，既能排除体系中的氧气的干扰，还有助于减小微球的粒径，由于粒径减小，比表面积大，能充分与血清中的糖化白蛋白接触并结合。

通过对微球表面的羧基进行活化，能够产生一种中间产物-酰基异脲衍生物，它能很容易与抗体中的氨基反应生产酰胺键，微球和抗体通过酰胺键特异结合得到微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体复合物。

本发明制备的羧基化聚苯乙烯微球粒径范围在95-110nm且大小均匀，分散性好，表面羧基含量平均在30mg/g，在微球表面上偶联鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体后，能特异性的结合血清中的糖化白蛋白，再与酶标抗体结合，提高了测定的准确性。

糖化白蛋白测定的方式为，在制备的羧基化聚苯乙烯微球表面偶联鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，形成微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体免疫微球，测定糖化白蛋白时，将免疫微球加入到血清中，形成微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体-糖化白蛋白复合物，向复合物中加入酶标抗体（过氧化物酶标记兔抗人糖化白蛋白抗体）和底物（邻苯二胺），酶与底物反应显色，测定吸光度检测糖化白蛋白含量。

通过试验，得出St（苯乙烯单体），去离子水，壳聚糖，过硫酸铵，甲基丙烯酸甲酯，在沸腾的条件下制得了粒径在95-115nm的表面含有30mg/g羧基的羧基化的聚苯乙烯微球，通过活化羧基，使得聚苯乙烯微球与抗体的结合率较高，在特异性吸附血清中糖化白蛋白时，吸附量达到50%，由于是采用的双抗体夹心法测定糖化白蛋白，特异性高，能减少其他物质（白蛋白）的干扰。

实验组

将10ml苯乙烯单体、90ml去离子水、1.25g的壳聚糖加入装有回流冷凝管和机械搅拌器的三口烧瓶中，以150r/min转速搅拌并将体系的温度升温至沸腾恒定，加入0.4g过硫酸铵，沸腾状态下稳定反应30min，冷却得到聚苯乙烯乳液。

在聚苯乙烯乳液中再加入一定量的甲基丙烯酸甲酯与苯乙烯单体混合物（比如1ml的甲基丙烯酸甲酯和10ml的苯乙烯单体），对其进行羧基化修饰。反应完毕后，将微球进行超速离心，弃去清液，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤下层液，重复多次，最后真空干燥得到亲水改性的羧基化聚苯乙烯微球，

在制备的羧基化聚苯乙烯微球表面偶联鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，形成微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体免疫微球，测定糖化白蛋白时，将免疫微球加入到血清中，形成微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体-糖化白蛋白复合物，向复合物中加入酶标抗体（过氧化物酶标记兔抗人糖化白蛋白抗体）和底物（邻苯二胺），酶与底物反应显色，测定吸光度检测糖化白蛋白含量，采用标准曲线R2=0.9985测定血清中糖化白蛋白的含量。

血清中糖化白蛋白的含量测定方法为：

对无肝、胆、胰、肾、肺、糖尿病和心脑血管疾病，肝肾功能正常的健康成人进行空腹采血，置生化管内分离血清，剔除溶血和脂浊血清，得到200份血清，在200份血清中分别加入前述制备好的微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体免疫微球吸附1.5h，采用全自动生化分析仪检测糖化白蛋白吸附量达到50%。

采用标准曲线R2=0.9985测定血清中糖化白蛋白的含量，其中有189份血清样本的糖化白蛋白的含量在100～285μmol/L范围内，与健康成年人血清中的糖化白蛋白含量参考区间范围吻合，则95%以上的吻合率。本申请的微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体免疫微球有效率较高。

精密度的测定：其变异系数CV≤7.00%。

取上述200份血清样本中的50份不同浓度的血清样本进行准确度检测，相关系数r2=0.9973,相对偏差在±10.00%。分析灵敏度：吸光度差值Δ≥0.1。

对照组

按照前述方式制备羧基化聚苯乙烯微球。

取一定量的羧基化微球加入到血清中，然后加入与血清等量鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，反应一段时间，再加入等量的酶标记的兔抗鼠糖化白蛋白单克隆抗体和底物发生显色反应，糖化白蛋白的吸附量为34%。通过吸光度来检测糖化白蛋白含量。精确度、准确度以及分析的灵敏度的测定同对照组。精确度测定的变异系数CV≤11.00%，准确度测定的相关系数r2=0.9933，相对偏差为±16.00%，分析灵敏度吸光度的差值Δ≥0.15。

本申请在测定糖化白蛋白含量时，较微球直接与血清中糖化白蛋白结合，特异性更强，血清中其他物质干扰程度更小，通过本专利设计的糖化白蛋白测定试剂盒，

聚苯乙烯微球是通过单体苯乙烯聚合而成，具有强疏水性，现有技术采用聚苯乙烯微球吸附血清中的白蛋白后，再加入抗体的方式进行糖化白蛋白含量的检测，影响测定结果的准确性。聚苯乙烯微球连接抗体，抗体的Fc端较Fab端疏水性强，所以抗体的Fc端与微球结合，抗体浓度较低也会影响结合的紧密度。而本申请优选的技术方案通过水溶性壳聚糖作为分散稳定剂，甲基丙烯酸甲酯提高微球的羧基化，降低疏水性，使微球与蛋白结合更紧密。通过对微球表面的羧基活化，会产生一种中间产物——酰基异脲衍生物，这种中间产物非常活泼，很容易和抗体中的氨基反应生产酰胺键，使得结合更加紧密，微球和捕获抗体通过酰胺键特异结合后能捕获抗原，提高微球的特异性，同时测定的准确性也会提高。

本申请的较现有技术的优势在于1、制得的聚苯乙烯微球粒径在95-115nm，与血清中的糖化白蛋白反应时，能更充分的与糖化白蛋白接触，提高微球与糖化白蛋白结合率。2、通过对微球进行有效的羧基化修饰，使得微球表面具有羧基，羧基与抗体之间形成酰基异脲衍生物，抗体与微球之间的结合更加紧密，从而更好地结合血清中的糖化白蛋白。3、微球先与抗体结合，制得免疫微球，然后结合血清糖化白蛋白，再用酶标抗体对糖化白蛋白再一次进行特异性选择，通过两次的特异性选择，测定血清中糖化白蛋白就能将误差降到较低的水平，测定的准确度与精密度也会相应的提高。

Claims (4)

1.一种糖化白蛋白抗体复合物的制备方法，糖化白蛋白抗体复合物包括聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球上结合鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，聚苯乙烯微球为羧基化聚苯乙烯微球，羧基化聚苯乙烯微球粒径为95-110nm，表面羧基含量平均在30mg/g，羧基化聚苯乙烯微球和鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体通过酰胺键结合，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、制备聚苯乙烯微球：将去离子水、壳聚糖和苯乙烯单体加入容器中，以150r/min转速搅拌并将体系的温度升温至沸腾恒定，加入过硫酸胺，沸腾状态下稳定反应30min获得聚苯乙烯微球乳液；

步骤二、对制备好的聚苯乙烯微球进行羧基化修饰；

步骤三、利用活化剂对聚苯乙烯微球上的羧基进行活化；

步骤四、在聚苯乙烯微球上偶联鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，形成微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体复合物。

2.根据权利要求1所述的糖化白蛋白抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤二采用在聚苯乙烯微球乳液中加入甲基丙烯酸甲酯，对聚苯乙烯微球其进行羧基化修饰。

3.根据权利要求1所述的糖化白蛋白抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤三中采用EDC或NHS对羧基化聚苯乙烯微球进行羧基活化。

4.根据权利要求1所述的糖化白蛋白抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤四为在经过活化的羧基化聚苯乙烯微球中加入等量的鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体，在 37℃恒温水浴锅中反应3h，多次洗涤后获得微球-鼠抗人糖化白蛋白单克隆抗体复合物。

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