CN115583993B - 一种偶联单克隆抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用高分子材料技术领域，公开了一种偶联单克隆抗体的方法，包括以下步骤：在聚苯乙烯微球上接枝氯甲基，再与二乙醇胺反应在微球表面修饰上羟基，然后与环氧氯丙烷反应得到环氧改性的聚苯乙烯微球，微球表面的环氧基与抗体的功能基团反应，将抗体偶联到聚苯乙烯微球表面。本发明采用二乙醇胺使得聚苯乙烯微球表面的功能化基团增多，接枝率显著增加，而且在微球表面引入了更多的N、O原子，提高了单克隆抗体迁移到材料表面的速率，有效缩短了反应时间。
Description
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料技术领域，特别涉及一种偶联单克隆抗体的方法。
背景技术
抗体偶联也属于蛋白偶联，目前的偶联方法主要是在高分子材料表面修饰胺基、环氧基、羟基等功能基团，然后和蛋白质结构中的功能基团反应，从而偶联到材料表面，形成蛋白质高分子复合材料。
目前偶联方法存在的缺点有：①蛋白质配基偶联量偏低，这主要是由于材料表面功能基团接枝率偏低，比如聚苯乙烯微球氯甲基化率仅有12％，功能基团数量低直接导致可以偶联的抗体总量较少；②单克隆抗体复合材料的抗体偶联工艺反应时间太长，工艺有待简化。抗体吸附过程有两个关键步骤，第一步是目标抗体在扩散、对流的作用下运动到材料表面，第二步，抗体和材料表面的功能基团反应，化学偶联到材料表面；第一步是整个偶联过程的决速步骤，故提高抗体迁移到材料表面的速率有利于缩短偶联反应时间从而简化工艺。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种偶联单克隆抗体的方法，该方法制备的聚苯乙烯微球表面的功能化基团增多，不仅可以偶联更多的抗体，而且提高了材料表面的极性，有利于提高抗体迁移到表面的速率，缩短反应时间。
本发明的技术方案具体如下：
一种偶联单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
S1、将聚苯乙烯微球溶胀后，加入氯甲醚和催化剂，在40～80℃充分反应2～12小时后，过滤，洗涤干燥，得到氯甲基改性聚苯乙烯微球；
S2、将氯甲基改性聚苯乙烯微球置于溶胀溶剂中溶胀后，添加氯甲基1～2倍当量的二乙醇胺，再加入碱性溶液A1，在60～75℃充分反应7～8小时后，过滤，洗涤干燥，得到羟基改性聚苯乙烯微球；
S3、将羟基改性聚苯乙烯微球置于溶胀溶剂中溶胀后，添加羟基1～2倍当量的环氧氯丙烷，再加入碱性试剂A2，在40～80℃充分反应2～12小时后，过滤，洗涤干燥，得到环氧改性微球；
S4、将环氧改性微球置于蒸馏水中溶胀，添加环氧1～2倍当量的单抗水溶液，在20～40℃充分反应2～12小时后，过滤，洗涤干燥，得到单抗聚苯乙烯复合微球。
进一步地，在上述技术方案中，所述溶胀溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷以及四氢呋喃中的一种或多种；更进一步地，所述微球与溶胀溶剂的体积比为1∶1～100。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中催化剂为氯化锌，具体的，氧化锌与聚苯乙烯微球的质量体积比为0.05～0.5g∶1mL。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中碱性溶液A1为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中碱性试剂A2为1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯(DBN)；更进一步地，DBN的加入量为0.1～1.0％(体积比)。
本发明的有益效果为：
1)通过氯甲基和二乙醇胺亲核取代反应，合成羟基化修饰的聚苯乙烯微球，由于一个二乙醇胺分子含有两个羟基，反应后聚苯乙烯微球表面的功能化基团更多，从而可以偶联更多的单克隆抗体。
2)由于二乙醇胺的引入，使材料表面连接臂带有更多的N、O原子，提高了材料表面极性，且氢键的形成有利于提高单克隆抗体迁移到材料表面的速率，经过12小时常温(25～50℃)反应，抗体偶联率接近99％，反应时间缩短一半，从而简化抗体复合材料合成工艺。
3)使用碱性溶液A1，有效提高二乙醇胺的取代效率；并采用1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯(DBN)作为环氧活化改性过程的催化剂，提高取代反应的选择性，提高了活化率。
附图说明
图1为本发明中聚苯乙烯微球偶联单克隆抗体的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
(1)称取1mL粒径300～400μm聚苯乙烯微球于20mL的二氯甲烷中溶胀5小时后，添加5mL氯甲醚和0.2g氯化锌作为催化剂，在60℃充分反应12小时后，用200目滤网过滤，采用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得氯甲基改性聚苯乙烯微球。
(2)称取1ml氯甲基改性聚苯乙烯微球于20mL二氯甲烷中溶胀5小时后，添加氯甲基1.2倍当量(摩尔量)的二乙醇胺和2mL质量分数40％氢氧化钠，在60℃充分反应12小时后，用200目滤网过滤，采用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得羟基改性聚苯乙烯微球。
(3)称取1ml羟基改性聚苯乙烯微球于20mL二氯甲烷中溶胀4小时后，添加羟基1.2倍当量的环氧氯丙烷和0.1mL 1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯，在60℃充分反应8小时后，用200目滤网过滤，采用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得环氧改性聚苯乙烯微球。
(4)称取1ml环氧改性聚苯乙烯微球于100mL蒸馏水中溶胀6小时后，添加环氧基1.0倍当量的白介素6单克隆抗体水溶液，在30℃充分反应12小时后，得白介素6单克隆抗体聚苯乙烯复合微球。
实施例2
(1)称取1mL粒径300～400μm聚苯乙烯微球于50mL二氯甲烷中溶胀5小时后，添加15mL氯甲醚和0.5g氯化锌作为催化剂，在60℃充分反应5小时后，用200目滤网过滤，采用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得氯甲基改性聚苯乙烯微球。
(2)称取1ml氯甲基改性聚苯乙烯微球于50mL二氯甲烷中溶胀5小时后，添加氯甲基1.2倍当量的二乙醇胺和5mL氢氧化钠水溶液，在60℃充分反应8小时后，用200目滤网过滤，采用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得羟基改性聚苯乙烯微球。
(3)称取1ml羟基改性聚苯乙烯微球于50mL二氯甲烷中溶胀4小时后，添加羟基1.2倍当量的环氧氯丙烷和0.3mL 1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯，在60℃充分反应8小时后，用200目滤网过滤，采用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得环氧改性聚苯乙烯微球。
(4)称取1ml羟基改性聚苯乙烯微球于100mL蒸馏水中溶胀6小时后，添加环氧基1.0倍当量的TNF-α单克隆抗体水溶液，在40℃充分反应12小时后，得TNF-α单克隆抗体聚苯乙烯复合微球。
取实施例1制备的10mL单克隆抗体聚苯乙烯复合微球装入灌流器封装，用于体外血浆吸附实验，收集4L病人废弃血浆装入容器中，在血液灌流机作用下，血浆从容器中引流出来，流经灌流器，与灌流器中的白介素6单克隆抗体聚苯乙烯复合微球免疫吸附剂相互作用，从而被固定到微球表面，从血浆中被清除。经过2小时流转后，IL-6浓度从起始浓度306ng/L降低到5.2ng/L，目标抗原IL-6清除率为98.3％。相比目前市售产品对细胞因子20％以下的清除率，可见产品对目标抗原吸附效率大幅提高。
按照同样方法检测实施例2制备的TNF-α单克隆抗体聚苯乙烯复合微球，其对目标抗原吸附效率相对于市售产品也有提高。
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、等效变换、改进等，均应包含在本发明所要求保护的范围之内。
Claims (3)
1.一种偶联单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将聚苯乙烯微球置于溶胀溶剂中溶胀后，加入氯甲醚和催化剂，在40～80℃充分反应2～12h后，过滤，洗涤干燥，得到氯甲基改性聚苯乙烯微球；
S2、将氯甲基改性聚苯乙烯微球置于溶胀溶剂中溶胀后，添加氯甲基1～2倍当量的二乙醇胺，再加入碱性溶液A1，于60～75℃反应5～8h，过滤，洗涤干燥，得到羟基改性聚苯乙烯微球；
S3、将羟基改性聚苯乙烯微球置于溶胀溶剂中溶胀后，添加羟基1～2倍当量的环氧氯丙烷，再加入碱性试剂A2，于40～80℃反应2～12h，过滤，洗涤干燥，得到环氧改性微球；
S4、将环氧改性微球于蒸馏水中溶胀，添加环氧1～2倍当量的单抗水溶液，在20～40℃充分反应2～12小时后，过滤，洗涤干燥，得到单抗聚苯乙烯复合微球；
步骤S2所述碱性溶液A1为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液；
步骤S3所述碱性试剂A2为1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯。
2.根据权利要求1所述偶联单克隆抗体的方法，其特征在于，所述溶胀溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷以及四氢呋喃中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述偶联单克隆抗体的方法，其特征在于，所述催化剂为氯化锌，所述氯化锌与聚苯乙烯微球的质量体积比为0.05～0.5g∶1mL。
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Non-Patent Citations (1)
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| Design and construction of novel molecular conjugates for signal amplification (II): use of multivalent polystyrene microparticles and lysine peptide chains to generate immunoglobulin–horseradish peroxidase conjugates;Subhash Dhawan;Peptides;第23卷(第12期);第2099-2110页 * |
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