CN102621296A - 一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法，包括：1)微球的活化：采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧化聚苯乙烯微球，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基；2)蛋白质的偶联；3)切向流过滤分离残留的抗体；4)以及微球的封闭四个步骤。本方法采用具有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球，应用化学法将蛋白质(抗体或抗原)偶联于微球表面，从而使其活性位点尽量暴露，提高了抗体的利用率，从而降低了生产成本。将偶联了抗体的胶乳微球与残余的抗体分离时采用了切向流过滤技术，克服了离心分离工艺中抗体易脱落和失活的缺点。同时本发明具有一定的通用性，更有利于工业生产的规模化和放大化。

Description

一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法

技术领域

本发明属于医学免疫学领域，涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法检测试剂的制备方法，特别是涉及一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球与蛋白质的共价偶联的方法。

背景技术

胶乳增强免疫比浊法由于具有检测方法简单方便，线性范围宽，稳定性好，同时可在全自动生化仪上实现大量样品检测等优点，已经越来越多的被应用于临床检测项目。胶乳增强免疫比浊法是通过采用物理吸附或共价键合的方式将抗体或抗原偶联到纳米微球的表面，形成微球-抗体(抗原)复合物。此复合物与样品中的抗原(抗体)，通过抗体抗原反应，形成微球-抗体-抗原聚集颗粒，随着免疫反应的不断发生，聚集的颗粒不断增大，从而导致溶液在一定波长(如600nm)的吸光值发生显著的变化，通过测定免疫反应前后吸光度值的变化可以计算出样品中抗原(抗体)的浓度，从而达到检测和诊断疾病的目的。迄今，胶乳增强免疫比浊分析方法在临床中已经应用于检测脂蛋白a、抗链球菌溶血素“O”、类风湿因子、C-反应蛋白、β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、D-二聚体、胱抑素C、肌钙蛋白、肌红蛋白、CK-MB、甲胎蛋白、糖化血红蛋白和前列腺特异性抗原等多种检测项目，诊断领域已涉及肿瘤、风湿、肝功能、肾功能等多个领域，拥有广阔的应用前景。

胶乳增强免疫比浊法一般采用双试剂，即反应试剂(R1)和反应试剂(R2)，其中，R1为带有一定浓度促凝剂的缓冲溶液，R2为固定化抗体(或抗原)的胶乳微球溶液。R2是胶乳增强免疫比浊法的核心部分，对胶乳增强免疫比浊试剂的检测灵敏度、线性范围以及稳定性起决定作用。而在胶乳试剂R2的制备过程中，选择的胶乳微球以及在微球上固定化抗体(或抗原)的工艺决定了制备的胶乳试剂R2的性能。抗体(或抗原)在本质上都是蛋白质，将蛋白质偶联到胶乳微球上主要有两种方式，即物理吸附与化学偶联。物理吸附的蛋白质在长期储存过程中易从胶乳微球表面脱落，进而使检测灵敏度下降；化学偶联的蛋白质可被稳定固定在胶乳颗粒表面，目前的常规偶联方法是碳二亚胺法，但是此方法在偶联过程中易使胶乳微球聚集，不利于后续胶乳微球的处理。此外，在抗体与微球偶联后，需将残余抗体与偶联了抗体的胶乳微球分离，离心是现有报道的工艺中最常用的分离方法(专利，申请号：201010192601.9)。但是离心分离残余抗体的方法容易导致偶联抗体的胶乳微球的聚集，需要采用超声等分散方法将偶联抗体的胶乳微球重新悬浮分散。而在分散过程中容易导致抗体失活和从胶乳微球上的脱落，并且离心的方法不利于胶乳比浊试剂的放大生产。此外，由于抗体的活性端为Fab片段，在偶联过程中也可与胶乳微球发生反应，从而无法用于与抗原发生免疫反应，因此使抗体的活性端尽量暴露，提高抗体的利用率，将对降低生产成本具有重要意义。但是目前常用的胶乳微球和偶联工艺均不能有效的解决以上问题。

针对上述问题，本专利提供了一种化学偶联蛋白质与胶乳微球的新方法，有效的解决了上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羧化聚苯乙烯微球上化学偶联抗体的方法。本方法采用具有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球，应用化学法将蛋白质(抗体或抗原)偶联于微球表面，制备得到胶乳增强免疫检测试剂。由于采用了具有间隔臂的胶乳微球，微球上的间隔臂对蛋白质起到了一定的支撑作用，从而使其活性位点尽量暴露，提高了抗体的利用率。同时该工艺改进了制备方法，在将偶联了抗体的胶乳微球与残余的抗体分离时采用了切向流过滤技术，克服了离心分离工艺中的胶乳微球聚集以及后续的胶乳微球的超声再分散的问题，从而避免了抗体的脱落和失活。同时更有利于放大生产。采用该工艺制备的检测试剂具有很好的灵敏度和长期稳定性。

本发明是通过下述技术方案加以实现的：

本发明的羧化聚苯乙烯微球偶联蛋白质的方法，包括：微球的活化，蛋白质的偶联，切向流过滤分离残留的抗体与胶乳微球，以及微球的封闭四个步骤。

1)微球的活化；采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧化聚苯乙烯微球，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基；

2)蛋白质的偶联；

3)切向流过滤分离残留的抗体与胶乳微球；

4)以及微球的封闭四个步骤。

所述的步骤1)采用如下方法：

取0.5-2.5ml浓度为1％-5％质量分数的具有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球，加去离子水或蒸馏水稀释到0.5-2倍后，分别加入20-180μl 1mg/ml的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应10-40min。

所述步骤2)采用如下方法：

向第一步活化后的微球溶液中加入4mg-20mg的蛋白质溶液，37℃反应1-5小时。

所述步骤3)的方法：

采用截留分子量为300KD或500KD的膜包，20-100mM三羟甲基氨基甲烷或甘氨酸缓冲液作为洗液，切向流过滤除去未与微球偶联的蛋白质。

所述的三羟甲基氨基甲烷或甘氨酸缓冲液作为洗液缓冲液的pH优选为6.5-8.0。

所述步骤4)的方法，采用如下方法：

收集切向流过滤后的微球溶液，羧化聚苯乙烯微球经上述反应最终通过切向流过滤可收集10-20ml，向此收集液中加入15-30mg的牛血清白蛋白对微球表面没有偶联蛋白质的残留位点进行封闭。

具体技术路线如下：

第一步，微球的活化。采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧化聚苯乙烯微球，使其能够与蛋白质发生偶联反应(其反应方程式参见图1)，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基，增加了微球间的静电排斥，进而避免聚集，保证微球的整体稳定性。具体活化方法如下：取0.5-2.5ml浓度为1％-5％(质量分数)的羧化聚苯乙烯微球，加一定体积的去离子水或蒸馏水稀释0.5-2倍后，分别加入20-180μl 1mg/ml的Sulfo-NHS和EDC，室温反应10-40min。

第二步，蛋白质的偶联，活化后的微球易与蛋白质的N末端反应。具体偶联方法如下：向第一步活化后的微球溶液中加入4mg-20mg的蛋白质溶液，37℃反应1-5小时。其偶联过程反应参见图1。其中R-NH₂表示与微球偶联的蛋白质，其N端与活化后的微球反应，进而将蛋白质固定于微球上(R代表除N端外，蛋白质的其它部分)。

第三步，切向流过滤，采用截留分子量为300KD或500KD的膜包，20-100mM三羟甲基氨基甲烷(tris)或甘氨酸缓冲液(pH 6.5-8.0)为洗液，切向流过滤除去未与微球偶联的蛋白质。

第四步：微球的封闭，小心收集切向流过滤后的微球溶液，羧化聚苯乙烯微球经上述反应最终通过切向流过滤可收集10-20ml，向此收集液中加入15-30mg的牛血清白蛋白(BSA)对微球表面没有偶联蛋白质的残留位点进行封闭。

本发明提供的制备工艺与现有的技术相比，其明显的优势在于：采用具有间隔臂的胶乳微球，间隔臂的引入对偶联的蛋白质起到一定的支撑作用，可以大大的提供抗体(或抗原)的利用率，从而降低生产的成本(抗体或抗原的价格较高)；采用切向流过滤技术去除反应后残余的抗体(或抗原)，使反应液(R2)的制备始终处于溶液状态，与传统的高速离心分离方法相比，此分离方法温和，且不需超声重新分散，简化了制备工艺，同时避免了抗体(或抗原)的脱落和失活，很好的克服了传统分离方法的缺点；本工艺简化了制备过程，因此工艺相对简单，所需仪器设备价格便宜，更有利于放大生产；本制备工艺具有一定的通用性，可以适用于多种不同的蛋白质偶联于微球的反应，更有利于规模化生产。

附图说明

图1：蛋白质与羧化聚苯乙烯微球化学偶联反应方程式；

图2：胶乳增强免疫比浊发测定B2M的标准曲线对比图。

具体实施方式

实施例1：偶联β2微球蛋白(B2M)抗体

取0.5ml(0.5-2.5ml)，5％(1％-5％)，124nm的带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球加1ml(0.5-2倍)去离子水稀释，分别加入20μl(20-180μl)1mg/ml的sulfo-NHS和EDC.HCl，室温反应10min。反应完后，加入320μl 37.5mg/ml(共12mg，4-20mg)的B2M抗体(伊普西隆生物科技有限公司(浙江、瑞安))，37度反应1小时。用截留分子量500kD的膜包进行切向流过滤，分离残留抗体与胶乳微球，洗液为20mM Tris，pH＝6.5，无抗体滤出后，收集10ml(10-20)胶乳微球溶液，加入30mg(15-30mg)BSA 37摄氏度封闭3小时，制得固定有B2M抗体的胶乳微球。制备的微球用0.2M，pH7.4Tris-HCl缓冲液配制成0.1％的溶液作为R2，选用含1％PEG8000，0.3M NaCl的0.2M，pH7.4Tris-HCl缓冲液作为R1，对B2M进行检测，结果参见图2。由图可知，样品中B2M为0-20mg/L的范围该检测试剂具有较好的线性，说明即便是B2M为20mg/L时，微球上的抗体量仍可保证过量，进而保持良好的线性。为进一步说明带有间隔臂微球的优势，采用同样的偶联抗体条件，在没有间隔臂的微球上进行偶联抗体，制备B2M胶乳微球检测试剂，采用该胶乳微球进行B2M检测，将其检测结果与采用本专利的方法制备的胶乳增强免疫检测试剂(即采用带有间隔臂的胶乳微球)的检测结果进行对比，其对比结果见图2。由图可知B2M在0-10mg/L的范围内具有较好的检测线性，当B2M为20mg/L时，检测值明显下降，说明微球表面的有效抗体的量不足与抗原B2M反应。对比图2中带有间隔臂的微球与没有间隔臂的微球制备的B2M检测试剂的检测线性范围对比说明带有间隔臂的微球可以有效提高抗体的活性，进而提高固定化效率，具有显著的优越性。

实施例2：偶联C-反应蛋白(CRP)抗体

取1.5ml(0.5-2.5ml)，1％(1％-5％)，124nm的带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球加0.75ml(0.5-2倍)去离子水稀释，分别加入100μl 1mg/ml(20-180μl)的sulfo-NHS和EDC.HCl，室温反应30min。反应完后，加入150μl 37.5mg/ml(共4mg，4-20mg)的CRP抗体(伊普西隆生物科技有限公司(浙江、瑞安))，37度反应3小时。用截留分子量300kD的膜包进行切向流过滤，分离残留抗体与胶乳微球，洗液为50mM Tris，pH＝7.2，无抗体滤出后，收集15ml(10-20ml)胶乳微球溶液，加入15mg(15-30mg)BSA 37摄氏度封闭24小时，制得固定有CRP抗体的胶乳微球。

实施例3：偶联人血清白蛋白(HSA)

取2.5ml(0.5-2.5ml)，2.5％(1％-5％)，124nm的带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球加1ml去离子水稀释，分别加入180μl(20-180μl)1mg/ml的sulfo-NHS和EDC.HCl，室温反应5小时。反应完后，加入800μl 25mg/m(20mg，4-20mg)l的HSA(伊普西隆生物科技有限公司(浙江、瑞安))，37度反应5小时。用截留分子量300kD的膜包进行切向流过滤，分离残留抗体与胶乳微球，洗液为100mM Tris，pH＝8.0，无蛋白质滤出后，收集20ml(10-20ml)胶乳微球溶液，加入20mg(15-30mg)BSA 37摄氏度封闭10小时，制得固定有HSA的胶乳微球。

Claims (6)

1.一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法，其特征是步骤如下：

1)微球的活化；采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧化聚苯乙烯微球，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基；

2)蛋白质的偶联；

3)切向流过滤分离残留的抗体与胶乳微球；

4)以及微球的封闭四个步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤1)采用如下方法：

取0.5-2.5ml浓度为1％-5％质量分数的羧化聚苯乙烯微球，加去离子水或蒸馏水稀释到0.5-2倍后，分别加入20-180μl 1mg/ml的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应10-40min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤2)采用如下方法：

向第一步活化后的微球溶液中加入4mg-20mg的蛋白质溶液，37℃反应1-5小时。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤3)采用如下方法：

采用截留分子量为300KD或500KD的膜包，20-100mM三羟甲基氨基甲烷或甘氨酸缓冲液为洗液，切向流过滤除去未与微球偶联的蛋白质。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是所述的缓冲液的pH为6.5-8.0。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤4)采用如下方法：

收集切向流过滤后的微球溶液，羧化聚苯乙烯微球经上述反应最终通过切向流过滤可收集10-20ml，向此收集液中加入15-30mg的牛血清白蛋白对微球表面没有偶联蛋白质的残留位点进行封闭。

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