CN102266554A - 禽流感灭活疫苗的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽流感灭活疫苗的制备方法及其产品，其制备方法包括：制备禽流感病毒液；禽流感病毒液中加入甲醛，灭活病毒液；向灭活病毒液中加入佐剂，乳化，即得；其中，在向灭活病毒液中加入佐剂之前将病毒液进行下述处理：将灭活后的病毒液浓缩，将浓缩后的病毒液稀释。本发明针对禽流感灭活疫苗生产现状，优化并改进了禽流感疫苗生产工艺流程，从甲醛浓度与免疫效价关系方面做了大量的试验，在禽流感规模化生产规程的基础上，利用病毒浓缩技术，有效清除了疫苗制品中的甲醛残留，与现有的禽流感灭活疫苗相比，本发明方法有效除去了疫苗制品中75％的甲醛残留，所制备的禽流感灭活疫苗具有免疫副反应小、保存期长、抗体水平高等优点。

Description

禽流感灭活疫苗的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，尤其涉及一种禽流感灭活疫苗的制备方法以及由该方法制备得到的灭活疫苗产品，本发明属于禽流感灭活疫苗的生产领域。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起禽发生急性出血性的传染性疾病，以引发呼吸道发病或隐性感染为特点。世界动物卫生组织(OIE)、国际贸易组织和国际兽医局将高致病性禽流感HPAI定为A类传染病，又称“真性鸡瘟”或“欧洲鸡瘟”。

禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼吸道症状和消化道症状，死亡率较低。也可表现为较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。这种症状上的不同，主要是由禽流感病毒的毒型决定的。

疫苗是防治禽流感最有效的手段，可按程序免疫接种禽流感灭活疫苗。禽流感灭活疫苗疫苗具有制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续时间较长等特点，已被许多国家地区在家禽中使用，并在预防和控制禽流感暴发中起到一定积极作用。

目前，在禽流感疫苗生产中，通常采用甲醛作为灭活剂进行病毒的灭活。甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。甲醛既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A，G，U)，又可作用于病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活。故而，为了使病原得到充分的灭活，以免发生散毒事故发生，疫苗生产过程中，均采用加大甲醛浓度及延长灭活时间等措施。这样的结果就可能造成，疫苗产品中残留大量游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生制激性反应。且在疫苗的保存过程中，多余的游离甲醛醛基不断作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐渐降解，这样疫苗中的有效成分不断流逝，不仅缩短了疫苗的保存期，还导致该疫苗免疫动物后存在抗体水平下降的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的禽流感灭活疫苗含有较高浓度的甲醛残留导致灭活疫苗存在安全性差、保存期短和保护效力差等缺陷，提供一种新的禽流感灭活疫苗的制备方法，该制备方法能够有效的去除禽流感灭活疫苗中的甲醛残留，所制备的禽流感灭活疫苗具有免疫副反应小、保存期长、抗体水平高等优点。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种禽流感灭活疫苗的制备方法，包括：制备禽流感病毒液；禽流感病毒液中加入甲醛，灭活病毒液；向灭活病毒液中加入佐剂，乳化，即得；其中，在向灭活病毒液中加入佐剂之前对灭活病毒液进行下述处理：将灭活后的病毒液浓缩，将浓缩后的病毒液稀释后再加入佐剂，乳化。

为了达到更好的技术效果，本发明优选采用膜分离为基础的切向流过滤方法(Tangential Flow Filtration，TFF)来进行病毒的浓缩操作。TFF(Tangential Flow Filtration)切向流过滤，也经常被称作交叉流过滤(Cross-flow Filtrarion)，是指液体在泵的驱动下沿着与膜表面相切的方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过膜表面，将被膜截留的颗粒和大分子冲走，避免它们堆积在膜表面，造成膜堵塞和流速下降。优选的，将灭活病毒液用切向流过滤方法浓缩2次；其中，将第1次浓缩后得到的病毒浓缩液中加入相同体积的灭菌注射用水，充分混合，进行第2次浓缩；当滤除液为原始液的1/2体积时停止第2次浓缩，向第2次浓缩后的病毒液中加入相同体积的灭菌注射用水，充分混合；再加入佐剂，乳化，即得。

其中，所述的切向流过滤优选在以下参数下进行：进口压力控制为1.0bar，循环口压力控制为0.4bar，压力差控制在0.6bar以上；料液温度控制在40-45℃以下的条件进行浓缩

本发明通过试验发现，在将灭活病毒液采用滤膜进行过滤浓缩之前，将灭活病毒液进行离心处理以去除杂蛋白，这对于提高疫苗的安全性和抗体水平有非常重要的作用；其中，所述的离心转速优选为8000-16000rpm，更优选为12000rpm；所述离心的次数可以为1-3次，优选为2次。此外，将经过离心后的病毒液再用0.45μm的滤膜进行过滤预处理也能有效的去除病毒液中的各种杂质。

本发明针对禽流感灭活疫苗生产现状，优化并改进了禽流感疫苗生产工艺流程，从甲醛浓度与免疫效价关系方面做了大量的试验，最终获得了重大突破，在禽流感(尤其是H5亚型)规模化生产规程的基础上，利用病毒浓缩技术，有效除去了疫苗中的甲醛残留，与现有工艺生产的禽流感灭活疫苗相比，本发明方法减少了疫苗制品中75％的甲醛残留，所制备的禽流感灭活疫苗具有免疫副反应小、保存期长、抗体水平高等特点。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、制备禽流感病毒液

将H5N1型重组禽流感毒(Re-5株)(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)接种鸡胚培养，收获感染胚液，得到禽流感病毒液；

2灭活

2.1将无菌检验合格的禽流感病毒液混合于一个灭活罐内，吸取数毫升样品用于毒价检测。其余胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为2‰；

2.2生产操作人员按《灭活罐操作规程》进行灭活。

2.3 37℃灭活20小时(以缸内温度达到37℃开始计时)，期间每1小时搅拌1次。灭活后的胚液置2～8℃保存，应不超过1个月。

3半成品检验

3.1无菌检验取灭活的胚液，按《中国兽药典》2005年版进行，应无菌生长。

3.2灭活检验取10日龄SPF鸡胚8个，各胚尿囊腔内接种灭活胚液0.1ml，36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定血凝价，应均不出现血凝，并盲传1代，测定血凝价，若无血凝现象，认为灭活完全。

3.3 HA效价灭活前和灭活后分别测定每个容器的HA效价，HA效价≥8log₂者方可用于制苗。

4病毒液的预处理

将待浓缩的病毒液用连续离心机12000rpm，至少2次，以去除病毒液中的杂蛋白。

5甲醛的洗脱

5.1灭活病毒液的浓缩

将离心处理的病毒液用0.45μm滤膜过滤进行浓缩前的预处理。然后按照浓缩机(PALL UF-C20)的要求，在进口压力为1.0bar，循环口压力为0.4bar，压力差控制在0.6bar以上；料液温度在40-45℃以下的条件进行浓缩。当滤除液为原始液的1/2体积时停止浓缩。浓缩后的废弃液应无血凝性。具体操作如下：

打开阀门，排空系统中的储存液(如0.1N NaOH)，将循环液管和透过液管放入废液容器，用少量纯水冲洗进液口管头；

在干净的容器中加入至少20L纯水(0.5m²膜包)，然后根据情况继续补充纯水；

清洗膜面(不加压清洗)：调节泵速至Pin＝15-20Psi并稳定，测定循环液管流出液体积不小于60L；

清洗膜孔(加压清洗)：提高泵速至进口压力达到Pin＝25Psi，调节循环阀至循环口压力至Pout＝10Psi，稳定后冲洗至透过液管流出液体积达到350L以上为止；

正常水通量测定(NWP＝Normalize Water Permeability)：通过泵速和循环阀调节Pin＝10Psi，Pout＝5Psi，测定透过液口1分钟透过的水体积，通过水温查校正因子，计算NWP；

可以正常投入使用。

5.2浓缩液的二次浓缩

向上述浓缩液中加入相同体积的灭菌注射用水，充分混合，按照5.1项要求，经行二次浓缩。当滤除液为原始液的1/2体积时停止浓缩。浓缩后的废弃液应无血凝性。

5.3浓缩液的稀释

向进行第二次浓缩后的病毒液中，加入相同体积的灭菌注射用水，充分混合。病毒液作无菌检验，应无菌生长。

6配苗及分装

向稀释后的浓缩液中加入佐剂，乳化，即得。

对比实施例1

按《重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型，Re-5株)制造及检验规程》的生产方法进行。

1、制备禽流感病毒液

将禽流感毒株Re-5株接种鸡胚培养，收获感染胚液，得到禽流感病毒液；

2.灭活

2.1将无菌检验合格的胚液混合于一个灭活罐内，吸取数毫升样品用于毒价检测。其余胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为2‰；

2.2生产操作人员按《灭活罐操作规程》进行灭活。

2.3 37℃灭活20小时(以缸内温度达到37℃开始计时)，期间每1小时搅拌1次。灭活后的胚液置2～8℃保存，应不超过1个月。

3.半成品检验

3.1无菌检验取灭活的胚液，按《中国兽药典》2005年版进行，应无菌生长。

3.2灭活检验取10日龄SPF鸡胚8个，各胚尿囊腔内接种灭活胚液0.1ml，36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定血凝价，应均不出现血凝，并盲传1代，测定血凝价，若无血凝现象，认为灭活完全。

3.3 HA效价灭活前和灭活后分别测定每个容器的HA效价，HA效价≥8log₂者方可用于制苗。

4配苗及分装

向稀释后的浓缩液中加入佐剂，乳化，即得。

试验例1本发明制备方法和对比实施例所制备的灭活疫苗的甲醛残留含量的测定试验

1、试验产品：(1)按照实施例1所述的方法进行10个批次的生产，分别得到了10个批次的产品，即：本发明灭活疫苗产品；(2)按照对比实施例1所述的方法进行10个批次的生产，也分别得到了10个批次的产品，即：对比实施例灭活疫苗产品。

2、试验方法及结果

分别检测所述10批次产品的半成品中的甲醛浓度，检测结果见表1。

表1两种生产方法半成品甲醛浓度对比表(单位：‰)

根据表1的结果可见，本发明方法所制备的半成品中甲醛的含量相比于对比实施例减少至原来的25％，本方法所制备的疫苗产品中甲醛的残留量有显著降低。

试验例2本发明制备方法所制备的灭活疫苗和对比实施例所制备的灭活疫苗的保存期及抗体水平测定试验

1、试验产品：(1)按照实施例1所述的方法进行10个批次的生产，分别得到了10个批次的产品，即：本发明灭活疫苗产品；(2)按照对比实施例1所述的方法进行10个批次的生产，也分别得到了10个批次的产品，即：对比实施例灭活疫苗产品。

2、试验方法及结果

将试验产品分别保存6个月、9个月、12个月、15个月和18个月后，再分别用其免疫鸡只，检测所产生的HI抗体水平。检测结果见表2-6。

表2疫苗保存6个月后免疫鸡只产生的HI抗体水平对比表(X×log₂)

表3疫苗保存9个月后免疫鸡只产生的HI抗体水平对比表(X×log₂)

表4疫苗保存12个月后免疫鸡只产生的HI抗体水平对比表(X×log₂)

表5疫苗保存15个月后免疫鸡只产生的HI抗体水平对比表(X×log₂)

表6疫苗保存18个月后免疫鸡只产生的HI抗体水平对比表(X×log₂)

从表5的试验结果可见，对比实施例的灭活疫苗(按《规程》规定生产)保存15个月后，其效价下降明显，已不能达到《规程》的要求，这说明对比实施例的疫苗保存期仅为12个月；从表6的试验结果可见，本发明灭活疫苗在保存期18个月后，用其免疫鸡只的效价仍能达到《规程》要求。试验结果说明，相比于现有的灭活疫苗，本发明所制备的灭活疫苗的保存期有显著的延长。

Claims (10)

1.一种禽流感灭活疫苗的制备方法，包括：制备禽流感病毒液；禽流感病毒液中加入甲醛，灭活病毒液；向灭活病毒液中加入佐剂，乳化，即得；其特征在于：在向灭活病毒液中加入佐剂之前将灭活病毒液进行下述处理：将灭活后的病毒液浓缩，将浓缩后的病毒液稀释。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的病毒液浓缩是采用过滤浓缩的方式进行浓缩。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的过滤浓缩是采用切向流过滤方法来进行病毒液的过滤浓缩。

4.按照权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：将病毒液用切向流过滤方法浓缩2次；其中，将第1次过滤浓缩后得到的病毒浓缩液中加入相同体积的灭菌注射用水，充分混合，再进行第2次浓缩，当滤除液为原始液的1/2体积时停止第2次浓缩；向第2次浓缩后的病毒液中加入相同体积的灭菌注射用水，充分混合。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的切向流过滤方法是在以下参数下进行：进口压力控制为1.0bar，循环口压力控制为0.4bar，压力差控制在0.6bar以上；料液温度控制在40-45℃以下的条件进行浓缩。

6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在将灭活病毒液采用滤膜进行过滤浓缩之前，将灭活病毒液进行离心处理。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的离心转速为8000-16000rpm；优选为12000rpm。

8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述离心的次数为1-3次；优选的，所述离心的次数为2次。

9.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：将离心处理后的病毒液用0.45μm的滤膜进行过滤。

10.由权利要求1-9任何一项所述制备方法制备得到的禽流感灭活疫苗。