CN105193721A - 一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，该方法采用多级连续纯化浓缩的方法，使用管式离心机和不同孔径的中空纤维超滤膜进行不同级别的过滤，截留大分子和小分子杂质，取出纯度较高的抗原溶液。同时，采用胶体磨和均质机连续乳化的方式对灭活疫苗进行纳米级乳化，使灭活疫苗油包水颗粒达到纳米级别，均匀度良好。常规胶体磨循环乳化2～3遍使灭活疫苗达到常规性状要求，然后通过管道连接高压均质机进液口，在均质机中循环乳化3～4次，达到100nm级别，同时均质机连接冷却装置，降低疫苗乳化过程中的温度，保证疫苗的效果。此外，在水相制备的过成中增加了免疫增强剂，有助于提升疫苗免疫效果。

Description

一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法。

背景技术

接种疫苗是畜牧业重要的疾病防控手段，尤其在禽类养殖领域，由病原微生物所导致的多种疾病往往造成严重的经济损失。其中包括鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、鸡减蛋综合症病毒、鸡传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒等在内的治病微生物均可利用疫苗加以防控。

为了获得更好的免疫效果，一方面应当开发更为有效的抗原物质，同时还应当选择合适的剂型从而提升免疫效力、降低不良反应发生率。油包水型灭活疫苗是目前市场常用的预防以上家禽疾病的一种疫苗，与活疫苗相比灭活疫苗拥有使用安全、能够有效刺激机体产生抗体、抗体持续时间长等特点。灭活疫苗领域存在的问题有抗原纯度不高，杂质较多；灭活疫苗粒度较大，稀释缓慢；免疫原性一般，抗体水平不高；疫苗保存期短等。因此导致灭活疫苗出现质量参差不齐，疫苗免疫后个体产生抗体水平的整齐度不高，抗体持续水平长短不一，不能与进口疫苗相媲美等通病。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，以解决现有技术的相关疫苗纯度低、杂质高的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的相关灭活疫苗粒度大、不易稀释。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术的相关疫苗免疫效力较差。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养作为疫苗抗原的病毒；

2)收获上述病毒培养液分别进行病毒纯化、浓缩、灭活，混合得到病毒混合液；

3)将步骤2)病毒混合液与免疫增强剂混合得到疫苗抗原；

4)对步骤3)所得的疫苗抗原先利用胶体磨进行初步乳化，而后进行纳米乳化，即得到疫苗成品；

其中所述纯化、浓缩，包括以下步骤：

a)将收获的病毒培养液冻融后，管式离心机离心，收集上清；

b)将所述上清用0.45um孔径的中空纤维滤柱过滤；

c)再用0.1um～0.22um中空纤维滤柱过滤，而后进行2～5倍体积浓缩。

优选的，步骤3)具体包括以下操作：

m)取病毒混合液总体积10～20％的2％黄芪多糖注射液将β-葡聚糖充分溶解，β-葡聚糖终浓度为10～40mg/ml；

n)取病毒混合液总体积10～20％的转移因子溶液将维生素C充分溶解，维生素C终浓度为10～50mg/ml；

p)取步骤m)和步骤n)所得产物与病毒混合液三者混合，按照混合物总体的4％～5％加入吐温80，即得到疫苗抗原。

优选的，步骤4)具体包括以下操作：

u)取步骤3)所得的疫苗抗原利用胶体磨乳化2～3遍，其中所述疫苗抗原为水相，水相与油相体积比为1:1.5～1:3，得到油乳剂疫苗；

v)将步骤u)所述油乳剂疫苗利用高压均质机在100～200bar工作压力下进行第一次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300～400bar工作压力下进行第二次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300～400bar工作压力下进行第三次纳米乳化，而后冷却，即得到疫苗成品。

优选的，步骤u)中所述油相是通过以下方法制备的：取注射用白油94份，按6％(w/w)和2％(w/w)的比例加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌即得到所述油相。

优选的，步骤2)所述灭活包括以下操作：向浓缩后产物中加入甲醛至终浓度0.1～0.2％，37℃灭活16小时。

优选的，步骤1)中所述病毒是鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、鸡减蛋综合症病毒、禽呼肠孤病毒或传染性法氏囊病病毒。

优选的，步骤u)中所述利用胶体磨乳化包括以下步骤：取配方量的油相加入胶体磨漏斗中，再加入配方量的疫苗抗原，剪切搅拌10～15分钟。

优选的，所述疫苗成品中溶质的粒径为10～100nm。

在以上技术方案中，(1)采用多级连续纯化浓缩的方法，使用管式离心机和不同孔径的中空纤维超滤膜进行不同级别的过滤，截留大分子和小分子杂质，取出纯度较高的抗原溶液。(2)采用胶体磨和均质机连续乳化的方式对灭活疫苗进行纳米级乳化，使灭活疫苗油包水颗粒达到纳米级别，均匀度良好。常规胶体磨循环乳化2～3遍使灭活疫苗达到常规性状要求，然后通过管道连接高压均质机进液口，在均质机中循环乳化3～4次，达到100nm以下级别，同时均质机连接冷却装置，降低疫苗乳化过程中的温度，保证疫苗的效果。(3)在水相制备的过成中增加了免疫增强剂，免疫增强剂的成分及含量：2％黄芪多糖注射液0.5份、β-葡聚糖10～40mg/ml、维生素C10～50mg/ml、转移因子溶液0.5份，增强剂按照20～40％的比例加入到病毒液中，通过该免疫增强剂的添加，能够显著提升疫苗免疫效果。

其技术优势主要体现在以下方面：

(1)本发明制备的灭活疫苗采用多级连续纯化的方法，在最大程度上对抗原进行纯化，祛除杂质，保证抗原纯净性，提高抗体水平。

(2)本发明采用胶体磨和均质机连续乳化的方式对灭活疫苗进行纳米级乳化，使灭活疫苗油包水颗粒达到纳米级别，并且均匀度良好，缩短疫苗注射后抗体产生的时间，提高抗体均匀度。

(3)本发明在水相制备的过成中增加了免疫增强剂，有效的诱导机体产生免疫反应，再次提高抗体水平。

(4)本发明通过提高抗原纯度、降低疫苗粒度来达到延长疫苗保质期的效果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

一种可预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡传染性法氏囊病、禽呼肠孤病毒和禽流感病毒纳米级灭活疫苗制备的一种方法，所述疫苗通过包括以下步骤的疫苗制备方法制备得到：

1)通过鸡胚扩大培养鸡新城疫病毒；或(和)通过鸡胚扩大培养鸡传染性支气管炎病毒；或(和)通过鸡胚扩大培养禽流感病毒；或(和)通过鸭胚扩大培养鸡减蛋综合症病毒；或(和)通过宿主细胞扩大培养鸡传染性法氏囊病病毒(或禽流感病毒或禽呼肠孤病毒)；

2)分别收获上述病毒扩大培养产物并进行病毒纯化、浓缩；

3)分别对上述浓缩产物进行病毒含量测定和病毒灭活处理；

4)分别对上述灭活产物进行半成品检验；

5)检验合格的半成品与免疫增强剂进行混合制得疫苗抗原；

6)疫苗抗原经初乳、纳米乳化后得到疫苗成品；

7)疫苗成品经分装检验后即为商品化疫苗。

上述禽用纳米级灭活疫苗的病毒纯化、浓缩采用多级连续的方式，其具体纯化、浓缩过程包括以下步骤：

1)将收获的病毒液反复冻融后，管式离心机高速离心去除大颗粒杂质，收集上清至无菌罐体中；

2)取滤液用0.45um孔对径的中空纤维滤柱，利用管道及蠕动泵对初滤的病毒液大颗粒物质过滤；

3)取0.1um～0.22um中空纤维滤柱过滤去掉病毒液小分子杂质，并进行2～4倍浓缩；

上述禽用纳米级灭活疫苗疫苗抗原的制备，其具体包括以下步骤：

1)取病毒液体积的10～20％的2％黄芪多糖注射液将β-葡聚糖10～40mg/ml充分溶解；

2)猪脾脏转移因子液体的获得由本公司自主生产，取10～20％病毒液体积的转移因子溶液将维生素C10～50mg/ml充分溶解；

3)将1)和2)两者充分混合均匀后再与病毒抗原充分混合，按照总体的4％～5％加入吐温80，制得疫苗抗原。

上述禽用疫苗的乳化方法是采用多级乳化的方法，其具体包括以下步骤：

1)胶体磨常规乳化2～3遍，水油比例为1:2、1:3和2:3，达到灭活疫苗性状的要求；

2)将油乳剂疫苗通过管道连接高压均质机(型号AH-Pilot)进行第一次纳米级乳化(工作压力100～200bar)，乳化后的油乳剂疫苗通过在循环制冷设备中的管道的进行降温，然后进行第二次乳化(工作压力300～400bar)，同样的操作进行第三次乳化达到纳米级别(工作压力300～400bar)，使其达到粒径10～100nm级别，累计含量达到100％。

上述禽用纳米级灭活疫苗的制备方法具体包括以下步骤：

(1)病毒水相制备分别取各病毒生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-4～10^-5稀释，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1:256(微量法)者应弃去。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。收获的胚液-15℃以下保存，应不超过2个月。

(2)病毒纯化、浓缩

1)离心初滤：病毒通过管式离心机(GQ型)离心，离心后病毒液收集到无菌罐中。

2)纯化设备准备：连接0.45um中空纤维滤柱的管道，用无菌的0.1N的NaOH溶液流动清洗滤柱10～30分钟，然后循环清洗30分钟，流动清洗10～30分钟，然后用无菌的纯化水清洗滤柱至pH中性。0.1um～0.22um的中空纤维滤柱按照同样的方法清洗准备。

3)病毒纯化：用管道将初滤后病毒液与0.45um中空纤维滤柱进行连接，启动蠕动泵进行过滤，去掉大分子杂质，收集初次纯化的病毒液连接0.1um中空纤维滤柱，进行循环过滤，去掉小分子杂质并进行1～2倍浓缩。

(3)半成品测定效价及病毒液灭活

1)效价测定：纯化后病毒液澄清，无肉眼可见大分子杂质，用红细胞凝集试验测定血凝价不低于2¹⁰。

2)病毒液灭活：将纯化后的病毒液导入灭活罐内，计量加入总体积1‰的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合以，37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，灭活后取样进行灭活检验，灭活后样品放2～8℃保存，应不超过2周。

(4)灭活检验：取灭活后样品，无菌尿囊腔接种10～11日龄的SPF鸡胚6枚，接种量为0.2ml/胚，37℃培养7日，鸡胚应全部健活。红细胞凝集试验阴性。

(5)疫苗抗原的获得

1)取病毒液体积10～20％的灭菌去离子水，将2％黄芪多糖注射液1～9份/ml、β-葡聚糖10～40mg/ml逐一充分溶解；

2)猪脾脏转移因子液体的获得由本公司自主生产，取10～20％病毒液体积，维生素C10～50mg/ml；

3)将1)和2)两者充分混合均匀后再与病毒抗原充分混合，按照总体的4％～5％加入吐温80，制得疫苗抗原。

(6)疫苗制备

1)油相制备：取进口注射用白油94份，先将白油缓慢加温，按6％和2％加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用。

2)初乳：利用胶体磨进行初步乳化。将2份油相加入胶体磨漏斗中，打开电源，缓慢加入疫苗抗原1份，剪切搅拌10～15分钟，取疫苗10ml，3000rpm/min离心10分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。停止搅拌。

3)纳米乳化

将初乳油乳剂灭活疫苗通过管道连接高压均质机(型号AH-Pilot)进行第一次纳米级乳化工作压力(100～200bar)，第一次乳化后油乳剂疫苗通过在循环制冷设备中的管道的进行降温，然后进行第二次乳化(工作压力300～400bar)，同样的操作进行第三次乳化达到纳米级别(工作压力300～400bar)。冷却后使用激光粒度仪(型号)进行粒度测定，使其达到粒径10～100nm级别，累计含量达到100％，停止乳化。

(7)成品检验

1)外观：乳白色乳剂。

2)剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。

3)稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

4)黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

5)无菌检验：按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。

6)安全检验：用14龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。

7)效力检验：采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20ul，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:16(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4(微量法)。

实施例2(鸡新城疫、禽流感二联纳米灭活疫苗的制备)

1一种鸡新城疫、禽流感二联纳米灭活疫苗的制备方法

1.1鸡新城疫病毒水相制备

取鸡新城疫病毒生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-4稀释，接种10日龄易感鸡胚280枚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育。每日照胚2～4次，将60小时前死亡的鸡胚弃去，死亡的胚随时取出，至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，共收获病毒液2500ml，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1:256(微量法)者应弃去。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。收获的胚液-15℃以下保存，应不超过2个月。

1.2禽流感病毒水相制备

将毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚280枚，每胚0.1ml，收集接种后24～96小时内死亡的鸡胚尿囊液，装于无菌容器内，共收集病毒液2500ml。抽样测定红细胞凝集价，凝集价低于1:128(微量法)者应弃去。将检验无菌、病毒含量合格的毒液-15℃以下冷冻保存，不超过1个月。

1.3病毒纯化、浓缩

1.3.1离心初滤

新城疫病毒和禽流感病毒分别通过管式离心机(GQ型)离心，离心后病毒液收集到无菌罐中。

1.3.2纯化设备准备

连接0.45um中空纤维滤柱的管道，用无菌的0.1N的NaOH溶液流动清洗滤柱10分钟，然后循环清洗30分钟，流动清洗10分钟，然后用无菌的纯化水清洗滤柱至pH中性。0.1um的中空纤维滤柱按照同样的方法清洗准备。

1.3.3病毒纯化

用管道将初滤后新城疫病毒液与0.45um滤柱进行连接，启动蠕动泵进行过滤，去掉大分子杂质，收集初次纯化的病毒液连接0.1um中空纤维滤柱，进行循环过滤，去掉小分子杂质并进行2倍浓缩，纯化后病毒液体积为700ml。禽流感病毒纯化步骤同新城疫病毒，纯化后病毒液体积为700ml。

1.4半成品效价测定及病毒液灭活

1.4.1效价测定

纯化后病毒液澄清，无肉眼可见大分子杂质，新城疫病毒用红细胞凝集试验测定血凝价不低于2¹⁰，禽流感病毒红细胞凝集试验测定血凝价不低于2⁹。

1.4.2病毒液灭活

将纯化后的鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液分别导入灭活罐内，计量加入终浓度1‰的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合以，37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，灭活后取样进行灭活检验，灭活后样品放2～8℃保存，应不超过2周。

1.4.3灭活检验

取灭活后样品，分别无菌尿囊腔接种10～11日龄的SPF鸡胚6枚，接种量为0.2ml/胚，37℃培养7日，鸡胚应全部健活。红细胞凝集试验阴性。

1.5疫苗抗原的获得

1.5.1取病毒液体的20％的黄芪多糖注射液280ml、β-葡聚糖0.8g充分溶解于其中.

1.5.2猪脾脏转移因子液体的获得由本公司自主生产，取20％病毒液体积(280ml)的转移因子溶液，将维生素C0.8g充分溶解。

1.5.3将以上两者充分混合均匀后再与病毒抗原充分混合，共计1960ml，按照总体的5％加入吐温8098ml，充分混合均匀制得疫苗抗原2058ml。

1.6疫苗制备

1.6.1油相制备

取进口注射用白油5825ml，先将白油缓慢加温，加入350ml加入司班80和117g的硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用。

1.6.2初乳

利用胶体磨(型号)进行初步乳化。将6174ml份油相加入胶体磨漏斗中，打开电源，缓慢加入疫苗抗原2058ml，研磨搅拌10～15分钟，取疫苗10ml，3000rpm/min离心10分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。停止搅拌。

1.6.3纳米乳化

将初乳油乳剂灭活疫苗8232ml通过管道连接高压均质机进行第一次纳米级乳化工作压力(150bar)，第一次乳化后油乳剂疫苗通过在循环制冷设备中的管道的进行降温，然后进行第二次乳化(工作压力300bar)，同样的操作进行第三次乳化达到纳米级别(工作压力400bar)。冷却后使用激光粒度仪(型号BT-9300H)进行粒度测定，使其达到粒径10～100nm级别，累计含量达到100％，停止乳化，分装压盖。

1.7成品检验

1.7.1外观

乳白色乳剂。

1.7.2剂型

油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。

1.7.3稳定性

吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

1.7.4黏度

按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

1.7.5无菌检验

按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。

1.7.6安全检验

用14龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。

1.7.7效力检验

1.7.7.1新城疫部分

血清学方法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20ul，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值为1:64(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值1:2(微量法)。

1.7.7.2禽流感部分

血清学方法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值为1:256(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值1:2(微量法)。

2以上所制备疫苗的免疫效果比较

本发明采用胶体磨和均质机连续乳化的方式对灭活疫苗进行纳米级乳化，使灭活疫苗油包水颗粒达到纳米级别，并且均匀度良好，缩短疫苗注射后抗体产生的时间，提高抗体均匀度。利用7日龄的肉雏鸡分别接种纳米疫苗和常规疫苗，不同时间段采血，分别测定抗体水平，比较两种疫苗的免疫效果。

2.1实验设计

取7日龄罗斯308肉雏鸡40只，每组20只，分别颈背部皮下注射不同的新流二联灭活疫苗，免疫剂量0.2ml/只。免疫后1、5、7、14、21、28、35天至出栏前，分别采血一次，分离血清，检测ND抗体水平；并且免疫7、14天分别抽取5只鸡进行剖检，观察疫苗的吸收状况。

2.2抗体检测

灭活疫苗免疫后定期采血，分离血清，检测ND抗体，抗体水平具体数据如表1。

表1不同剂型的油乳剂灭活疫苗免疫肉鸡后ND抗体水平(nlog2)

对7日龄的肉雏鸡分别接种不同新流灭活疫苗，采血，分离血清，检测ND抗体。纳米灭活疫苗免疫14天后，鸡群的抗体水平虽然处于下降的阶段，但是个体的抗体水平离散度逐渐缩小，免疫28天后抗体水平达到峰值，抗体分布均匀一致。常规疫苗免疫后每只鸡的抗体水平参差不齐，离散度大，且抗体水平在免疫后35天才达到2⁷，处于临床保护的临界值。

免疫7、14天分别抽取5只鸡进行剖检，观察疫苗的吸收状况。结果表明，纳米灭活苗免疫7天，略有少量未吸收，免疫14天后疫苗全部吸收。常规疫苗免疫14天后吸收较差，残余量较多。

检测AI抗体，抗体水平具体数据如表2。

表2不同剂型的油乳剂灭活疫苗免疫肉鸡后AI抗体水平(nlog2)

对7日龄的肉雏鸡分别接种不同新流灭活疫苗，采血，分离血清，检测AI抗体。纳米灭活疫苗免疫14天后，鸡群的抗体水下降至最低点，免疫21天后抗体水平开始上升，至免疫28天抗体达到高峰为7log2，并且个体间抗体水平离散度较小，至出栏前抗体水平仍然维持在7log2。常规疫苗免疫后每只鸡的抗体水平参差不齐，抗体产生较晚。个别鸡只抗体水平在出栏前仍有上升的趋势，离散度较大。

2.3结论

与常规灭活疫苗相比，纳米级新流二联灭活疫苗免疫7日龄肉鸡，免疫后抗体产生较早，个体间抗体值离散度较小，且抗体维持时间较长，可至出栏。

实施例3

一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡减蛋综合症病毒、禽呼肠孤病毒；

2)收获上述病毒培养液分别进行病毒纯化、浓缩、灭活，混合得到病毒混合液；

3)将步骤2)病毒混合液与免疫增强剂混合得到疫苗抗原；

4)对步骤3)所得的疫苗抗原先利用胶体磨进行初步乳化，而后进行纳米乳化，即得到疫苗成品；

其中所述纯化、浓缩，包括以下步骤：

a)将收获的病毒培养液冻融后，管式离心机离心，收集上清；

b)将所述上清用0.45um孔径的中空纤维滤柱过滤；

c)再用0.1umum中空纤维滤柱过滤，而后进行5倍体积浓缩。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤3)具体包括以下操作：

m)取病毒混合液总体积10％的2％黄芪多糖注射液将β-葡聚糖充分溶解，β-葡聚糖终浓度为10mg/ml；

n)取病毒混合液总体积10％的转移因子溶液将维生素C充分溶解，维生素C终浓度为10mg/ml；

p)取步骤m)和步骤n)所得产物与病毒混合液三者混合，按照混合物总体的4％加入吐温80，即得到疫苗抗原。

步骤4)具体包括以下操作：

u)取步骤3)所得的疫苗抗原利用胶体磨乳化2遍，其中所述疫苗抗原为水相，水相与油相体积比为1:1.5，得到油乳剂疫苗；

v)将步骤u)所述油乳剂疫苗利用高压均质机在100bar工作压力下进行第一次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300bar工作压力下进行第二次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300bar工作压力下进行第三次纳米乳化，而后冷却，即得到疫苗成品。

步骤u)中所述油相是通过以下方法制备的：取注射用白油94份，按6％(w/w)和2％(w/w)的比例加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌即得到所述油相。

步骤2)所述灭活包括以下操作：向浓缩后产物中加入甲醛至终浓度0.1～0.2％，37℃灭活16小时。

步骤1)中鸡新城疫病毒、禽流感病毒是利用鸡胚培养的；鸡减蛋综合症病毒是利用鸭胚培养的；禽呼肠孤病毒是利用宿主细胞培养的。

步骤u)中所述利用胶体磨乳化包括以下步骤：取配方量的油相加入胶体磨漏斗中，再加入配方量的疫苗抗原，剪切搅拌10分钟。

所述疫苗成品中溶质的粒径为10nm。

实施例4

一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养作为疫苗抗原的病毒；

2)收获上述病毒培养液分别进行病毒纯化、浓缩、灭活，混合得到病毒混合液；

3)将步骤2)病毒混合液与免疫增强剂混合得到疫苗抗原；

4)对步骤3)所得的疫苗抗原先利用胶体磨进行初步乳化，而后进行纳米乳化，即得到疫苗成品；

其中所述纯化、浓缩，包括以下步骤：

a)将收获的病毒培养液冻融后，管式离心机离心，收集上清；

b)将所述上清用0.45um孔径的中空纤维滤柱过滤；

c)再用0.22um中空纤维滤柱过滤，而后进行3倍体积浓缩。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤3)具体包括以下操作：

m)取病毒混合液总体积20％的2％黄芪多糖注射液将β-葡聚糖充分溶解，β-葡聚糖终浓度为40mg/ml；

n)取病毒混合液总体积20％的转移因子溶液将维生素C充分溶解，维生素C终浓度为50mg/ml；

p)取步骤m)和步骤n)所得产物与病毒混合液三者混合，按照混合物总体的5％加入吐温80，即得到疫苗抗原。

步骤4)具体包括以下操作：

u)取步骤3)所得的疫苗抗原利用胶体磨乳化3遍，其中所述疫苗抗原为水相，水相与油相体积比为1:3，得到油乳剂疫苗；

v)将步骤u)所述油乳剂疫苗利用高压均质机在200bar工作压力下进行第一次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在400bar工作压力下进行第二次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在400bar工作压力下进行第三次纳米乳化，而后冷却，即得到疫苗成品。

步骤u)中所述油相是通过以下方法制备的：取注射用白油94份，按6％(w/w)和2％(w/w)的比例加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌即得到所述油相。

步骤2)所述灭活包括以下操作：向浓缩后产物中加入甲醛至终浓度1‰，37℃灭活16小时。

步骤1)中所述病毒是鸡新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒。

步骤u)中所述利用胶体磨乳化包括以下步骤：取配方量的油相加入胶体磨漏斗中，再加入配方量的疫苗抗原，剪切搅拌15分钟。

所述疫苗成品中溶质的粒径为100nm。

实施例5

一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1)培养鸡新城疫病毒；

2)收获上述病毒培养液进行病毒纯化、浓缩、灭活，混合得到病毒混合液；

3)将步骤2)病毒混合液与免疫增强剂混合得到疫苗抗原；

4)对步骤3)所得的疫苗抗原先利用胶体磨进行初步乳化，而后进行纳米乳化，即得到疫苗成品；

其中所述纯化、浓缩，包括以下步骤：

a)将收获的病毒培养液冻融后，管式离心机离心，收集上清；

b)将所述上清用0.45um孔径的中空纤维滤柱过滤；

c)再用0.22um中空纤维滤柱过滤，而后进行2倍体积浓缩。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别培养作为疫苗抗原的病毒；

2)收获上述病毒培养液分别进行病毒纯化、浓缩、灭活，混合得到病毒混合液；

3)将步骤2)病毒混合液与免疫增强剂混合得到疫苗抗原；

4)对步骤3)所得的疫苗抗原先利用胶体磨进行初步乳化，而后进行纳米乳化，即得到疫苗成品；

其中所述纯化、浓缩，包括以下步骤：

a)将收获的病毒培养液冻融后，管式离心机离心，收集上清；

b)将所述上清用0.45um孔径的中空纤维滤柱过滤；

c)再用0.1um～0.22um中空纤维滤柱过滤，而后进行2～4倍体积浓缩。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)具体包括以下操作：

m)取病毒混合液总体积10～20％的2％黄芪多糖注射液将β-葡聚糖充分溶解，β-葡聚糖终浓度为10～40mg/ml；

n)取病毒混合液总体积10～20％的转移因子溶液将维生素C充分溶解，维生素C终浓度为10～50mg/ml；

p)取步骤m)和步骤n)所得产物与病毒混合液三者混合，按照混合物总体的4％～5％加入吐温80，即得到疫苗抗原。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)具体包括以下操作：

u)取步骤3)所得的疫苗抗原利用胶体磨乳化2～3遍，其中所述疫苗抗原为水相，水相与油相体积比为1:1.5～1:3，得到油乳剂疫苗；

v)将步骤u)所述油乳剂疫苗利用高压均质机在100～200bar工作压力下进行第一次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300～400bar工作压力下进行第二次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300～400bar工作压力下进行第三次纳米乳化，而后冷却，即得到疫苗成品。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤u)中所述油相是通过以下方法制备的：取注射用白油94份，按6％(w/w)和2％(w/w)的比例加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌即得到所述油相。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述灭活包括以下操作：向浓缩后产物中加入甲醛至终浓度0.1～0.2％，37℃灭活16小时。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述病毒是鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、鸡减蛋综合症病毒、禽呼肠孤病毒或传染性法氏囊病病毒。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤u)中所述利用胶体磨乳化包括以下步骤：取配方量的油相加入胶体磨漏斗中，再加入配方量的疫苗抗原，剪切搅拌10～15分钟。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述疫苗成品中溶质的粒径为10～100nm。