CN102688485A

CN102688485A - 一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法

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Publication number: CN102688485A
Application number: CN2011102761056A
Authority: CN
Inventors: 潘杰; 范娟; 沈明君; 傅元华; 钱钟
Original assignee: YANGZHOU YOUBANG BIOPHARMACEUTICALS CO Ltd
Current assignee: YANGZHOU YOUBANG BIOPHARMACEUTICALS CO Ltd
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其制备步骤具体如下：（1）将猪细小病毒液从原料罐中放入微滤系统进行过滤，得到渗透液及浓缩液，所述浓缩液返回原料罐，当猪细小病毒液固含量大于或等于1g/L后，将猪细小病毒液排出；（2）将渗透液进行超滤处理，进一步浓缩毒液，直到病毒血凝价达到到2⁸～2¹³时停止浓缩，得到浓缩液；（3）将浓缩液用微滤系统再过滤，处理完后得到血凝价为2⁸～2¹³的细小病毒毒液；（4）将细小病毒毒液灭活及将浓缩及灭活后病毒液制备成疫苗产品。本发明提供一种安全可行的疫苗生产方法，使该疫苗的生产能够不再依赖传统工艺从而生产出高滴度的毒液，提高抗原含量，满足免疫生产要求。

Description

一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，尤其是一种猪细小病毒灭活疫苗的纯化、浓缩工艺的设计方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

猪细小病毒(PPV)能够引起母猪繁殖障碍疾病，导致母猪产死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母猪不育等。目前该病已呈世界性分布，给养猪业造成了严重的经济损失。德国学者Mayr首次最早发现了PPV，我国学者潘雪珠等1983年成功实现该病毒的分离。

目前PPV疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因工程活病毒载体疫苗等，其中灭活疫苗具有安全性好、产生抗体时间长、不需要低温保存的优点；弱毒疫苗免疫效力较强、产生抗体快、用量少、成本低，但安全性较差；基因工程亚单位疫苗免疫源性较好，但成本和技术要求都比较高；基因工程活病毒载体疫苗可以同时预防两种病或多种病的、能够诱导较强的免疫反应，但生产技术复杂、成本较高；基因疫苗生产工艺简单、免疫剂量小、成本低廉、可构建多基因或多价疫苗，但其安全性受到广泛关注。由于灭活疫苗的存在上述优点，因此该方法得到了广泛的应用。

我国均普遍使用猪细小病毒灭活疫苗，使用的主要灭活剂有福尔马林、β-丙内酯(β-PL)、N-乙酰乙烯亚胺(AEI)、二乙烯亚胺(BEI)等。有试验表明，猪细小病毒用福尔马林灭活后制成疫苗的保护效果不如用N-乙酰乙烯亚胺灭活后制成疫苗的保护效果好；用β-丙内酯灭活疫苗的保护力较好。免疫佐剂也是影响猪细小病毒灭活疫苗免疫效果的重要因素，但几种佐剂的混合物，如油佐剂、SDS、L-121、氢氧化铝和油乳剂的混合物以及SDS、氢氧化铝的混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低。目前经常采用的佐剂是蜂胶、氢氧化铝和油水乳剂。猪细小病毒灭活多联疫苗的使用较为广泛，主要有猪细小病毒-猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒-乙脑病毒等二联苗，因为除了猪细小病毒外，猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征障碍病毒(PRRSV)、乙脑病毒(JEV)等均能引起母猪的繁殖障碍，而且多联苗的使用可以简化免疫程序，降低临床应激反应，适合规模化养猪。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种解决猪细小病毒的浓缩、纯化及灭活的工艺设计问题；提供一种安全可行的疫苗生产方法，使该疫苗的生产能够不再依赖传统工艺从而生产出高滴度的毒液，提高抗原含量，满足免疫生产要求。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将猪细小病毒液从原料罐中放入微滤系统进行过滤，得到渗透液及浓缩液，所述渗透液中不含有细菌及细胞碎片杂质，所述浓缩液返回原料罐，当猪细小病毒液固含量大于或等于1g/L后，将猪细小病毒液排出；

(2)将通过步骤(1)处理的渗透液，进行超滤处理，进一步浓缩毒液，直到病毒血凝价达到到2⁸～2¹³时停止浓缩，得到浓缩液；

(3)将步骤(2)处理完的浓缩液用微滤系统再过滤，处理完后得到血凝价为2⁸～2¹³的细小病毒毒液；

(4)将步骤(3)得到的细小病毒毒液灭活及将浓缩及灭活后病毒液制备成疫苗产品。

血凝实验(HA)是指病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象成为血凝，也称为直接雪凝反应，利用这种特性设计的实验称血凝实验，病毒血凝价是指血凝试验的检测结果。

固含量，又叫“不挥发份含量”，是乳液或涂料在规定条件下烘干后剩余部分占总量的质量百分数。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述微滤膜孔径为100nm～220nm，超滤膜孔径为5KD～200KD。

进一步，所述的微滤和超滤膜分离材料可以是有机膜材料也可以是无机膜材料。主要包括陶瓷材料、金属材料及有机高分子材料。其中有机高分子主要有醋酸纤维素、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚乙烯醇或聚哌嗪酰胺；无机氧化物材料主要有氧化铝、氧化钛、氧化锆以及氧化铪。

进一步，所述微滤及超滤的操作条件为温度5～50℃，压力0.01～0.5MPa，膜面流速1～5m/s。

进一步，在步骤(4)中，所述细小病毒毒液的灭活包括收集步骤(3)得到的细小病毒毒液，采用二乙烯亚胺作为灭活剂，灭活剂浓度为0.1％～1％，灭活温度为25～38℃，灭活时间为24～120小时。

进一步，在步骤(4)中，所述将浓缩及灭活后病毒液制备成疫苗产品的具体步骤为：

(1)油相制备：取注射用白油90～98份，加硬脂酸铝1～3份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-804～8份，混合后，在压强为0.1MP～0.15MP、温度为115～130℃的条件下，灭菌备用；

(2)水相制备：取浓缩后灭活的病毒液90～98份，加入灭菌的吐温-802～8份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解；

(3)乳化：取油相2～4份置于乳化罐中，搅拌的同时缓慢加入水相1份，持续搅拌30～70分钟，搅拌速度600～1200r/min，后通过剪切机2～3次剪切，剪切速度3000～5000r/min，即制成猪细小病毒灭活疫苗。

本发明的有益效果是：本发明的技术方案用于猪细小病毒灭活疫苗的纯化、浓缩工艺设计，提高了疫苗的抗原含量、去除了杂蛋白，改善了疫苗的免疫效果，同时减少了注射疫苗时动物的应激反应；使动物在获得疫病保护的同时不影响相关生产性能，增加了养殖户的收益，具有广泛的社会效益和经济效益。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本实施案例说明猪细小病毒毒液制备的方法：

1、细胞制备从液氮罐中取出细胞置37℃水浴中快速融化，将细胞移入装有10％胎牛血清细胞生长液的细胞瓶中，37℃培养，当长成良好单层时用胰酶消化液消化细胞，按1∶2传代逐级扩大。将扩大培养的种子细胞接种到15000ml毫升转瓶中，每瓶加1000ml含10％新生牛血清的细胞生长液，37℃培养，转瓶速度为6～12转/小时，待长成良好单层后，用胰酶消化液消化细胞，按1∶3分瓶传代。

2、病毒繁殖取F13代BJ-2株PPV生产种毒，按2％接种量接种于生长良好的ST细胞，同时加入含2％胎牛血清的细胞维持液，37℃培养，每天观察细胞病变(CPE)情况。

3、收获与保存接毒后每天观察细胞生长和病变(CPE)的情况，并做好详细记录。培养至72～96小时，当CPE达到70-80％时收获培养物，反复冻融2～3次，-20℃以下保存备用，时间不超过6个月。

实施例2

本实施案例说明猪细小病毒纯化、浓缩的方法：

取血凝价为28的猪细小病毒液20000毫升，进行纯化、浓缩，测定血凝价，比较其浓缩前后的差异。具体步骤如下：

(1)将原料液加入孔径为0.22微米的微滤系统进行过滤，浓缩液返回原料罐，大约10分钟后将原料液排出；收集渗透压，此时观察渗透液、清澈、明亮，既已除去细胞碎片等杂质，进入下一步超滤浓缩步骤。

(2)细小病毒毒液的超滤浓缩

将已预处理的渗透液，用1m2的截留分子量为30KD的聚醚砜平板膜包浓缩，进一步浓缩毒液，浓缩参数见下表：

注：ΔP＝dP＝P_IN-P_OUT

Transmembrane Pressure(bar)＝TMP＝(P_IN+P_OUT)/2P_Perm

(3)浓缩液的再处理

将浓缩液用微滤系统再过滤，进一步除去细菌等杂质，确保获得毒价高、无污染、纯净的细小病毒毒液。做无菌试验，没有细菌生长

(4)纯化、浓缩后的表现

无菌试验结果

培养基	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时
						葡萄糖蛋白胨	阴性	阴性	阴性	阴性	阴性
马丁肉汤	阴性	阴性	阴性	阴性	阴性
						硫乙醇酸盐	阴性	阴性	阴性	阴性	阴性
酪胨琼脂	阴性	阴性	阴性	阴性	阴性
						支原体培养基	阴性	阴性	阴性	阴性	阴性

血凝价表现

浓缩倍数	2	3	4	5	7.5
						浓缩液体积(mL)	10000	6667	5000	4000	2667
血凝价	9	9	10	10	11

纯化、浓缩后做无菌试验，没有细菌、霉菌、支原体等生长。

纯化、浓缩后血凝价提高3倍，说明细小病毒含量大幅升高，达到浓缩效果。

实施例3

本实施案例说明猪细小病毒灭活的方法：

二乙烯亚胺(BEI)灭活试验取5瓶猪细小病毒抗原液，分别加入0.02％、0.05％、0.08％、0.1％、0.15％终浓度的BEI(由BEA环化制得)，32℃灭活，分别于灭活24、48、72、96、120小时取样做灭活检验，将所取灭活毒液样品用不含血清的细胞营养液10倍稀释后，接种已长成单层的猪睾丸细胞(ST细胞)，1ml/瓶，吸附1小时后，换成含2％胎牛血清的细胞生长液培养5天，观察细胞形态及生长状况，确定有无细胞病变(CPE)出现，收获培养物，冻融3次，在ST细胞上连续传2代，同时做HA检测，观察有无凝集性，现将试验结果汇报如下：

BEI不同浓度、时间对灭活效果的影响

由灭活试验的结果可见，0.08％BEI 32℃灭活72小时，病毒即被彻底灭活，虽然0.02％的BEI灭活5天、0.05％的BEI灭活4天、0.1％BEI灭活3天、0.15％BEI灭活2天，亦可灭活完全，但考虑到生产周期性、疫苗效果及保证灭活检验判断不受影响，拟选择32℃0.08％BEI灭活96小时作为生产的灭活条件。

实施例4

本实施案例说明猪细小病毒乳化的方法：

乳化试验以特级10号白油94份，加6份司本-80，混合后加热，另加硬脂酸铝1％，高压灭菌，冷却，制备成油相；4份无菌吐温-80，灭活抗原液96份，混合制备成水相。按照油水比1∶1、1.5∶1、2∶1的配比，乳化温度8～10℃、18～20℃，以4000r/min的剪切速率，分别剪切1次、2次，制成疫苗后检验各组疫苗的外观、剂型、粘度、稳定性。

不同乳化条件及油水比制备疫苗组号

注：SD1代表低温一次剪切实验苗；SD2代表低温二次剪切实验苗；

SC1代表常温一次剪切实验苗；SC2代表常温二次剪切实验苗；

各组疫苗的性状检测结果

检测结果表明，按照特级10号白油94份，加6份司本-80，硬脂酸铝1％，制备成油相；4份吐温-80，灭活抗原液96份，混合制备成水相，在18～22℃，剪切速率4000r/min条件下，剪切2次，1.5∶1和2∶1两种油水比例乳化疫苗，其性状都符合现行《中国兽药典》中灭活疫苗性状常规标准，其余均不符合标准，因此乳化条件确定为温度18～22℃，剪切速率4000r/min，剪切2次。

实施例5

本实施案例说明新工艺猪细小病毒灭活疫苗的免疫效力

纯化、浓缩的毒液与未纯化、浓缩的毒液制成苗的效果比较

将普通猪细小病毒液制成疫苗；将经纯化、浓缩工艺后的猪细小病毒液制成疫苗。按照常规使用剂量(2ml/头)，分别免疫PPV抗原抗体阴性的后备青年母猪、4～6月龄公猪，颈部肌肉注射，各12头，同条件下分组饲养28日，采血分离血清，以微量法测定HI抗体效价，结果如下：

不同实验组免疫后的表现

由结果可以看出，未纯化、浓缩组，28天后其血清抗体效价平均不低于1∶64，而纯化、浓缩组抗体效价平均不低于1∶128，甚至出现很多1∶256，所以纯化、浓缩后疫苗的免疫效果明显好于为纯化、浓缩。

实施例6

本实施案例说明新工艺猪细小病毒灭活疫苗的保存期

疫苗保存期检验

取保存6、9、12、15个月的猪细小病毒灭活疫苗，进行效力试验。

1、豚鼠的效力检验各选取体重300～350g的PPV阴性(血清HI抗体效价不高于1∶8)健康豚鼠5只，每只分别注射疫苗0.5ml，连同对照豚鼠2只，28日后采血分离血清，测定血清抗体。

2、猪的效力检验用4～6月龄PPV抗体阴性(血清HI抗体效价不高于1∶8)健康猪共36头，每批疫苗用8头，同时每次设对照4头。每头颈部肌肉注射疫苗2ml，28日后采血分离血清，测定HI效价。

保存期试验(血清HI抗体检测)结果

保存期试验结果表明2～8℃贮藏6、9、12、15个月的疫苗免疫豚鼠和试验猪，抗体合格，皆能够符合免疫保护要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，其制备步骤具体如下：

（1）将猪细小病毒液从原料罐中放入微滤系统进行过滤，得到渗透液及浓缩液，所述渗透液中不含有细菌及细胞碎片杂质，所述浓缩液返回原料罐，当猪细小病毒液固含量大于或等于1g/L后，将猪细小病毒液排出；

（2）将通过步骤（1）处理的渗透液，进行超滤处理，进一步浓缩毒液，直到病毒血凝价达到到2⁸～2¹³时停止浓缩，得到浓缩液；

（3）将步骤（2）处理完的浓缩液用微滤系统再过滤，处理完后得到血凝价为2⁸～2¹³的细小病毒毒液；

（4）将步骤（3）得到的细小病毒毒液灭活及将浓缩及灭活后病毒液制备成疫苗产品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微滤膜孔径为100nm～220nm，超滤膜孔径为5KD～200KD。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的微滤和超滤的膜为陶瓷材料、金属材料、有机高分子材料、无机氧化物材料。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机高分子材料为醋酸纤维素、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚乙烯醇或聚哌嗪酰胺。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述无机氧化物材料为氧化铝、氧化钛、氧化锆、氧化铪。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微滤及超滤的操作条件为温度5～50℃，压力0.01～0.5MPa，膜面流速1～5m/s。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述细小病毒毒液的灭活包括收集步骤（3）得到的细小病毒毒液，采用二乙烯亚胺作为灭活剂，灭活剂浓度为0.1%～1%，灭活温度为25～38℃，灭活时间为24～120小时。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述将浓缩及灭活后病毒液制备成疫苗产品的具体步骤为：

（1）油相制备：取注射用白油90～98份，加硬脂酸铝1～3份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 4～8份，混合后，在压强为0.1MP～0.15MP、温度为115～130℃的条件下，灭菌备用；

（2）水相制备：取浓缩后灭活的病毒液90～98份，加入灭菌的吐温-80 2～8份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解；

（3）乳化：取油相2～4份置于乳化罐中，搅拌的同时缓慢加入水相1份，持续搅拌30～70分钟，搅拌速度600～1200r/min，后通过剪切机2～3次剪切，剪切速度3000～5000 r/min，即制成猪细小病毒灭活疫苗。