CN1616095A - 减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法 - Google Patents

减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，它将大规模培养出来的病毒液经过1.0－0.6μm、0.6－0.45μm、0.45－0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清，超滤浓缩，柱层析纯化及灭活等后处理工艺，将病毒液制备成纯度高、免疫原性及安全好、质量稳定的合格疫苗半成品，从而满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需要。本发明可大规模处理大量的病毒液，且生产工艺稳定，重复性好；用本发明生产的疫苗半成品，无外原因子污染，细胞DNA残留量少，灭活后的半成品经检查无活病毒存在，安全可靠，半成品抗原含量高，能够满足成品生产的需要；用本发明生产的疫苗半成品制备成Sabin IPV成品疫苗，其质量稳定，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求。

Description

减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法
技术领域
本发明涉及减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的后处理方法，属于医学生物
技术领域。
背景技术
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒I、II、III型引起的传播广泛且危害极大的急性传染病。临床症状引起肌肉特别是肢体松弛性麻痹，多发生于小儿，因此又称为“小儿麻痹症”。在疫苗问世前，该病在全世界范围内流行，当时我国的发病率为3.18/10万。50年代中后期，美国的两位科学家Dr.Salk和Dr.Sabin先后成功研制出脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)，从而为人类预防和消灭脊髓灰质炎提供了有力武器。实践证明这两种疫苗都是安全有效的。我国从1960年开始生产OPV供全国儿童服用。到目前为止总计供应了40多亿人份的三价OPV，取得了辉煌的成绩。然而，早期制造的IPV由于受到生产工艺的限制，抗原含量低，免疫效果不理想，尤其是随着全世界消灭脊髓灰质炎进程的推进，与OPV相关的病例(VAPP)和由疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(VDPV)而引起的病例正受到人们的关注，如2000年在多美尼加和海地，2001年在菲律宾以及2002年在马达加斯加发生的疫苗衍生株引起的麻痺病例，此外疫苗病毒毒株在免疫缺陷的人体内可长期存在，。为此，一些发达国家开始改变疫苗使用方案，采取先用IPV再用OPV的方案，进而过渡到仅使用IPV的方案，因为只有使用IPV才能避免疫苗相关病例的发生。但采用常规的方法，既不能满足大规模生产的需要，也不能处理大规模生产的病毒液，因此，有必要对现有技术加以改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能处理大规模生产的病毒液，制备出高质量的疫苗，满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗生产需要的方法。
本发明通过下列技术方案实现：一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，其特征在于采用下列工艺步骤：
1、澄清：将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；
2、浓缩：将澄清过的病毒液，用10万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩200～400倍。
3、纯化：
a、凝胶过滤：浓缩的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液；
B、离子交换：凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为纯化的病毒液；
4、除菌过滤：纯化的病毒液用0.22μm的滤膜除菌过滤，之后加入10倍浓缩M199，使病毒液中含有原倍的M199；
5、灭活：在过滤的病毒液中，按终浓度为1/4000加入福尔马林灭活剂，在35-37℃温度下灭活12-14天，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌瓶中，继续灭活至12-14天，转入4℃保存，即为单价半成品。
病毒液在经过步骤3的纯化后，去除了细胞DNA及杂蛋白，使纯度达到要求。
本发明具有以下优点：
1、可大规模处理大量的病毒液，能够满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需求，且生产工艺稳定，重复性好(结果见表1、表2)。
2、用本发明生产的疫苗半成品，无外原因子污染，细胞DNA残留量少，灭活后的半成品经检查无活病毒存在，安全性好，半成品抗原含量高，能够满足成品生产的需要(结果见表3)。
3、用本发明生产的疫苗半成品制备的Sabin IPV成品疫苗，质量稳定可靠，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求(结果见表4)。
4、用本发明生产病毒液制备的疫苗，经25℃和37℃放置两周，以及4℃长期存放后，检测疫苗热稳定性，结果表明该疫苗稳定性良好，其有效期可达两年以上(结果见表5及表6)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
1、澄清：将550升发酵罐培养的病毒液350升，经孔径为0.75μm、0.45μm、0.22μm的三级滤柱过滤澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；
2、浓缩：将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中，用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升；
3、纯化：
A、凝胶过滤：在Phamacia Index70层析柱中，装Sepharose CL-6B层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平，取病毒浓缩液，加入层析柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰(病毒峰)约600毫升；
B、离子交换：在Phamacia Index100层析柱中，装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平，将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集出现的洗脱峰约800毫升，即为纯化的病毒液，层析柱用1mol/L NaCl洗脱，之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用；
4、除菌过滤：先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗，滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中，再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中，之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜，并将滤液同样收集到上述瓶中；
5、灭活：在过滤的病毒液900毫升中，加入10％福尔马林2.25毫升，使福尔马林终浓度为1/4000，放入37℃孵箱中灭活，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌已硅化1000毫升瓶中，继续灭活至12天，转入4℃保存，即为单价半成品。
实施例2
1、澄清：将550升发酵罐培养的病毒液350升，经孔径为1.0μm、0.6μm、0.45μm的三级滤柱过滤澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；
2、浓缩：将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中，用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升；
3、纯化：
A、凝胶过滤：在Phamacia Index70层析柱中，装Sepharose CL-6B层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平，取病毒浓缩液，加入层析柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰(病毒峰)约600毫升；
B、离子交换：在Phamacia Index100层析柱中，装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平，将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集出现的洗脱峰约800毫升，即为纯化的病毒液，层析柱用1mol/L NaCl洗脱，之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用；
4、除菌过滤：先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗，滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中，再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中，之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜，并将滤液同样收集到上述瓶中；
5、灭活：在过滤的病毒液900毫升中，加入10％福尔马林2.25毫升，使福尔马林终浓度为1/4000，放入35℃孵箱中灭活，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌已硅化1000毫升瓶中，继续灭活至14天，转入4℃保存，即为单价半成品。
用与实施例1相同的方法进行了九批生产规模的后处理，结果见表5和表6。
                       表1.九批生产规模澄清及浓缩结果
           0.1病毒收获液           1.1澄清               2.1浓缩      
批号      体         滴度        体        滴度        体积        滴度
          积      (logCCID50    积     (logCCID50    (L)      (logCCID5
SI       350         8.400       360       8.250       1.60       10.400
SI       300         7.850       340       7.800       1.65       9.850
SI       380         8.380       410       8.130       0.90       10.590
SI       353         8.000       404       7.875       1.40       10.000
SI       352         7.750       393       8.625       2.10       10.380
SI       352         8.620       399       8.370       1.15       10.870
SI       358         7.625       409       7.500       1.40       9.500
SI       356         7.870       411       8.120       1.40       10.120
SI       332         7.875       375       7.750       1.75       9.875
             表2.九批生产规模纯化及除菌过滤结果
          3.1凝胶过滤           4.1离子交换           5.1除菌过滤   
批号     体       滴度        体          滴度      体积         滴度
         积     (logCCID50   积       (logCCID50   (L)      (logCCID5
SI       0.62     9.250       0.82        9.250     0.90         9.125
SI       0.61     9.625       0.83        9.625     0.90         9.500
SI       0.62     9.625       0.83        9.500     0.90         9.500
SI       0.62     8.375       0.82        8.250     0.90         8.250
SI       0.62     8.250       0.82        8.250     0.90         8.000
SI       0.65     8.250       0.81        8.250     0.90         8.125
SI       0.62     9.500       0.83        9.125     0.90         9.125
SI       0.63     9.250       0.85        8.875     0.90         8.500
SI       0.62     9.000       0.82        8.500     0.90         8.125
                    表3.六批疫苗半成品检定结果
    项目 SI0110  SI0210  SI0220  SI0220  SI0130  SI02300
对照细胞培   合格   合格   合格   合格   合格   合格
对照细胞血   合格   合格   合格   合格   合格   合格
不同细胞传   合格   合格   合格   合格   合格   合格
鉴别试验   I型   I型   II型   II型   III型   III型
无菌试验   合格   合格   合格   合格   合格   合格
DNA残留量   ＜100   ＜100   ＜100   ＜100   ＜100   ＜100
灭活效果试   合格   合格   合格   合格   合格   合格
D抗原含量   1400   1200   160   160   600   700
               表4.两批Sabin IPV成品检定结果
项目                    SI 20021101                 SI 20021201
外观                   橙红色透明液体             橙红色透明液体
无菌试验                    阴性                       阴性
鉴别试验               Polio I+II+III             Polio I+II+III
DAg含量                I：30   II：32   III：45   I：30   II：32
大白鼠效力试验         通过                       通过
异常毒性试验           通过                       通过
蛋白质含量             ＜10μg/剂量               ＜10μg/剂量
牛血清蛋白残留量       ＜50ng/剂量                ＜50ng/剂量
pH                     7.13                       7.13
        表5 减毒株IPV25℃和37℃和热稳定性试验结果
                    (D抗原回收率％*)
批号           型别    25℃3周    37℃1周    37℃2周
SI001001       I        95          90         75
SI002001       II       100         100        100
SI003001       III      100         95         86
SI001002       I        85          80         53
SI002001       II       100         100        100
SI003002       III      93          93         71
*4℃DAg含量作为100％
                  表6 减毒株IPV4℃稳定性试验结果
                DAgU/剂量             大白鼠效力试验(ED50)
型别
         0月   12月   18月   24月        0月       18月
I        20     20     18     18         2.19      2.08
II       16     16     16     16         1.49      1.12
III      30     30     30     28         1.82      1.67

Claims (1)

1、一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，其特征在于采用下列工艺步骤：
1)、澄清：将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；
2)、浓缩：将澄清过的病毒液，用10万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩200～400倍。
3)、纯化：
a、凝胶过滤：浓缩的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液；
B、离子交换：凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为纯化的病毒液；
4)、除菌过滤：纯化的病毒液用0.22μm的滤膜除菌过滤，之后加入10倍浓缩M199，使病毒液中含有原倍的M199；
5)、灭活：在过滤的病毒液中，按终浓度为1/4000加入福尔马林灭活剂，在35-37℃温度下灭活12-14天，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌瓶中，继续灭活至12-14天，转入4℃保存，即为单价半成品。
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