CN1457884A - 静脉注射人免疫球蛋白的双重病毒灭活/去除方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人血浆蛋白的制备方法，特别是采用双重病毒灭活/去除方法制备静脉注射人免疫球蛋白的制备方法。本发明的人血浆免疫球蛋白的制备方法，以低温乙醇法分离得到的组分II沉淀(F_II)经低pH孵放处理灭活病毒后，采用纳米膜过滤进一步去除病毒。本发明在有效去除病毒的同时不损失IgG的生物活性，使静注免疫球蛋白在临床的使用更加安全，在生产过程中无需增加大量设备投入和厂房改造，同时也不影响产品的收率和质量。

Description

静脉注射人免疫球蛋白的双重病毒灭活/去除方法

技术领域

本发明涉及人血浆蛋白的制备方法，特别是采用双重病毒灭活/去除方法制备静脉注射人免疫球蛋白的制备方法。

背景技术

免疫球蛋白的生产已经有半个多世纪的历史，60年代-80年代初，人们普遍认为经低温乙醇分离制备的免疫球蛋白不传播病毒性疾病。80年代初期随着静注免疫球蛋白(IVIG)的问世，临床上对于原发性或继发性免疫缺陷以及一些自身免疫性疾病的治疗取得了显著效果，IVIG被公认是一种安全有效的制品。然而随着Lane^[1]在1983年对输注IVIG后发生非甲非乙肝炎传播的首次报道后，IVIG的病毒安全性引起了人们的关注。自Lane的报道后，涉及多个国家多个制造厂家的数批IVIG输注后上千例的非甲非乙肝炎传播相继报道^[2-7]。上述现象发生的原因尚不完全清楚，但根据多方报道经IVIG传播病毒性疾病可能与IVIG生产工艺中是否加入特定的病毒灭活/去除方法及其方法的选择有着重要的关系，为此WHO和各国相关权威机构均要求在人免疫球蛋白的生产中必须加入适宜的病毒灭活/去除手段以保证该产品在病毒传播方面的安全性。

血浆蛋白制品生产中常用的病毒灭活方法有加热灭活(如白蛋白的巴氏消毒)和SD灭活方法，由于免疫球蛋白在生物学结构和功能上的特点，上述两种病毒灭活方法易于导致其IgG的聚合和生物活性的损失，因此难以在免疫球蛋白规模化生产中采用，国外同行报道采用加入麦芽糖进行低pH孵放处理用于静注免疫球蛋白病毒灭活取得了很好的效果^[8]，低pH孵放处理对脂包膜病毒有较好的灭活作用，而对非脂包膜病毒(如甲肝病毒和人类细小病毒B19)灭活效果较差。

发明内容

本发明的目的是采用低pH孵放灭活和纳米过滤去除双重方法来弥补单独使用低pH孵放病毒灭活方法的不足。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：以低温乙醇法分离得到的组分II沉淀(F_II)经低pH孵放处理灭活病毒后，采用纳米膜过滤进一步去除病毒。

所述的人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

a、以低温乙醇法分离得到的组分II沉淀(F_II)为原料，用重量比为2-10倍的0-5℃注射用水溶解，0.5-1.0mol/L的盐酸调整pH至3.5-4.5；

b、经30-100KD的超滤膜浓缩、透析至残余乙醇含量≤0.03％，调整蛋白浓度至重量百分比为4.5％-5.0％，pH至3.5-4.5，加入重量百分比为9-11％的麦芽糖作保护剂，除菌过滤后置20-25℃孵放21天；

c、低pH孵放处理后的免疫球蛋白半成品先经纳米膜过滤，再经0.2μm除菌过滤膜过滤，得免疫球蛋白成品。

所述的人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的纳米膜范围为15-35nm。

本发明的有益效果是：将低温乙醇法分离得到的组分II沉淀(F_II)经低pH孵放处理后进行纳米膜过滤，在有效去除病毒的同时不损失IgG的生物活性，使静注免疫球蛋白在临床的使用更加安全。

下面通过本发明的具体实施方式对本发明进一步说明。

具体实施方式

实施例1

第一步低pH孵放处理：取F_II沉淀20千克，用0℃注射用水160升溶解，1mol/L盐酸调整pH至4.0，用板框滤器过滤后，用注射用水、100kD超滤膜浓缩、透析至残余乙醇含量≤0.03％，加入9％麦芽糖，调整蛋白浓度至5.0％，pH至4.2，0.2μm膜除菌过滤分装至10升玻璃瓶内，放置24℃孵放21天，，得免疫球蛋白半成品。

第二步纳米过滤：经低pH孵放处理的免疫球蛋白半成品检定合格后在20-30℃的温度和压力30-100Kpa条件下用35nmBMM膜(日本旭化成)串联0.2μm除菌过滤膜进行过滤，最后分装至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中国生物制品规程》中静脉注射人免疫球蛋白制造和检定规程要求进行全面质量检测，结果见表3。

实施例2

第一步低pH孵放处理：取F_II沉淀25千克，用0℃注射用水200升溶解，1mol/L盐酸调整pH至4.0，用板框滤器过滤后，用注射用水、100kD超滤膜浓缩、透析至残余乙醇含量≤0.03％，加入10％麦芽糖，调整蛋白浓度至5.0％，pH至4.2，0.2μm膜除菌过滤分装至11升玻璃瓶内，放置24℃孵放21天，得免疫球蛋白半成品。

第二步纳米过滤：经低pH孵放处理的免疫球蛋白半成品检定合格后在20-30℃的温度和压力30-100Kpa条件下用25nmBMM膜(日本旭化成)串联0.2μm除菌过滤膜进行过滤，最后分装至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中国生物制品规程》中静脉注射人免疫球蛋白制造和检定规程要求进行全面质量检测，结果见表3。

实施例3

第一步低pH孵放处理：取F_II沉淀22千克，用0℃注射用水176升溶解，1mol/L盐酸调整pH至4.0，用板框滤器过滤后，用注射用水、100kD超滤膜浓缩、透析至残余乙醇含量≤0.03％，加入10％麦芽糖，调整蛋白浓度至4.5％，pH至4.2，0.2μ膜除菌过滤分装至10升玻璃瓶内，放置24℃孵放21天，得免疫球蛋白半成品。

第二步纳米过滤：经低pH孵放处理的免疫球蛋白半成品检定合格后在20-30℃的温度和压力30-100Kpa条件下用15nmBMM膜(日本旭化成)串联0.2μm除菌过滤膜进行过滤，最后分装至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中国生物制品规程》中静脉注射人免疫球蛋白制造和检定规程要求进行全面质量检测，结果见表3。

    表1三批试制产品全检结果(按照中国生物制品规程要求)

   检测项目        实施例1      实施例2       实施例3

   物理外观        合格         合格          合格

   热稳定实验      合格         合格          合格

   PH              4.25         4.20          4.24

   IgG含量g/L      47.20        47.49         48.96

   纯度％          99.05        99.55         99.65

   麦芽糖含量％    97.34        94.30         96.42

   分子大小分布％  99.12        99.20         99.27

   白喉抗体效价    8.47         8.42          8.17

IU/ml

乙肝表面抗体效价    139.63             161.31            158.70

IU/IgG.g

HCV抗体             阴性               阴性              阴性

HIV/1+2抗体         阴性               阴性              阴性

PKA IU/ml           ＜0.58             ＜0.58            ＜0.58

ACA CH50％          23.58              0                 6.09

抗A，抗B            ＜1∶32，＜1∶8    ＜1∶2，＜1∶8    ＜1∶4，＜1∶8

免疫双扩            合格               合格              合格

免疫电泳            合格               合格              合格

无菌实验            合格               合格              合格

热源质实验          合格               合格              合格

小鼠安全实验        合格               合格              合格

豚鼠安全实验        合格               合格              合格

本发明制成的免疫球蛋白成品可分装至50ml装量的符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的玻璃瓶，每瓶1.25g或2.5g。

病毒灭活/去除效果观察：

1.低pH孵放处理

           表2低pH孵放处理对病毒的灭活效果观察灭活时            VSV                   Sindbis V             HIV/1间(天)      (7.5-8.0logTCID50)    (7.98logTCID50/ml)    (5.0logTCID50/ml)

        对照组    试验组      对照组      试验组    对照组      试验组0         6.13      4.00        6.50        5.00      4.3         4.31         5.88      3.00        6.28        2.14      ND          ND3         4.94      ≤-0.50*    6.13        1.96      3.8         1.85         4.32      ≤-0.50     6.12        1.82      ND          ND7         4.33      ≤-0.50     5.95        1.59      2.5         ＜1*10        2.82      ≤-0.50     5.63        1.37      1.9         ＜114        1.50      ≤-0.50     5.42        1.01      ＜1*        ＜121        ≤-0.50   ≤-0.50     5.19        0.00      ＜1         ＜1

*为检测限量，ND：未检测

采用HIV/1、SindbisV、VSV三种病毒为指示病毒，以pH7.0为试验对照组，模拟低pH孵放处理过程，检测残留病毒以验证该方法病毒灭活的效果，结果见表1(检测结果由中国生物制品检定所和中国人民解放军军事医学科学院P3实验室提供)

2.纳米膜过滤

由日本红十字会提供HCV阳性血浆，经35nm BMM(日本旭化成)膜过滤，采用PCR方法检测过滤前后血浆中残留病毒，观察过滤过程对病毒的去除作用。结果见表2(该实验结果由北京生物制品研究所，日本旭化成公司和成都蓉生药业有限责任公司共同提供)

       表3BMM膜对HCV阳性血浆中HCV病毒的去除能力血浆样品                     样品稀释                          残留病   去除

        原倍   10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7   毒       能力原液*                                +     +     -     -       10⁵一次过滤     +     -     -     -                               10⁰两次过滤     -     -     -                                     ＞10⁰    5原液#                                +     +     -     -       10⁵一次过滤     +     +     -     -                               10¹两次过滤     -     -     -                                     ＞10⁰    4

*采用北京生物制品研究所PCR试剂盒检测结果，#采用日本红十字会提供的PCR试剂盒检测结果。

综合上述实验结果得出结论：

a、低pH孵放处理能有效灭活VSV、Sindbis和HIV/1病毒。

b、纳米过滤技术能有效去除HCV阳性血浆中至少4log的HCV病毒。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

参考文献：

1.Yap PL.The viral safety of intravenous immune

      globulin.Clin.Immunol，1996，104(suppl，1)：35

2.Lane RS.Non-A non_B hepatitis from intravenous immuneoglobulin.Lanc-et，1983，ii：974

3.Lever AML，Webster ADB，Brown D，et al.Non-A non-B hepatitisoccurring in agammaglobulinaemic patients after intravenousimmunoglobulin.Lancet，1984，ii：1062

4.Ochs HD.Fischer SF，Virrant FS，et al.Non-A non-B hepatitis afterintravenous immunglobulin.Lancet，1986，i：323

5.Weiland O，Mattson L，Glaumann H.Non-A non B hepatitis afterintravenous gammaglobulin.Lancet，1986，1：976

6.Bjorkander J，Cunningham-Rundles C，Lundin P，et al.Intravenousimmunog-lobulin prophylaxis causing liver damage in 16 of 77 patients withhypogammaglob-ulinaemia of IgG subclass deficiency.Am J Med，1988，84：107

7.Suomela H，Inactivation of virus in blood and plasma products.TransfusionMed Rev，1993，7：42

8.Williams PE.Trasmission of non-A，non-B hepatitis by pH4 treatedintravenous immunoglobulin，Vox Sang，1989，57：15

Claims (5)

1、一种人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：以低温乙醇法分离得到的组分II沉淀(F_II)经低pH孵放处理灭活病毒后，采用纳米膜过滤进一步去除病毒。

2、根据权利要求1所述的人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤

a、以低温乙醇法分离得到的组分II沉淀(F_II)为原料，用重量比为2-10倍的0-5℃注射用水溶解，0.5-1.0mol/L的盐酸调整pH至3.5-4.5；

b、经30-100KD的超滤膜浓缩、透析至残余乙醇含量≤0.03％，调整蛋白浓度至重量百分比为4.5％-5.0％，pH至3.5-4.5，加入重量百分比为9-11％的麦芽糖作保护剂，除菌过滤后置20-25℃孵放21天；

c、低pH孵放处理后的免疫球蛋白半成品先经纳米膜过滤，再经0.2μm除菌过滤膜过滤，得免疫球蛋白成品。

3、根据权利要求1或2所述的人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的纳米膜范围为15-35nm。

4、根据权利要求3所述的人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的纳米膜为35nm。

5、根据权利要求2所述的人血浆免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤c中的免疫球蛋白半成品过滤所需的温度为15-30℃，压力为30-100Kpa。