CN104027800A - 一种人用狂犬病疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种人用狂犬病疫苗的制备方法,解决了现有技术中病毒接种后收获病毒毒力低、产量小的问题,一种人用狂犬病疫苗的制备方法,包括以下步骤:1)生产细胞的复苏、传代,然后将传代的生产细胞置于微载体生物反应器中扩增培养;2)向微载体生物反应器中加入处理液,调整微载体生物反应器的灌流速度为零,清洗生产细胞表面;3)在清洗后的生产细胞上接种狂犬病病毒固定毒株;4)收获病毒液,进行超滤浓缩、灭活;5)分离纯化,本发明细胞在接种病毒前,使用处理液处理细胞,使病毒进入细胞的数量增多,接种病毒后,会大幅度提高病毒产毒量,降低浓缩超滤的倍数。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗领域,特别是指一种人用狂犬病疫苗的制备方法。
背景技术
狂犬病是一种哺乳动物罹患的疾病,主要以犬科动物(犬、狼、狐狸、山犬和豺类动物)、浣熊科动物(浣熊)、麝猫科动物(猫鼬)、臭鼬科动物(臭鼬)和翼手目动物(蝙蝠)作为宿主或携带者。所有的哺乳类动物均对本病易感。
人类感染狂犬病几乎全部继发于动物咬伤或抓伤。病毒吸入、接种未彻底灭活的疫苗或者通过移植感染角膜、组织和器官也有发生。世界大部分人类狂犬病的主要宿主是犬,尽管猫不作为狂犬病病毒的宿主,但也是重要的病毒携带者。狂犬病主要表现为一种急性侵袭性病毒性脑炎,通过暴露于传染性病毒的涎液或其他途径传播,疾病可以从动物传播给动物,或者从动物传播给人类。
狂犬病是由狂犬病毒(RABV)引起的,RABV是高度嗜神经的病毒,它可以引起中枢神经系统(CNS)的急性感染。现有的关于狂犬病的理论知识多数都来源于实验动物模型的工作。动物咬伤是造成狂犬病传播的最主要途径,其病程发展分成几个阶段,包括外周组织内的病毒复制、病毒沿外周神经和脊突向CNS内传播、在CNS中扩散分布、从CNS中向各器官传播(唾液腺)等。
狂犬病一旦出现症状几乎100%死亡,因此,唯一的措施是在被病动物致伤前或致伤后注射狂犬病疫苗。白1885年巴斯德开创脑组织狂犬病疫苗以来,狂犬病疫苗有很大改进和发展。目前狂犬病疫苗生产的通用工艺为:细胞培养→接种病毒→300KD膜包超滤浓缩→分子筛层析纯化→疫苗配制。但是传统的生产工艺存在着以下问题:
(1)大多数工艺采用传代细胞生产,人二倍体细胞疫苗还存在批量较小,难以规模化生产,若生产,规模较小,且产品质量均一性差;
(2)传统生产工艺繁琐,大多采用转瓶培养方式,操作复杂;
(3)细胞接种病毒后,收获病毒毒力低,产量小,需要经过高倍数浓缩后才能进行纯化处理;
(4)传代细胞生产疫苗,高倍数浓缩的样品经传统的纯化方法处理,每次处理的量较少,工作时间长,不能有效去除宿主细胞残余DNA和蛋白,产品合格率低,产量低。
发明内容
本发明提出一种人用狂犬病疫苗的制备方法,解决了现有技术中病毒接种后收获病毒毒力低、产量小的问题。
本发明的技术方案是这样实现的:一种人用狂犬病疫苗的制备方法,包括以下步骤:
1)生产细胞的复苏、传代,然后将传代的生产细胞置于微载体生物反应器中扩增培养;
2)向微载体生物反应器中加入处理液,调整微载体生物反应器的灌流速度为零,清洗生产细胞表面;
3)在清洗后的生产细胞上接种狂犬病病毒固定毒株;
4)收获病毒液,进行超滤浓缩、灭活;
5)分离纯化。
作为优选的技术方案,所述步骤2)中的处理液为含有丁酸钠和硫酸鱼精蛋白溶液的无菌PBS溶液,所述丁酸钠的浓度为0.1~1mmol/l,所述硫酸鱼精蛋白溶液的浓度为80~120μg/ml,所述处理液清洗时间为1~4h,搅拌速度为20~60rpm。
作为优选的技术方案,所述步骤4)中超滤浓缩采用的设备是切向流处理系统。
作为进一步的优选,所述切向流处理系统使用截留分子量为750KD的Quixstand中空纤维柱进行超滤。
作为优选的技术方案,所述步骤5)中分离纯化方法为分子筛复合离子交换层析法,其中填料为Capto core700。
作为优选的技术方案,所述步骤1)中的微载体生物反应器在放入微载体前,先用不含钙离子和镁离子的PBS缓冲液浸泡所述微载体至少3h,然后洗涤所述微载体数分钟,最后在121℃下灭菌。
作为进一步的优选,所述微载体为Cytodex-1、Cytodex-2、Cytodex-3、Cytopore或Cytoline中的一种。
作为进一步的优选,所述微载体为Cytodex-1。
作为优选的技术方案,所述步骤1)中扩增培养的培养基为MEM培养液,且所述MEM培养液中添加了1000~3000mg葡萄糖,并调pH值为7.1~7.4,温度35~37℃,溶解氧为30~60%,搅拌速度20~60rpm,培养时间为2~4天。
作为优选的技术方案,所述生产细胞为Vero细胞、人二倍体细胞、地鼠肾细胞、鸡胚细胞、鸭胚细胞中的任一项,所述狂犬病病毒固定毒株为PV株、巴斯德毒株、Pitman-Moore、CVS、Flury LEP、Flury HEP、Kelev、ERA株中的任一株。
本发明细胞在接种病毒前,使用处理液处理细胞,使病毒进入细胞的数量增多,接种病毒后,会大幅度提高病毒产毒量,降低浓缩超滤的倍数,通过采用切向流超滤,流体流动在过滤介质表面产生剪切力,减少了滤层的堆积,保证了稳定的过滤速度,且采用750KD中空纤维柱过滤,降低纯化时样品的粘度和杂蛋白的量,Capto core700在层析介质中具有大小分离及吸附层析的双重功能,Capto core700设计用于病毒和其它大生物分子的中度纯化和精细纯化步骤,本发明有效去除DNA和宿主蛋白,去除率95%以上,且大大缩短了操作时间,用微载体反应器代替传统的转瓶培养,可用于工业上规模化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明工艺流程图;
图2为实验组与对照组各自进入细胞的病毒量图;
图3为20天的收获期内实验组与对照组病毒滴度状况图;
图4Capto core700柱层析分离狂犬病毒抗原的紫外监测图;
图5Capto core700柱层析分离狂犬病毒抗原的SDS-PAGE(15%)电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如图1所示,一种人用狂犬病疫苗的制备方法,包括以下步骤:
1)生产细胞的复苏、传代,然后将传代的生产细胞置于微载体生物反应器中扩增培养;
2)向微载体生物反应器中加入处理液,调整微载体生物反应器的灌流速度为零,清洗生产细胞表面;
3)在清洗后的生产细胞上接种狂犬病病毒固定毒株;
4)收获病毒液,进行超滤浓缩、灭活;
5)分离纯化。
作为优选的技术方案,所述步骤2)中的处理液为含有丁酸钠和硫酸鱼精蛋白溶液的无菌PBS溶液,所述丁酸钠的浓度为0.1~1mmol/l,所述硫酸鱼精蛋白溶液的浓度为80~120μg/ml,所述处理液清洗时间为1~4h,搅拌速度为20~60rpm。
作为优选的技术方案,所述步骤4)中超滤浓缩采用的设备是切向流处理系统。
作为进一步的优选,所述切向流处理系统使用截留分子量为750KD的Quixstand中空纤维柱进行超滤。
作为优选的技术方案,所述步骤5)中分离纯化方法为分子筛复合离子交换层析法,其中填料为Capto core700。
作为优选的技术方案,所述步骤1)中的微载体生物反应器在放入微载体前,先用不含钙离子和镁离子的PBS缓冲液浸泡所述微载体至少3h,然后洗涤所述微载体数分钟,最后在121℃下灭菌。
作为进一步的优选,所述微载体为Cytodex-1、Cytodex-2、Cytodex-3、Cytopore或Cytoline中的一种。
作为进一步的优选,所述微载体为Cytodex-1。
作为优选的技术方案,所述步骤1)中扩增培养的培养基为MEM培养液,且所述MEM培养液中添加了1000~3000mg葡萄糖,并调pH值为7.1~7.4,温度35~37℃,溶解氧为30~60%,搅拌速度20~60rpm,培养时间为2~4天。
作为优选的技术方案,所述生产细胞为Vero细胞、人二倍体细胞、地鼠肾细胞、鸡胚细胞、鸭胚细胞中的任一项,所述狂犬病病毒固定毒株为PV株、巴斯德毒株、Pitman-Moore、CVS、Flury LEP、Flury HEP、Kelev、ERA株中的任一株。
具体实施例
实验一、病毒培养及收获
实验材料:
细胞:Vero细胞、PV株毒种
培养基:改良MEM液体培养基,即基础MEM培养液加入1000~3000mg/L葡萄糖。
主要设备:生物反应器(BIO-FLO110,NBS)
试验方法:
使用微载体(Cytodex-1)的量是10~20g/L,使用前先用不含钙离子、镁离子PBS缓冲液(每克Cytodex加50~100ml)浸泡至少3小时,然后洗涤微载体数分钟,最后在121℃灭菌。灭菌后的微载体用细胞培养液灌装洗涤后,将Vero细胞(1×106个/ml)接种于生物反应器,设定生物反应器的运行参数:pH值7.1,温度37℃,溶解氧设为40%,搅拌速度30rpm。
3天后细胞增殖进入平台期前,加入处理液,调整灌流速度为零,处理液中丁酸钠的浓度0.5mmol/l,硫酸鱼精蛋白溶液的浓度100μg/ml,设置搅拌速度30rpm处理2个小时。2小时后,采用MEM培养基灌流清洗2个灌流体积,设置搅拌速度35rpm。清洗完毕后,按病毒感染指数0.01MOI接种毒种。培养24小时,将生长液更换为维持液,更换维持液前取样与正常组比较病毒的吸附情况,开始收获病毒液,连续收获病毒液20天。
实验结果:24小时内细胞均贴附于微载体表面,并开始伸展。48小时后,细胞增殖速度加快。第3天细胞基本长满微载体表面,细胞密度达5×107个/ml,细胞进入生长平台期。ELISA方法检测未进入细胞的病毒量,经处理液处理后接种病毒组(实验改进组)病毒进入细胞的量较正常对照组明显增加,增加了71.4%,见附图2,与正常对照组比较,处理改进组收获的病毒滴度明显增加,20天的收获期内病毒滴度普遍提升1个对数单位,见附图3。
实验二、收获液超滤浓缩及灭活
实验材料及样品:
中空纤维滤柱:UFP-750-E-4X2MA,GE
切向流处理系统:Quixstand中空纤维膜分离系统,GE
样品:病毒收获液过0.22μm滤膜除杂,样品量5L。
实验方法:
取5L样品,经750KD的中空纤维浓缩处理,处理过程中进液端压力保持在5~10psi,体积浓缩至1L左右,加入PBS进行低速洗滤,洗滤体积3~5L。收获洗滤后样品加入1/4000β-丙内酯进行灭活处理。
实验结果:经750KD中空纤维柱超滤后的样品与传统工艺300KD膜包处理样品相比,蛋白浓度降低(Lowry法检测蛋白浓度下降大约25%),样品粘度下降。
实验三、狂犬病毒分离纯化
实验材料及样品:
层析柱:XK26×20,GE
紫外检测仪:HD-9707,上海精科
蠕动泵:BT100-2J,保定兰格恒流泵有限公司
填料:Capto core700,GE
样品:超滤浓缩处理后的收获液200ml
将80mlCapto core700介质装入XK26×20层析柱内,用pH7.2的PBS溶液平衡3~5个柱体积。取样品160ml,以8ml/min的流速把该液体通过层析柱,紫外监测蛋白质A280吸收值。然后用pH7.5PBS缓冲液进行连续洗脱,分别收集洗脱液。
实验结果:通过Capto core700可以迅速分离狂犬病毒抗原,紫外监测结果见附图4。将收获的各蛋白峰用SDS-PAGE鉴定,与标准Mark蛋白的电泳图谱对照比较可知,峰1为纯化分离的狂犬病毒抗原,峰2为杂蛋白峰。最终分离纯化的狂犬病毒抗原蛋白纯度在95%以上,检测样品的抗原含量为28IU/ml,见附图5。
实验四、狂犬疫苗的配制
将纯化所得狂犬病毒抗原按以下比例进行配制,每0.5ml(1剂)人用剂量的疫苗包含:
将配制后的样品进行冻干加工,制成成品疫苗。NIH方法检测配制疫苗的效力为6.0IU/剂,符合现行版《中国药典》不低于2.5IU/剂的要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)生产细胞的复苏、传代,然后将传代的生产细胞置于微载体生物反应器中扩增培养;
2)向微载体生物反应器中加入处理液,调整微载体生物反应器的灌流速度为零,清洗生产细胞表面;
3)在清洗后的生产细胞上接种狂犬病病毒固定毒株;
4)收获病毒液,进行超滤浓缩、灭活;
5)分离纯化。
2.如权利要求1所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述步骤2)中的处理液为含有丁酸钠和硫酸鱼精蛋白溶液的无菌PBS溶液,所述丁酸钠的浓度为0.1~1mmol/l,所述硫酸鱼精蛋白溶液的浓度为80~120μg/ml,所述处理液清洗时间为1~4h,搅拌速度为20~60rpm。
3.如权利要求1所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述步骤4)中超滤浓缩采用的设备是切向流处理系统。
4.如权利要求3所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述切向流处理系统使用截留分子量为750KD的Quixstand中空纤维柱进行超滤。
5.如权利要求1所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述步骤5)中分离纯化方法为分子筛复合离子交换层析法,其中填料为Capto core700。
6.如权利要求1所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述步骤1)中的微载体生物反应器在放入微载体前,先用不含钙离子和镁离子的PBS缓冲液浸泡所述微载体至少3h,然后洗涤微载体数分钟,最后在121℃下灭菌。
7.如权利要求6所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述微载体为Cytodex-1、Cytodex-2、Cytodex-3、Cytopore或Cytoline中的一种。
8.如权利要求7所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述微载体为Cytodex-1。
9.如权利要求1所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述步骤1)中扩增培养的培养基为MEM培养液,且所述MEM培养液中添加了1000~3000mg葡萄糖,并调pH值为7.1~7.4,温度35~37℃,溶解氧为30~60%,搅拌速度20~60rpm,培养时间为2~4天。
10.如权利要求1所述的一种人用狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:
所述生产细胞为Vero细胞、人二倍体细胞、地鼠肾细胞、鸡胚细胞、鸭胚细胞中的任一项,所述狂犬病病毒固定毒株为PV株、巴斯德毒株、Pitman-Moore、CVS、Flury LEP、Flury HEP、Kelev、ERA株中的任一株。
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