CN1970080A - 用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；b)当Vero细胞生长至一定密度时，接种病毒，使所述病毒感染细胞；c)使病毒增殖；和d)纯化收获病毒。该方法具有培养的细胞密度高，不使用血清和其他动物来源的蛋白，病毒产量高，生产的疫苗质量好，规模容易放大等优点。

Description

用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法

发明领域

本发明涉及生物工程领域。具体地说，本发明涉及驯化Vero细胞适应无血清培养基悬浮培养，并以此改变Vero细胞的生长方式，提高培养的细胞密度，从而高效生产病毒疫苗的方法。

技术领域

动物细胞一般是在添加有10％的牛血清的培养基中生长，由于动物血清存在以下不可克服的缺点而在生物制品中受到限制：

1)动物血清是外源因子(病毒，细菌，支原体等)的主要来源，目前在很多国家(美国、加拿大、日本等国家)都发现了对人类有高度致病性的疯牛病毒。此外，用目前的检测技术就可以检测到血清中存在十几种病毒，而更多的潜在病毒因为检测水平的限制而未能检测到。

2)因血源的大量减少，导致血清的价格昂贵，增加了生物制品的生产成本。

3)不同批次间的血清质量差异很大，对生物制品的质量稳定性有很大的影响。

4)用血清和其他动物源性蛋白生产的生物制品可能残有血清蛋白，对患者产生蛋白免疫反应。

正因为血清存在上述无法克服的缺点，早在上世纪80年代，国内外细胞培养工作者致力于寻找血清的替代品，也就是研究不含血清的培养基(无血清培养基)来培养细胞。根据无血清培养基的组分，可以分为四类：

1)无血清培养基，该培养基不含血清，但可以含有蛋白，包括动物和植物等来源的蛋白；

2)无蛋白培养基，该培养基不含有任何来源的蛋白，包括基因工程蛋白，但可以含有蛋白水解物；

3)化学成分明确的无血清培养基，该培养基的每种成分是明确的，可以含有蛋白；

4)不含动物源性蛋白的无血清培养基，该培养基可以含有植物来源或基因工程蛋白。

到目前为止，已有数十种满足不同细胞生长的无血清培养基问世和商品化，对于Vero细胞，商品化的无血清培养基有美国SAFC Biosciences公司的EX-CELL^TM Vero细胞无血清培养基，美国Invitrogen公司的Vero细胞无血清培养基等。

可用于生产生物制品的哺乳动物细胞包括CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，HK293细胞(人胚肾细胞)，Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)，杂交瘤细胞等。目前，已有多种重组蛋白和人源化抗体在CHO细胞中获得表达。目前情况下，大多数重组蛋白是在贴壁的CHO细胞中表达的，而人源化抗体则多是在悬浮的CHO细胞中表达的；基因治疗用的腺病毒可以在贴壁的293细胞增殖，也可以在悬浮的293细胞中增殖，而单克隆抗体几乎全部在悬浮的杂交瘤细胞中表达的。然而，就申请人所知，直到目前为止还没有文献报道通过采用悬浮的Vero细胞来生产病毒疫苗。

对于非肿瘤细胞的二倍体细胞(如原代细胞和有限传代细胞)和转化细胞(如无限传代细胞)，细胞在含有血清的培养基中都是贴壁生长的，因为血清中含有促进细胞贴附的因子。例如，血清中含有1-5微克/毫升的纤粘素，因此对体外培养的细胞贴壁具有促进作用；同时，一般在含血清的培养基中含有钙、镁等金属离子，它们也有促进细胞贴附的功能。因此，即使是已经适应无血清培养基的悬浮生长的细胞，其在含血清的培养基中也会再次贴壁生长。

同时，已经适应了某种无血清培养基生长的Vero细胞也很容易在其他的Vero细胞无血清培养基中生长。当Vero细胞在血清中贴壁生长时，细胞必需贴附在基质的表面上才能生长，一旦细胞长成单层，因为细胞间的接触抑制，细胞不再增殖。这样，细胞贴壁生长时的细胞密度取决于贴附基质表面积的大小。对于大多数动物细胞，每平方厘米表面积可以容纳1-5×10⁵个细胞，因此，在方瓶和转瓶培养中，细胞密度一般只能在1-5×10⁶细胞/毫升之间。在采用了微载体或片状载体的生物反应器中，细胞密度可达1-2×10⁷细胞/毫升。

然而，在无血清的培养基中，由于没有促进细胞贴壁的因子和钙镁金属离子存在，细胞经过驯化后可以进行悬浮培养，因此细胞密度取决于培养基的营养程度，因此，理论上讲，只要有足够的营养，细胞密度可以无限大。目前，对于不同的无血清培养基，细胞密度可以达到0.5-1×10⁸细胞/毫升之间(反应器连续培养方式)。

目前国内外生产病毒疫苗(如狂犬病毒疫苗)的方法(无论是转瓶生产方法还是生物反应器生产方法)是：Vero细胞在含有5-10％的牛血清的培养基(DMEM或M199培养基)中贴壁生长，待细胞长满后，去掉含血清的培养基，换上新鲜的不含血清的培养基(DMEM或M99+0.2％的人血白蛋白)或含有低浓度牛血清的培养基(如DMEM或M99+2％的牛血清)维持细胞和病毒增殖，收获培养上清，含病毒的上清经过灭活，纯化后即获得病毒疫苗。因此，在当前的生产工艺中存在以下几个难以克服的缺点：1)由于使用了血清，血清中带来的潜在病毒因子可能使患者感染新的病毒；2)血清是非人体本身的蛋白，残留的血清蛋白对患者有新的免疫反应；3)人血白蛋白也是病毒的来源，如艾滋病毒，对患者带来的不安全比牛血清更大；4)人血白蛋白的来源十分有限，成本很高，是疫苗生产的主要成本。美国FDA(食品与药物管理局)要求本土的制药企业严禁使用含有动物源性蛋白的基质来生产生物制品。

因此，本领域中仍然迫切需要能够进一步改善生产病毒疫苗的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能使细胞密度高、病毒产量高、且疫苗质量好、容易放大的生产病毒疫苗的方法。本发明者通过驯化Vero细胞，使之能在无血清培养基中悬浮生长，从而改变了细胞培养的方式和病毒生产的方法，达到了高密度培养细胞、大规模生产病毒疫苗，显著提高疫苗的产量和质量。

具体而言，本发明提供了一种用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：

a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；

b)当Vero细胞生长至一定密度时，接种病毒，使所述病毒感染细胞；

c)使病毒增殖；

d)纯化收获病毒。

用不含动物源性蛋白的培养基悬浮培养Vero细胞来生产病毒疫苗具有很多的优点：

1)培养基的组成中没有动物源性的蛋白，没有外源因子的污染，培养基的质量稳定，没有批次间的差异，提高产品的质量；

2)用悬浮培养的方式，由于不需要细胞赖以生长的贴附基质，细胞生长不受贴附基质可供细胞生长的表面积的限制，细胞密度远远高于贴壁生长的细胞密度(5-10倍)，单位溶液体积的疫苗效价高，降低疫苗的生产成本；

3)容易放大培养的规模。

当然，用悬浮的细胞生产病毒疫苗不同于贴壁生长的细胞，因为悬浮的细胞被病毒感染的几率减少很多，需要在生产过程中改变反应器的搅拌速度，提高细胞对病毒的敏感性，优化接种病毒的感染倍数(MOI)，同时，还要掌握好接种病毒时细胞的密度。

具体实施方案

用悬浮的Vero细胞来生产病毒疫苗的方法目前国内外尚没有报道。其生产病毒疫苗的细胞培养方式，生产规模和产品质量等优势都是目前传统细胞培养和病毒疫苗生产方式无法匹及的。

以人用狂犬疫苗为例：狂犬病是一种自然疫源性疾病，是由狂犬病引起的所有温血动物都易感染的人兽共患性疾病，一旦发病，100％死亡。据世界卫生组织的统计，每年约有30,000人死于狂犬病。据中国卫生部统计，中国2001年狂犬病人的病死率高达95.88％，高居甲、乙类传染病首位，2006年中国因感染狂犬病毒而死亡的人数达到近400人，居传染病死亡人数之首。研制良好的狂犬疫苗不仅可预防狂犬病，也可治疗狂犬病。中国目前允许生产和销售的狂犬疫苗是以传代的Vero细胞或原代地鼠肾细胞为宿主细胞生产的经过纯化的狂犬疫苗。目前，国内外绝大多数厂家是用转瓶工艺，也有少数厂家用生物反应器来生产Vero细胞狂犬疫苗，并经纯化精制而成。上述转瓶和反应器生产疫苗的方法都是基于相同的生产过程：细胞在含血清的培养基中贴壁生长，待长满后，接种病毒，然后去掉含血清的培养基，换上不含血清(但含有人血白蛋白)培养基(DMEM或M199+人血白蛋白)或含有低浓度血清的培养基(如DMEM+2％牛血清)，收获病毒上清。这些过程都用到血清和人血白蛋白。此外，由于细胞是贴壁培养，细胞需要在一定的基质(如微载体，商品名：Cytodex)，片状载体(商品名：Fibra-CelDisks)上才能生长，受到贴附基质表面积的限制，细胞密度一般只能在0.5-1×10⁷细胞/毫升，反应器生产的病毒的滴度和效价虽然较转瓶生产工艺高出很多，但仍然有限，成本仍然较高，上述两种方法生产的疫苗因为用到血清和人血白蛋白，仍然存在质量安全隐患。

本发明的创新之处，是将Vero细胞进行驯化，使之悬浮生长在无血清培养基中，整个细胞培养和病毒增殖过程中不使用动物源性蛋白；改变Vero细胞的培养方式，由必需贴附在一定的基质上才能生长转变为无需任何贴附基质的悬浮培养，大大提高细胞的密度；容易放大疫苗的生产规模，降低生产成本。由于病毒生产过程中没有使用血清和人血白蛋白，显著提高疫苗的质量，减少疫苗的安全隐患。

具体而言，本发明提供了一种用Vero细胞生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：

a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；

b)当Vero细胞生长至一定密度时，接种病毒，使所述病毒感染细胞；

c)使病毒增殖；

d)纯化收获病毒。

在本发明的方法中，重要的一点是应当选用无血清培养基来进行悬浮培养Vero细胞。如上所述，目前对于无血清培养基可以根据其组分的不同分为四类。它们分别是：1)无血清培养基，该培养基不含血清，但可以含有蛋白，包括动物和植物等来源的蛋白；2)无蛋白培养基，该培养基不含有任何来源的蛋白，包括基因工程蛋白，但可以含有蛋白水解物；3)化学成分明确的无血清培养基，该培养基的每种成分是明确的，可以含有蛋白；4)不含动物源性蛋白的无血清培养基，该培养基可以含有植物来源或基因工程蛋白。本发明所涉及到的“无血清培养基”均是指“不含动物源性蛋白的无血清培养基”，即，该培养基可以含有植物来源(如大豆蛋白水解物)或基因工程重组蛋白(如重组的类胰岛激素)，但是它不含有血清来源的蛋白或其它动物源的蛋白(如人血清白蛋白)，也不含有钙镁离子。

在一个较佳的实施方案中，可选用任何商业上已知适用于培养Vero细胞的无血清培养基，例如是美国SAFC biosciences公司生产的EX-CELL^TM系列Vero细胞无血清培养基、或是美国Invitrogen公司生产的Vero细胞无血清培养基。美国SAFC biosciences公司EX-CELL^TM Vero无血清培养基是专门针对Vero细胞系而开发的无血清培养。该培养基中不含源自动物的组分。培养基中含有植物来源的蛋白水解物以及低含量的重组蛋白，不含有酚红或Pluronic^86(具体信息可参见网站 http://www.safcbiosciences.com)。美国Invitrogen公司生产的Vero细胞无血清培养基例如有OptiPro^TM SFM、VP-SFM、VP-SFMAGT^TM等无血清培养基。然而，应当理解，上述两个商业来源仅仅是例举性的。本领域技术人员完全能够从其它途径或商业来源获得适用于培养Vero细胞的无血清培养基并将其用于实现本发明的目的。

在一些情况下，Vero细胞原先可能是培养或保存在含有血清的培养基中的。在这些情况下，在实施本发明的方法之前，就需要对Vero细胞进行驯化。即，使原先在含血清培养基中培养和生长的Vero细胞先适应在无血清培养基中悬浮生长。

驯化手段是本领域技术人员常规已知的。具体的驯化手段例如包括以下步骤：先用含有血清(例如胎牛血清)的培养基(如DMEM培养基)使Vero细胞复苏并传代几次。然后取处于对数生长期的细胞制成细胞悬液，接种到无菌的摇瓶中。适宜的接种细胞密度为1-5×10⁵细胞/毫升。在较佳的实施方案中，接种细胞密度为2-4×10⁵细胞/毫升。在更佳的实施例中，接种细胞密度为3×10⁵细胞/毫升。摇床的速度为100-500rpm，适宜的速度为200-400rpm，最适宜的速度为300rpm。当细胞密度达到1-5×10⁶细胞/毫升时，细胞传代。在较佳的实施方案中，细胞密度达到2-3×10⁶细胞/毫升时，细胞按1∶3传代。当细胞在无血清培养基中的生长速度与含血清培养基中的速度相近时，就实现了Vero细胞的驯化。驯化时所用的无血清培养基与悬浮培养时所用的无血清培养基可以相同或不同。如本申请实施例中所证实的，已经适应了无血清培养基生长的Vero细胞(即驯化的细胞)很容易适应在其他的Vero细胞无血清培养基中生长。

本发明的方法对于所用的设备、装置或仪器没有特殊要求，其可在各种类型的生物反应器(bioreactor)、转瓶(spinner flask)或滚瓶(roller bottle)中进行。本申请具体实施例中所采用的生物反应器是NBS公司生产的5.0升反应器(Celligen Plus)以及WAVE Biotech公司生产的20L WAVE反应器，但是本领域技术人员在阅读了本说明书的描述后可以预计到，其它生物反应器和其他公司生产的反应器(无论其大小)也能适用于本发明的方法。

在本发明的实施方案中，采用适合在无血清培养基中悬浮生长的Vero细胞作为病毒生产细胞。Vero细胞是广谱宿主细胞，对很多病毒敏感，如接种狂犬病毒后，可生产狂犬疫苗；接种出血热病毒，可生产出血热疫苗；同理，还可生产甲肝病毒疫苗，乙脑病毒疫苗，小儿脊髓灰质炎病毒疫苗等病毒性疫苗。因此预计本发明将广泛应用于上述疫苗以及其他各种病毒疫苗的生产。

因此，在本发明的一个较佳实施方案中，所述病毒疫苗可选自狂犬病毒疫苗、甲肝病毒疫前，出血热病毒疫苗、乙脑病毒疫苗、小儿脊髓灰质炎病毒疫苗等病毒疫苗。更佳的病毒疫苗是狂犬病毒疫苗。

在实施本发明的方法时，首先将在含血清的培养基中贴壁生长的Vero细胞进行驯化，使之可以在无血清培养基中悬浮生长。然后是在上述提及的生物反应器中，采用悬浮培养的方式，将细胞培养至一定密度，然后再接种病毒，使病毒增殖。此处所用的术语“悬浮”具有本领域技术人员通常理解和认可的含义，即，细胞不贴附在任何固体基质上，而是直接悬浮在培养基中。

本发明的方法可进一步分为三个阶段：1)Vero细胞生长阶段、2)病毒感染(接种)阶段；3)病毒增殖和收获阶段。在这三个阶段中所用的培养基都是Vero细胞已经适应生长的无血清培养基，这些无血清培养基组成可相互相同或稍有差别。反应器培养条件(如温度，pH，溶氧)等不难由本领域普通技术人员根据所用的宿主细胞类型以及所生产的病毒疫苗种类来加以确定。然而，其中应注意几点：

首先，对于多数病毒来说，接种病毒和病毒增殖阶段的温度应低于细胞生长阶段的温度，而pH则略高于前阶段的pH。例如，对于用Vero细胞生产狂犬疫苗而言，在宿主细胞生长阶段pH宜为7.0-7.4(较佳的为7.2)，温度宜在36-38℃(较佳为37℃左右)；而在病毒感染阶段和病毒生产阶段，pH宜在7.2-7.6(较佳的为7.3)，温度宜在32-35℃之间(较佳的为34℃)。

其次，接种病毒的时间是影响疫苗产量的主要因素之一。在本发明中，接种病毒时细胞密度宜为3.0-7.0×10⁷细胞/毫升。在一个更佳的实施方案中，接种病毒时的细胞密度为4.0-5.0×10⁷细胞/毫升。在一个特别佳的实施方案中，接种病毒时的细胞密度为每毫升5×10⁷个细胞左右。

第三，接种病毒的量(病毒感染复数(MOI))也是悬浮培养生产病毒中很重要的参数之一。病毒接种量将影响到病毒能否感染细胞，从而影响病毒的产量。本发明中，MOI的适宜值在0.01-1之间，在一个较佳的实例中，MOI＝0.05-0.5之间，在一个更佳的实例中，MOI＝0.1左右。

与贴壁培养不同的是，在悬浮培养方法中，在接种病毒时，搅拌速度也会影响病毒能否感染细胞，从而影响病毒的产量。因此，在病毒感染(接种)阶段，搅拌速度宜保持较低，适宜的搅拌速度是20-60rpm，较佳的实例中，搅拌速度为30-50rpm，在更佳的实例中，搅拌速度为40rpm。而在Vero细胞生长阶段以及病毒增殖阶段，可采用较高的搅拌速度，例如60-100rpm，更佳为70-90rpm。

在采用连续培养的实施方案中，需要不断地补加培养基以保持培养基中的营养成份维持在一定水平之上，例如，在Vero细胞生长阶段，需要维持一定的灌流速度以使培养基中的葡萄糖含量保持在1克以上，较佳为1-2克/升。而在毒感染(接种)阶段，应当确保灌注速度较低，例如，对于5升罐而言，宜在0-5升培养基/天，较佳的低于2升培养基/天，更佳为低于1升培养基/天，最好基本上为0。在病毒感染一定时间(如8-16小时)后，可重新恢复灌注速度到接种病毒前的水平或更高，例如，使培养基中的葡萄糖含量保持在2克以上；对于5升罐而言，可在5-15升培养基/天，较佳的在8-0升培养基/天。当然，本领域技术人员也完全能够理解，也可采用大于15升培养基/天的灌注速度，只是从成本角度考虑不是优选的。然后，病毒开始增殖，就可连续收获培养上清中的病毒。

在一个尤其佳的实施方案中，本发明提供了一种用悬浮Vero细胞生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：

a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；

b)当Vero细胞生长至3.0-7.0×10⁷细胞/毫升时，以0.01-1的感染复数接种病毒，使所述病毒在低灌注速度和低搅拌速度下感染细胞；

c)在比病毒感染时灌注速度和搅拌速度高的灌注速度和搅拌速度下，使病毒增殖；

d)纯化收获病毒。

病毒的收获和纯化可根据本领域技术人员熟知的常规方法，例如层析(HPLC、亲和层析、离子交换层析，凝胶层析等)；超滤；电泳；密度梯度离心；溶剂抽提等方法。病毒的滴度和效价也可用常规手段(如小鼠注射法)来测定，病毒抗原则可以用试剂盒来测定。

本发明方法突出的特点是细胞从复苏开始就是使用无血清培养基，从细胞复苏到病毒收获，整个过程中没有使用血清和其他动物源性的蛋白；细胞在无血清培养基中悬浮培养，无需任何细胞赖以生长的贴附基质。病毒生产过程可以是连续的(如反应器生产方法)，也可以是批式的(如转瓶或滚瓶生产方法)。在连续培养过程中，病毒在宿主细胞(如Vero细胞)中不断增殖并释放到培养上清中，通过蠕动泵排到反应器外；与此同时，另一个蠕动泵则把新鲜培养基加入反应器内，以提供细胞生成和病毒增殖所消耗的营养。批式培养过程则是细胞在容器中生长到高密度后，接种病毒，待细胞被病毒感染死亡后收获所有的病毒上清。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用细胞生物学，微生物学、重组DNA或免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的；或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1 驯化Vero细胞适应Vero细胞无血清培养基的悬浮生长

从细胞库中复苏1支Vero细胞(细胞来源：ATCC CCL-81)，用DMEM培养基加10％FBS(胎牛血清，SAFC公司生产)传代2次。当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止胰蛋白酶的作用，2000rpm离心，去上清。加入无血清培养基(SAFCBiosciences公司的EX-CELL^TM Vero细胞无血清培养基)，把细胞制成细胞悬液，接种到无菌的摇瓶中。每瓶培养基体积50毫升，接种细胞密度为3×10⁵细胞/毫升，摇床速度为300rpm。当细胞密度达到2-3×10⁶细胞/毫升时，细胞按1∶3传代，经过5-6代后，细胞在该无血清培养基中的生长速度与含血清培养基中的速度相近。冻存细胞，建立种子细胞库。需要特别指出的是，已经适应了SAFC Bioscience公司生产的Vero细胞无血清培养基的Vero细胞，在冻存种子库时不再用血清了，而是用50％新鲜的和40％的用过的无血清培养基加10％二甲基亚砜(DMSO)冻存细胞。同样，复苏细胞时用该无血清培养基直接培养就可以了。

实施例2 驯化Vero细胞适应Vero细胞无血清培养基的悬浮生长

用与实施例1相同的方法，从细胞库中复苏1支Vero细胞(细胞来源：ATCC CCL-81)，用DMEM培养基加10％FBS(胎牛血清，SAFC公司生产)传代2次。当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止胰蛋白酶的作用，2000rpm离心，去上清。加入无血清培养基(美国Invitrogen公司的Vero细胞无血清培养基)，把细胞制成细胞悬液，接种到无菌的摇瓶中。每瓶培养基体积50毫升，接种细胞密度为3×10⁵细胞/毫升，摇床速度为300rpm。当细胞密度达到2-3×10⁶细胞/毫升时，细胞按1∶3传代，经过8-10代后，细胞在该无血清培养基中的生长速度与含血清培养基中的速度相近。冻存细胞，建立种子细胞库。

实施例3 驯化Vero细胞适应其他无血清培养基的生长

将实施例1中已经适应无血清培养基生长的Vero细胞直接过渡到另一种无血清培养基(Invitrogen公司生产的Vero细胞无血清培养基)。适应了SAFC Bioscience公司生产的Vero细胞无血清培养基的Vero细胞很容易在Invitrogen公司生产的Vero细胞无血清培养基悬浮生长，而且几乎没有适应期，细胞密度能达到0.5-1.0×10⁷细胞/毫升。相比而言，SAFC Bioscience公司生产的Vero细胞无血清培养基更适合Vero细胞的生长，密度达到1.2×X10⁷细胞/毫升。

实施例4 Vero细胞在Celligen Plus反应器中连续悬浮培养和狂犬病毒疫苗的大规模生产

在本实施例中，采用的主要设备是5.0升生物反应器(商品名：CELLIGEN PLUS^，购自美国NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.，INC.)。总体积5升，工作体积3.5升。该生物反应器采用的搅拌系统是cell-lift搅拌系统，附加有细胞截留系统，培养基可以流出而细胞仍然留在反应器中。

本实施例中所用的培养基是SAFC Bioscience公司生产的Vero细胞无血清培养基。在反应器中，加入3.5升磷酸缓冲液PBS(pH7.44)，121℃消毒60分钟。消毒后，排空磷酸缓冲液。加入SAFC Biosciences公司的EX-CELL^TM Vero细胞无血清培养基，并接种如实施例1所得的种子细胞，在37℃、pH7.2-7.4、溶氧为40-60％、搅拌速度为60-100rpm下进行培养。最大灌流速度为8-10升培养基/天(使培养基中的葡萄糖含量保持在1-2克/升)。

在培养细胞5-8天后，当细胞密度达到3-7×10⁷细胞/毫升时，以0.01-1的感染复数(MOI)接种狂犬病毒。在34℃、pH7.3-7.6、溶氧为40-60％、搅拌速度为20-60rpm下培养6-8小时，此时灌注速度为0，使病毒感染细胞。8小时后搅拌速度提高到60-100rpm，灌注速度恢复到接种病毒前的速度。在病毒感染8小时以后，开始收获含病毒的上清，并用于纯化。病毒滴度可以达到9.5以上，抗原达到20IU/毫升以上，效价达到2.0-5.0IU/毫升。而当前的贴壁培养方法中，病毒的滴度在8.0-9.0之间，抗原在12-15IU/毫升之间，效价在2.0-3.0IU/毫升左右。

实施例5 Vero细胞在WAVE反应器中连续悬浮培养和狂犬病毒疫苗的生产

本实施例中采用的WAVE生物反应器，购自美国WAVE BIOTECH.公司。WAVE反应器不同于其他公司生产的反应器，它的特点是采用一次性的无菌的细胞培养袋，培养的规模(1L-500L)可因选择的培养袋的大小而改变，该培养系统更容易保证无菌的条件。本实施例中选择的培养袋的体积为20L，加入Vero细胞无血清培养基10L，接种细胞密度3-5×10⁵细胞/毫升，培养5-8天后，细胞密度即可达到3-7×10⁷细胞/毫升，接种病毒，6-8小时后恢复接种病毒前的灌注速度，并收获流出的上清用于纯化。病毒滴度可以达到9.0以上，抗原达到15IU/毫升以上，效价达到2.0-4.0IU/毫升。

而当前大多数厂家采用的滚瓶生产狂犬病毒疫苗的方法中，病毒滴度在6.0-7.0之间，抗原在0.01-0.05IU/毫升之间，效价在0.1-0.2IU/毫升。

上面虽然根据一些具体的较佳实施方案对本发明作了详细描述，但应认为，本发明并不局限于这些具体的实施例。本领域技术人员在阅读了上述描述后可在不脱离所附权利要求范围的条件下对本发明作任何改动。

Claims (10)

1.一种用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：

a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；

b)当Vero细胞生长至一定密度时，接种病毒，使所述病毒感染细胞；

c)使病毒增殖；

d)纯化收获病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基选自美国SAFCBiosciences公司的EX-CELLTMVero细胞无血清培养基或美国Invitrogen公司的Vero细胞无血清培养基。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在进行所述步骤a)之前，用所述无血清培养基对Vero细胞进行驯化。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述的病毒选自狂犬病毒、甲肝病毒、出血热病毒、乙脑病毒或小儿脊髓灰质炎病毒。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法在生物反应器、转瓶或滚瓶中进行。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤b)中接种病毒时的Vero细胞密度为3.0-7.0×10⁷细胞/毫升。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤b)中病毒以0.01-1的感染复数进行接种。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤b)在病毒增殖期间维持培养基中葡萄糖含量在1.0-2.0克/升。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，悬浮培养时的搅拌速度为20-60rpm。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；

b)当Vero细胞生长至3.0-7.0×10⁷细胞/毫升时，以0.01-1的感染复数接种病毒，使所述病毒感染细胞；

c)在比病毒感染时灌注速度和搅拌速度高的灌注速度和搅拌速度下，使病毒增殖；

d)纯化收获病毒。