CN110101864A - 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用 - Google Patents

一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110101864A
CN110101864A CN201910472729.1A CN201910472729A CN110101864A CN 110101864 A CN110101864 A CN 110101864A CN 201910472729 A CN201910472729 A CN 201910472729A CN 110101864 A CN110101864 A CN 110101864A
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
free
harvest liquid
protective agent
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910472729.1A
Other languages
English (en)
Inventor
高辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongyi Anke Biotechnology Co Ltd
LIAONING MAOKANGYUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
Zhongyi Anke Biotechnology Co Ltd
LIAONING MAOKANGYUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongyi Anke Biotechnology Co Ltd, LIAONING MAOKANGYUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical Zhongyi Anke Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910472729.1A priority Critical patent/CN110101864A/zh
Publication of CN110101864A publication Critical patent/CN110101864A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用，其中所述狂犬病毒是用无血清培养基生产，生产全过程不含小牛血清或胎牛血清，成分中不含有明胶、水解明胶、右旋糖苷和任何动物来源的外源物质，在保证疫苗稳定性的同时，降低疫苗过敏反应，降低成本，提高疫苗质量，且对无血清培养基生产的狂犬病疫苗纯化后原液或冻干剂型的稳定性，观察表明，本发明提供的保护剂对液体剂型和冻干剂型均可起到对抗原和疫苗效力的保护作用，这说明，含有缓冲液、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、精氨酸、谷氨酸钠的保护剂配方，能使无血清狂犬病疫苗保持稳定。

Description

一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用
技术领域
本发明涉及疫苗制造领域，具体涉及一种无血清人用狂犬病疫苗的制备方 法及其保护剂。
背景技术
无血清人用狂犬病疫苗，由于培养过程不添加任何动物血清，纯化过程也 不添加任何蛋白，纯化后的病毒液总蛋白浓度远低于用牛血清培养系统生产的 疫苗，因此，无血清人用狂犬病疫苗需要保护作用更强，保护剂效果更好的保 护剂保护剂配方。
对于含血清生产的人用疫苗，人血白蛋白、明胶和右旋糖苷是冻干常用保 护剂和保护剂。
人血白蛋白来源于人血浆，是一种经典、优良的稳定剂，尤其是在冻干制 品中，能够对蛋白质的活性起到很好的保护作用。但由于人血白蛋白在疾病治 疗中需求量大，价格居高不下，会提高疫苗成本。同时，人血来源极其复杂， 容易导致污染，如肝炎病毒，艾滋病毒等。
明胶曾广泛用于病毒性疫苗的稳定剂，由动物胶原水解得到，来源于牛、 猪等动物。日本2000年前各种病毒性疫苗中均使用牛源明胶，1993年开始陆 续出现全身性荨麻疹、血管性水肿、喉头水肿、喘鸣等各种过敏反应报告。另 外，来源于牛或猪的明胶具有携带动物源性病毒的潜在危险。病毒侵入可能引 起人的海绵体脑炎等异种病毒传染性疾病。
从2000年开始，国内外开始将右旋糖苷引入疫苗保护剂，用以替代明胶。 但近年来发现，右旋糖苷偶有过敏反应如荨麻疹、皮肤瘙痒、发热、恶心、呕 吐、喘息、关节痛、出血等，极个别的有血压下降、呼吸困难和胸闷，过敏性 休克罕见。
目前市售的人用冻干狂犬病疫苗中，一般均采用上述三种成分作为保护剂。 因此本领域急需开发一种不含以上三种物质的安全、稳定的疫苗配方。
发明内容
本发明要解决的问题是提供了一种适用于无血清培养基生产的安全、稳定 的人用狂犬病疫苗的保护剂，及应用此保护剂的疫苗。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种无血清人用狂犬病 疫苗保护剂，所述保护剂(以质量百分比计)包括：海藻糖0.5％-2％、蔗糖3-7％、 山梨醇0.45-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％、精氨酸或精氨 酸盐0.03％-0.06％，其余为缓冲液。
进一步的，所述缓冲液为磷酸盐或tris缓冲液，所述缓冲液的浓度为 5-30mmol/L，pH为7.0-8.0。
进一步的，所述海藻糖质量与山梨醇质量的比例≥1：1，所述海藻糖质量 与蔗糖质量的比例≥1：6，所述海藻糖与山梨醇的总质量≤蔗糖质量。
无血清人用狂犬病疫苗保护剂制备疫苗的方法，包括如下步骤：
步骤一：首先复苏Vero细胞，然后将复苏后的Vero细胞置于T25瓶内， 3-5天长成致密单层后，用0.25％胰蛋白酶消化，反复吹吸分散细胞，然后将悬 液与无血清培养基以1：6混合分种至新的培养器皿，然后每个T25培养瓶补加 5ml生长液，以此反复传代扩增，直至400平米的反应器，所述反应器培养采 用溶氧60％，搅拌速度40rpm，温度为37℃的连续灌流方式，用狂犬病毒PM株 感染接种所述反应器内培养的Vero细胞，收获培养上清液，得到收获液A；
步骤二：用一次性过滤器对步骤一中得到的收获液A进行澄清过滤处理， 得到收获液B；
步骤三：采用在线连续吸附模式，用离子交换介质吸附层析收获液B中的 病毒，并用中性的0.8mol/L NaCl的tris缓冲液洗脱狂犬病病毒，得到收获液 C；
步骤四：采用琼脂糖凝胶对所述收获液C进行脱盐层析，得到收获液D；
步骤五：脱盐后的收获液D用纯度为99.9％的DNA酶降解，所述DNA酶浓 度为10-150U/ml，摇匀后，置于37℃，静置2h，得到收获液E；
步骤六：将β-丙内酯加入收获液E中，β-丙内酯与收获液E的物质的量 的比为1:4000，并将其放置于2-8℃下，放置40h进行灭活，将灭活后的收获 液E置于37±1℃的水浴锅中水浴2h，每隔0.5h振摇一次，得到收获液F；
步骤七：对超滤系统进行灭菌处理，采用截留分子量为100KD-300KD的 0.1-0.5㎡超滤膜对收获液F进行超滤透析，浓缩收集狂犬病毒，从而得到收 获液G；
步骤八：取纯度分析样品后，将收获液G稀释到保护剂中，配制成半成品。
进一步的，步骤七中，超滤系统的灭菌处理具体为：使用注射用水清洗所 述超滤系统，再用0.5mol/L的NaOH依次进行流洗10min、循环洗10min、静止 浸泡2h。
进一步的，步骤三中，洗脱过程中上样和洗脱流速：260cm/hr，柱耐压上 限为0.3MPa；平衡液为10mmol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液。
进一步的，步骤七中，超滤后的细胞残余DNA≤100pg/剂，细胞宿主蛋白 ≤1μg/剂，病毒抗原浓度＞20IU/ml。
进一步的，步骤八中，将所述半成品分装成0.4ml/支，然后进行冷冻干燥： 在-45℃下预冻，在-35℃条件下进行一次升华，在40℃条件下进行二次干燥。
进一步的，步骤六中，所述收获液F中无β-丙内酯成分。
进一步的，病毒抗原含量≥1IU/剂，疫苗效价≥2.5IU/剂。
与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：
1.本发明提供的一种无血清人用狂犬病疫苗的制备方法及其保护剂，其中 所述狂犬病毒是用无血清培养基生产，生产全过程不含小牛血清或胎牛血清， 组成不含有明胶或水解明胶和右旋糖苷，和任何动物来源的外源物质，在保证 疫苗稳定性的同时，降低疫苗过敏反应，降低成本，提高疫苗质量。
2.本发明提供的无血清人用狂犬病疫苗保护剂能使纯化并灭活的狂犬病毒 保持稳定，尤其较高温度下的稳定性，对无血清培养基生产的狂犬病疫苗纯化 后原液或冻干剂型的稳定性观察表明，发明的保护剂对液体剂型对冻干剂型均 可起到抗原和效力的保护作用。这说明，含有缓冲液、麦芽糖、海藻糖、山梨 醇、精氨酸、谷氨酸钠的保护剂配方，能使无血清狂犬病疫苗保持稳定，尤其 保持了狂犬病疫苗的热稳定性。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述。
实施例1：
保护剂包括以下重量百分数的组分：海藻糖2％、蔗糖5％、山梨醇0.75％、 尿素0.42％、谷氨酸钠0.2％、精氨酸0.05％，Tris缓冲液20mmol/L，用10N的 盐酸调pH值至7.4。
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一：首先复苏Vero细胞，然后将复苏后的Vero细胞置于T25瓶内， 加入VA无血清培养基培养Vero细胞，5天长成致密单层后，用0.25％胰蛋白酶 消化，反复吹吸分散细胞，然后将悬液与无血清培养基以1：6混合分种至新的 培养器皿，然后每个T25培养瓶补加5ml生长液，以此反复传代扩增，直至400 平米的反应器，反应器培养采用溶氧60％，搅拌速度40rpm，温度为37℃的连 续灌流方式，用MOI为0.005的狂犬病毒PM株感染接种反应器内培养的Vero 细胞，收获培养上清液，得到收获液A；
步骤二：用一次性过滤器对步骤一中得到的收获液A进行澄清过滤处理， 得到收获液B；
步骤三：采用在线连续吸附模式，用DEAE离子交换介质吸附层析收获液B 中的病毒，并用中性的0.8mol/L NaCl的tris缓冲液洗脱狂犬病病毒，洗脱过 程中上样和洗脱流速为260cm/hr，柱耐压上限为0.3MPa；平衡液为 10mmol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液，得到收获液C；
步骤四：采用sepharose4FF对收获液C进行脱盐层析，得到收获液D；
步骤五：脱盐后的收获液D用纯度为99.9％的DNA酶降解，DNA酶浓度为 10-150U/ml，摇匀后，置于37℃，静置2h，得到收获液E；
步骤六：将β-丙内酯加入收获液E中，β-丙内酯与收获液E的物质的量 的比为1:4000，并将其放置于8℃下，放置40h进行灭活，将灭活后的收获液 E置于37℃的水浴锅中水浴2h，每隔0.5h振摇一次，得到收获液F；
步骤七：对超滤系统进行灭菌处理，使用注射用水清洗超滤系统，再用 0.5mol/L的NaOH流洗10min，循环洗10min，然后静止浸泡2h，然后采用截留 分子量为100KD的0.1㎡超滤膜对收获液F进行超滤透析，浓缩至抗原浓度为 40IU/ml，从而得到收获液G；
步骤八：取纯度分析样品后，将收获液G与二倍浓度的保护剂等体积混合 摇匀，配制成半成品。
实施例2：
无血清人用狂犬病疫苗保护剂组分同实施例1
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一-步骤七同实施例1；
步骤八：取纯度分析样品后，使用保护剂将收获液G稀释到5IU/ml混合摇 匀，配制成半成品。
实施例3：
保护剂包括以下重量百分数的组分：海藻糖2％、蔗糖4％、山梨醇0.75％、 尿素0.5％、谷氨酸钠0.2％、精氨酸0.05％，磷酸盐缓冲液10mmol/L，用10N的 盐酸调pH值至7.4。
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一-步骤七同实施例1；
步骤八：取纯度分析样品后，使用保护剂将收获液G稀释到4IU/ml混合摇 匀，配制成半成品。
实施例4：
无血清人用狂犬病疫苗保护剂组分同实施例3。
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一-步骤七同实施例1；
步骤八：取纯度分析样品后，使用保护剂将收获液G稀释到5IU/ml混合摇 匀，配制成半成品。
实施例5：
无血清人用狂犬病疫苗保护剂组分同实施例3。
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一-步骤七同实施例1；
步骤八：取纯度分析样品后，使用保护剂将收获液G稀释到6IU/ml混合摇 匀，配制成半成品。
实施例6：
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一-步骤七同实施例1；
步骤八：取纯度分析样品后，使用15mmol/L tris-HCl/0.3mol/L氯化钠 溶液与收获液G等体积混合，配制成半成品。
实施例7：
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一-步骤七同实施例1；
步骤八：取纯度分析样品后，使用4％海藻糖的15mmol/L tris-HCl与收获 液G等体积混合，配制成半成品。
实施例8：
无血清人用狂犬病疫苗的制备方法：
步骤一-步骤七同实施例1；
步骤八：取纯度分析样品后，使用4％海藻糖的15mmol/L tris-HCl将收获 液G稀释到5IU/ml左右，配制成半成品。
实施例9
对本发明的实施例1-8制得的无血清人用狂犬病疫苗和保护剂的性能进行 测试。
本发明所述的Vero细胞来自WHO生产用参考细胞库，生产用毒株为狂犬病 毒PM株，狂犬病毒PM株为现有广泛使用的生产型毒株，细胞培养采用GIBCO 生产的VP-SF或天津文慧生产VW无血清培养基。
1.抗原测定方法：采用双抗体夹心法，用抗狂犬病毒糖蛋白单抗包板，捕 获病毒后，再与另一株辣根过氧化物酶标记的抗狂犬病毒糖蛋白单抗结合。以 中检院发放的狂犬病疫苗参考品做标准曲线，计算供试品的相对抗原效价。
取实施例1、实施例6和实施例7进行对比，分别放置在-70℃、2-8℃、 37℃，测定纯化后原液中病毒随时间推移后抗原的稳定性，结果见表1、表2 和表3。
表1：三种配方保护剂在37℃稳定性(抗原IU/ml)
时间(天) 0 1 2
实施例6 18.51 2.24 1.25
实施例7 19.25 16.33 6.97
实施例1 19.38 21.05 19.66
由表1可以看出，在37℃下，实施例1的保护剂能使纯化并灭活的狂犬病 毒保持稳定，实施例1中的稳定性较好，而实施例6的稳定性在第一天内就下 降明显，实施例7的稳定性在第二天内下降的幅度较大，由表1可得，仅有蔗 糖保护剂，在液体剂型下不足以有效保护纯化的病毒在较高温度下的稳定性， 本发明提供的保护剂在37℃的情况下能够较好的保护纯化的病毒的稳定性。
表2：三种配方保护剂在2-8℃稳定性(抗原IU/ml)
时间(周) 0 1 2
实施例6 18.51 12.24 4.25
实施例7 19.25 16.33 12.97
实施例1 19.38 18.96 20.11
由表2可以看出，在2-8℃下，实施例1的保护剂能使纯化并灭活的狂犬 病毒保持稳定，实施例1中的稳定性较好，而实施例6的稳定性在第一周有所 下降，在第二周内下降明显，实施例7的稳定性在两周之内均匀下降，由表2 可得，由于温度下降，实施例6和实施例7的稳定性较37℃更好，但与实施例 1相比，实施例6与实施例7的稳定性依旧下降明显，而本发明提供的保护剂 在2-8℃的情况下能够较好的保护纯化的病毒的稳定性。
表3：三种配方保护剂在-70℃稳定性(抗原IU/ml)
时间(月) 0 1 2
实施例6 18.51 10.31 6.99
实施例7 19.25 20.89 20.05
实施例1 19.38 21.45 20.97
由表3可以看出，在-70℃下，实施例1的保护剂能使纯化并灭活的狂犬病 毒保持稳定，实施例1中的稳定性较好，而实施例6的稳定性依旧下降明显， 而实施例7由于温度下降稳定性较为稳定，由表3可得，由于温度下降，实施 例7和实施例1的稳定性较好，但与实施例1相比，实施例6稳定性依旧下降 明显。
以上结果表明，实施例1的保护剂能使纯化并灭活的狂犬病毒保持稳定， 尤其较高温度下的稳定性。同时说明，仅有蔗糖保护剂，在液体剂型下不足以 有效保护纯化的病毒在较高温度下保持稳定。
2.应用本保护剂的疫苗与海藻糖缓冲液疫苗冻干后的稳定性
取实施例2和实施例8进行对比，将实施例2和实施例8分装至2ml西林 瓶内，0.4ml/支，进行冷冻干燥，冷冻干燥程序：隔板预冷至4℃，放入西林 瓶，预冻：-50℃，一次干燥温度：-50至-15℃，二次干燥温度：-15℃至25 ℃，结果见表4-表9。
表4：冻干制品外观及水分
外观 水分％ pH
实施例8 略有萎缩 1.06 7.41
实施例2 白色疏松体 0.98 7.44
由表4可以看出，实施例2在冻干之后呈现为白色疏松的固体，而实施例8则呈现略有萎缩的白色固体，而实施例2和实施例8中的水分和pH差别不大。
表5：冻干前后抗原回收率
由表5可以看出，实施例2在冻干前后基本没有抗原的损失，损失仅为0.7 ％，而实施例8中冻干前后的抗原损失较大，达到36.3％，可见实施例2的保 护剂能够有效的对抗原进行保护，有效减少冻干之后的抗原损失。
表6：冻干制品在37℃稳定性(抗原IU/ml)
时间(周) 0 2 4
实施例8 2.65 1.52 0.98
实施例2 4.19 4.26 4.18
由表6可以看出，在37℃下，实施例2的保护剂能使纯化并灭活的狂犬病 毒保持稳定，实施例2中的稳定性较好，而实施例8的稳定性较差且在2周内 稳定性就下降明显，由表6可得，本发明提供的保护剂在37℃的情况下能够较 好的保护冻干剂型下的纯化的病毒的稳定性。
表7：二种配方保护剂在2-8℃稳定性(抗原IU/ml)
时间(月) 0 6 12
实施例8 2.65 2.47 2.39
实施例2 4.19 4.46 4.35
由表7可以看出，在2-8℃下，实施例2的保护剂能使纯化并灭活的狂犬 病毒保持稳定，实施例2中的稳定性较好，而实施例8也能保持较好的稳定性。
表8：冻干制品在37℃稳定性(NIH效价IU/剂)
时间(周) 0 2 4
实施例8 4.20 1.46 0.78
实施例2 6.12 10.25 7.33
由表8可以看出，在37℃下，实施例2的冻干制品能够在两周以内稳定的 刺激机体产生抗体，再两周之后，抗体逐渐流失，但依旧是保持的较好的稳定 性，而实施例8中的稳定性较差，很难实现刺激机体产生抗体的效果。
表9：冻干制品在2-8℃稳定性(NIH效价IU/剂)
时间(月) 0 6 12
实施例8 4.20 3.59 2.11
实施例2 6.12 5.88 10.26
由表9可以看出，在2-8℃下，实施例2的冻干制品能够在12个月的时候 才能稳定的刺激机体产生抗体，而实施例8中的稳定性较差，很难实现刺激机 体产生抗体的效果。
3.不同浓度保护剂对冻干疫苗稳定性的影响
取实施例3-5进行对比，将实施例3-5分装至2ml西林瓶内，0.4ml/支， 进行冷冻干燥，冷冻干燥程序隔板预冷至4℃，放入西林瓶，将隔板预冻至-40℃ 以下，开始第一次干燥，第一次生化在-25℃以内完成，第二次干燥在40℃以 内完成。将冻干制品分别放置在37℃、25℃和2-8℃，观察产品外观、水分及 效力稳定性。结果见表10-表18。
表10：冻干制品在37℃外观稳定性观察
时间(月) 0 1 3 6
实施例3 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
实施例4 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
实施例5 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
由表10可以看出，在37℃下，实施例3-5的冻干制品，在6个月内外观 均无明显变化，可见本发明提供的保护剂能够有效的对冻干剂型的成品进行保 护。
表11：冻干制品在37℃水分稳定性观察(水分％)
时间(月) 0 1 3 6
实施例3 1.02 0.96 0.89 0.93
实施例4 0.98 1.01 0.96 0.86
实施例5 0.88 0.96 0.87 0.91
由表11可以看出，在37℃下，实施例3-5的冻干制品，在6个月内水分 变化不大，可见本发明提供的保护剂能够有效的对冻干剂型的成品进行保护。
表12：冻干制品在37℃效力稳定性(NIH效价IU/剂)
时间(月) 0 1 3 6
实施例3 3.88 4.56 3.27 6.45
实施例4 5.86 6.78 4.25 3.01
实施例5 8.38 6.77 8.45 10.38
由表12可以看出，在37℃下，实施例3的冻干制品，是由小鼠腹腔免疫 和攻击法测得的，该方法误差比较大，每次测定上下浮动是正常现象，所以实 施例3-5的效力整体稳定，依然在合格范围内(不低于2.5IU/剂)。
表13：冻干制品在25℃外观稳定性观察
时间(月) 0 1 3 6
实施例3 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
实施例4 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
实施例5 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
由表13可以看出，在25℃下，实施例3-5的冻干制品，在6个月内外观 均无明显变化，可见本发明提供的保护剂能够有效的对冻干剂型的成品进行保 护。
表14：冻干制品在25℃水分稳定性观察(水分％)
时间(月) 0 1 3 6
实施例3 1.02 1.12 0.97 0.91
实施例4 0.98 0.88 0.94 1.12
实施例5 0.88 0.99 1.02 1.04
由表14可以看出，在25℃下，实施例3-5的冻干制品，在6个月内水分 变化不大，可见本发明提供的保护剂能够有效的对冻干剂型的成品进行保护。
表15：冻干制品在25℃效力稳定性(NIH效价IU/剂)
时间(月) 0 1 3 6
实施例3 3.11 5.44 2.98 4.28
实施例4 5.86 7.86 3.73 6.27
实施例5 8.38 10.27 6.45 7.76
由表15可以看出，在25℃下，是由小鼠腹腔免疫和攻击法测得的，该方 法误差比较大，每次测定上下浮动是正常现象，所以实施例3-5的效力整体稳 定，依然在合格范围内(不低于2.5IU/剂)。
表16：冻干制品在2-8℃外观稳定性观察
时间(月) 0 6 12 24
实施例3 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
实施例4 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
实施例5 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体 白色酥松体
由表16可以看出，在2-8℃下，实施例3-5的冻干制品，在6个月内外观 均无明显变化，可见本发明提供的保护剂能够有效的对冻干剂型的成品进行保 护。
表17：冻干制品在2-8℃水分稳定性观察(水分％)
时间(月) 0 6 12 24
实施例3 1.02 1.14 1.07 1.20
实施例4 0.98 1.04 1.07 1.13
实施例5 0.88 0.91 0.79 0.94
由表17可以看出，在2-8℃下，实施例3-5的冻干制品，在6个月内水分 变化不大，可见本发明提供的保护剂能够有效的对冻干剂型的成品进行保护。
表18：冻干制品在2-8℃效力稳定性(NIH效价IU/剂)
时间(月) 0 6 12 24
实施例3 3.11 4.35 6.17 3.34
实施例4 5.86 6.87 8.44 4.16
实施例5 8.38 9.26 10.33 5.94
由表18可以看出，在2-8℃下，是由小鼠腹腔免疫和攻击法测得的，该方 法误差比较大，每次测定上下浮动是正常现象，所以实施例3-5的效力整体稳 定，依然在合格范围内(不低于2.5IU/剂)。
结论：表10至表18总结了三批冻干制品在不同温度下的稳定性检查结果。 配方的优势在于，可以保护病毒在25℃和37℃保持稳定，虽然到6个月时，效 价有下降趋势，但依然在合格范围内(不低于2.5IU/剂)。
对无血清培养基生产的狂犬病疫苗纯化后原液或冻干剂型的稳定性观察表 明，发明的保护剂对液体剂型对冻干剂型均可起到抗原和效力的保护作用。这 说明，含有缓冲液、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、精氨酸、谷氨酸钠的保护剂配 方，能使无血清狂犬病疫苗保持稳定，尤其保持了狂犬病疫苗的热稳定性。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实 施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变 化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清人用狂犬病疫苗保护剂，其特征在于：所述保护剂(以质量百分比计)包括：海藻糖0.5％-2％、蔗糖3-7％、山梨醇0.45-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％、精氨酸或精氨酸盐0.03％-0.06％，其余为缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种无血清人用狂犬病疫苗保护剂，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐或tris缓冲液，所述缓冲液的浓度为5-30mmol/L，pH为7.0-8.0。
3.根据权利要求1所述的一种无血清人用狂犬病疫苗保护剂，其特征在于：所述海藻糖质量与山梨醇质量的比例≥1：1，所述海藻糖质量与蔗糖质量的比例≥1：6，所述海藻糖与山梨醇的总质量≤蔗糖质量。
4.应用权利要求1-3任一所述无血清人用狂犬病疫苗保护剂制备疫苗的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：首先复苏Vero细胞，然后将复苏后的Vero细胞置于T25瓶内，3-5天长成致密单层后，用0.25％胰蛋白酶消化，反复吹吸分散细胞，然后将悬液与无血清培养基以1：6混合分种至新的培养器皿，然后每个T25培养瓶补加5ml生长液，以此反复传代扩增，直至400平米的反应器，所述反应器培养采用溶氧60％，搅拌速度40rpm，温度为37℃的连续灌流方式，用狂犬病毒PM株感染接种所述反应器内培养的Vero细胞，收获培养上清液，得到收获液A；
步骤二：用一次性过滤器对步骤一中得到的收获液A进行澄清过滤处理，得到收获液B；
步骤三：采用在线连续吸附模式，用离子交换介质吸附层析收获液B中的病毒，并用中性的0.8mol/L NaCl的tris缓冲液洗脱狂犬病病毒，得到收获液C；
步骤四：采用琼脂糖凝胶对所述收获液C进行脱盐层析，得到收获液D；
步骤五：脱盐后的收获液D用纯度为99.9％的DNA酶降解，所述DNA酶浓度为10-150U/ml，摇匀后，置于37℃，静置2h，得到收获液E；
步骤六：将β-丙内酯加入收获液E中，β-丙内酯与收获液E的物质的量的比为1:4000，并将其放置于2-8℃下，放置40h进行灭活，将灭活后的收获液E置于37±1℃的水浴锅中水浴2h，每隔0.5h振摇一次，得到收获液F；
步骤七：对超滤系统进行灭菌处理，采用截留分子量为100KD-300KD的0.1-0.5㎡超滤膜对收获液F进行超滤透析，浓缩收集狂犬病毒，从而得到收获液G；
步骤八：取纯度分析样品后，将收获液G稀释到保护剂中，配制成半成品。
5.根据权利要求4所述的无血清人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤七中，超滤系统的灭菌处理具体为：使用注射用水清洗所述超滤系统，再用0.5mol/L的NaOH依次进行流洗10min、循环洗10min、静止浸泡2h。
6.根据权利要求5所述的无血清人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤三中，洗脱过程中上样和洗脱流速：260cm/hr，柱耐压上限为0.3MPa；平衡液为10mmol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液。
7.根据权利要求5所述的无血清人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤七中，超滤后的细胞残余DNA≤100pg/剂，细胞宿主蛋白≤1μg/剂，病毒抗原浓度＞20IU/ml。
8.根据权利要求5所述的无血清人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤八中，将所述半成品分装成0.4ml/支，然后进行冷冻干燥：在-45℃下预冻，在-35℃条件下进行一次升华，在40℃条件下进行二次干燥。
9.根据权利要求5所述的无血清人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤六中，所述收获液F中无β-丙内酯成分。
10.根据权利要求9所述的无血清人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：病毒抗原含量≥1IU/剂，疫苗效价≥2.5IU/剂。
CN201910472729.1A 2019-05-31 2019-05-31 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用 Pending CN110101864A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910472729.1A CN110101864A (zh) 2019-05-31 2019-05-31 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910472729.1A CN110101864A (zh) 2019-05-31 2019-05-31 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110101864A true CN110101864A (zh) 2019-08-09

Family

ID=67493532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910472729.1A Pending CN110101864A (zh) 2019-05-31 2019-05-31 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110101864A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112023057A (zh) * 2020-10-21 2020-12-04 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 疫苗保护剂
CN112195149A (zh) * 2020-10-20 2021-01-08 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种制备人用狂犬病疫苗的方法
CN112245394A (zh) * 2020-10-21 2021-01-22 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种疫苗保护剂
CN115040656A (zh) * 2022-07-05 2022-09-13 吉林惠康生物药业有限公司 狂犬疫苗冻干保护剂、应用和疫苗及其制备方法
CN115948311A (zh) * 2022-09-26 2023-04-11 天津科技大学 一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN118086578A (zh) * 2024-04-28 2024-05-28 鲁东大学 小麦生物节律钟基因TaPRR59-B1的分子标记及其应用

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1214938A (zh) * 1998-10-19 1999-04-28 卫生部长春生物制品研究所 冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其保护剂
CN1966076A (zh) * 2006-11-14 2007-05-23 广州市嘉合生物技术有限公司 大规模生产狂犬病疫苗的方法
CN1970080A (zh) * 2006-12-04 2007-05-30 上海乔南生泰科学仪器有限公司 用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法
CN101259269A (zh) * 2008-04-23 2008-09-10 长春生物制品研究所 冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗及其生产方法
CN101537186A (zh) * 2009-04-30 2009-09-23 长春百克生物科技有限公司 一种不含明胶的疫苗冻干保护剂
CN104117070A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 辽宁茂康源生物科技有限公司 一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂
CN104188923A (zh) * 2014-08-25 2014-12-10 北京合康源生物科技有限公司 一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法
CN104258404A (zh) * 2014-09-11 2015-01-07 长春长生生物科技股份有限公司 疫苗冻干保护剂、冻干水痘减毒活疫苗及其制备方法
CN104548110A (zh) * 2015-01-10 2015-04-29 浙江卫信生物药业有限公司 一种无明胶和人血白蛋白成分的腮苗冻保剂
CN104826101A (zh) * 2015-05-12 2015-08-12 长春长生生物科技股份有限公司 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法
CN105267971A (zh) * 2014-08-13 2016-01-27 科兴（大连）疫苗技术有限公司 一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗冻干保护剂
CN106668867A (zh) * 2016-12-31 2017-05-17 科兴（大连）疫苗技术有限公司 一种不含明胶和人血白蛋白的腮腺炎疫苗冻干保护剂
CN106834239A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1214938A (zh) * 1998-10-19 1999-04-28 卫生部长春生物制品研究所 冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其保护剂
CN1966076A (zh) * 2006-11-14 2007-05-23 广州市嘉合生物技术有限公司 大规模生产狂犬病疫苗的方法
CN1970080A (zh) * 2006-12-04 2007-05-30 上海乔南生泰科学仪器有限公司 用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法
CN101259269A (zh) * 2008-04-23 2008-09-10 长春生物制品研究所 冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗及其生产方法
CN101537186A (zh) * 2009-04-30 2009-09-23 长春百克生物科技有限公司 一种不含明胶的疫苗冻干保护剂
CN104117070A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 辽宁茂康源生物科技有限公司 一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂
CN105267971A (zh) * 2014-08-13 2016-01-27 科兴（大连）疫苗技术有限公司 一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗冻干保护剂
CN104188923A (zh) * 2014-08-25 2014-12-10 北京合康源生物科技有限公司 一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法
CN104258404A (zh) * 2014-09-11 2015-01-07 长春长生生物科技股份有限公司 疫苗冻干保护剂、冻干水痘减毒活疫苗及其制备方法
CN104548110A (zh) * 2015-01-10 2015-04-29 浙江卫信生物药业有限公司 一种无明胶和人血白蛋白成分的腮苗冻保剂
CN104826101A (zh) * 2015-05-12 2015-08-12 长春长生生物科技股份有限公司 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法
CN106668867A (zh) * 2016-12-31 2017-05-17 科兴（大连）疫苗技术有限公司 一种不含明胶和人血白蛋白的腮腺炎疫苗冻干保护剂
CN106834239A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘志磊等: ""关于病毒类减毒活疫苗去除明胶的思考及建议"", 《中国生物制品学杂志》 *
国家药典委员会: "人用狂犬病疫苗", 《中华人民共和国药典 三部 注释》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195149A (zh) * 2020-10-20 2021-01-08 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种制备人用狂犬病疫苗的方法
CN112195149B (zh) * 2020-10-20 2022-05-17 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种制备人用狂犬病疫苗的方法
CN112023057A (zh) * 2020-10-21 2020-12-04 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 疫苗保护剂
CN112245394A (zh) * 2020-10-21 2021-01-22 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种疫苗保护剂
CN112245394B (zh) * 2020-10-21 2022-10-11 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种疫苗保护剂
CN115040656A (zh) * 2022-07-05 2022-09-13 吉林惠康生物药业有限公司 狂犬疫苗冻干保护剂、应用和疫苗及其制备方法
CN115040656B (zh) * 2022-07-05 2024-04-26 吉林惠康生物药业有限公司 狂犬疫苗冻干保护剂、应用和疫苗及其制备方法
CN115948311A (zh) * 2022-09-26 2023-04-11 天津科技大学 一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN118086578A (zh) * 2024-04-28 2024-05-28 鲁东大学 小麦生物节律钟基因TaPRR59-B1的分子标记及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110101864A (zh) 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用
AU2010304898B2 (en) Stabilising excipient for inactivated whole-virus vaccines
AU2014338520B2 (en) A viral vaccine and methods of manufacture thereof
ES2558430T3 (es) Medio de crecimiento para Clostridium histolyticum sin ingredientes de fuentes de mamífero
CN107312799A (zh) 慢病毒载体冻存保护液及其制备方法和应用
CN102178945B (zh) 一种石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的制备方法
ES2389775T3 (es) Producción y purificación de la proteína A sin emplear componentes de origen animal
EP1793852A1 (en) Inactivated poliomyelitis vaccine derived from sabin strain of polio virus
CN102631672B (zh) 一种冻干灭活乙型脑炎疫苗
CN103160458A (zh) 一种适合Vero细胞生长的低血清培养基
CN110257344A (zh) 无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法
CN106668867B (zh) 一种不含明胶和人血白蛋白的腮腺炎疫苗冻干保护剂
CN108452298A (zh) 一种用spf鸡胚细胞生产黄热病减毒活疫苗的工艺
CN105462916A (zh) 一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法
JPH06234659A (ja) 安定化生ワクチン
TW201416372A (zh) 辛酸鹽病毒去活化作用
TWI593702B (zh) 純化由細胞培養而來的ａｌｐｈａ蛋白酶抑制劑
CN107432931B (zh) 一种微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法
CN110923289B (zh) 一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法
JPH04290900A (ja) 低温殺菌された鉄不含ヒトトランスフェリンの調製方法およびその使用
JP5827948B2 (ja) ウイルスを単離する方法
TW202216736A (zh) 用於生產水痘帶狀皰疹病毒之表面蛋白抗原的方法
CN110585439B (zh) 一种改良型的冻干甲型肝炎减毒活疫苗稳定剂、疫苗半成品、疫苗成品及其制备方法
CN104383550A (zh) 一种狂犬疫苗稳定剂及其应用
CN105296438A (zh) 一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination