TWI593702B - 純化由細胞培養而來的alpha蛋白酶抑制劑 - Google Patents
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Description
本發明係說明用於純化由人類重組體細胞培養而來的alpha1-蛋白酶抑制劑(recA1PI)及用該recA1PI蛋白質共同純化去除有色物種的方法。
Alpha1-蛋白酶抑制劑(於本文中縮寫為A1PI;亦稱為alpha-1蛋白酶抑制劑、alpha-1 PI、A1PI、α-1 PI、α1PI、alpha-1胰蛋白酶抑制劑、alpha1抗胰蛋白酶、alpha-1抗胰蛋白酶、alpha1AT、A1A,且尤其是A1AT、AAT),係為人類中之主要的絲胺酸蛋白酶抑制劑(絲平(serpin))。A1PI係以具有殘基1-24之418個胺基酸蛋白質表現為信號肽。該成熟蛋白質,係由殘基25-418所組成,為具有分子量約51kD之單鏈醣蛋白。參見圖1。雖然A1PI不含任何雙硫鍵,但該蛋白質為具有80%胺基酸屬於8個已清楚定義之α-螺旋物及3個大的β-薄片中之經高度結構化者。三種門冬醯胺連接之碳水化合物係於Asn 70、Asn 107及Asn 271上發現(以全長蛋白質為編號)。此導致具有等電點於4.0至5.0範圍內之多重A1PI異構物(isoform)。該聚醣單糖包括N-乙醯葡糖胺、甘露糖、半乳糖、岩藻糖,及唾液酸。
A1PI之正常血漿濃度係自1.3至3.5毫克/毫升範圍。A1PI係藉由保護細胞免受涉及凝血及發炎之蛋白酶而作用。A1PI抑制胰蛋白酶,胰凝乳
蛋白酶,多種形式之彈性蛋白酶,皮膚膠原酶,腎素,尿激酶,且尤其,多型核淋巴球之蛋白酶。A1PI係作為偽基底用於此等蛋白酶,其係藉著將殘基Met 358-Ser 359之間的鍵裂解形成A1PI-蛋白酶複合物而攻擊該A1PI分子之反應中心環(殘基Gly 368-Lys 392)。該複合物係快速地由血液循環中除去。A1PI內因性角色的其中之一係調節嗜中性粒細胞彈性蛋白酶之活性,其破壞外來蛋白質且傷害存在於肺中之原有組織。於沒有足夠量之A1PI的情況中,該彈性蛋白酶會破壞肺組織,其將隨著時間而導致慢性肺組織損傷及肺氣腫。
A1PI經常由血漿純化。參見,例如,美國專利案號6,284,874;6,462,180;6,093,804;7,879,800;及例如,WO 1998/000154;WO 2002/048176;WO 2010/009388。此外,重組體A1PI(recA1PI)可由多種來源表現及純化。參見,例如,美國專利案號4,931,373及5,134,119;美國專利申請公開案號US 2004/0124143及US 2007/0218535;PCT公開案號WO 2005/047323及WO 2010/127939;及亞契帕德等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5178-5182(1990);頼特等人,Nat.Biotechnology 9:830(1991)。
本文中係說明用於表現及純化人類重組體,細胞培養而來的A1PI用於治療用途之方法。於純化後,該A1PI溶液具有黃色或琥珀色,其可能引起醫生及/或病患反感。本文中亦說明減低顯色的方法。
於本文中說明之一個具體例為,於含有由細胞培養而來的ALPHA1蛋白酶抑制劑(recA1PI)之溶液中減低著色劑量的方法,其包括將含有recA1PI之溶液與還原劑培育,且將recA1PI由該著色劑
中分離。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為半胱胺酸或DTT。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為半胱胺酸。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為由約1mM至約100mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為約10mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為約1mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原培育步驟係進行由約1至約24小時之時間。
於本文所說明之一些方面中,該還原培育步驟係於溫度由約2℃至約60℃進行。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為10mM半胱胺酸且該培育係於約室溫過夜進行。
於本文所說明之一些方面中,該recA1PI由該著色劑中分離係包括色層分離法。
於本文所說明之一些方面中,該色層分離法包括離子交換、疏水交互作用、凝膠過濾、親和性、免疫親和性,或其組合。
於本文所說明之一些方面中,該方法包括降低該鐵濃度。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度減少(亦即,降低)2至100倍。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度減少(亦即,降低)5至50倍。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度為10μM或更低。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度為1μM或更低。
於本文中說明之另一個具體例為,由含有recA1PI之水溶液中
純化由細胞培養而來之人類A1PI的方法,其包括:(a)於含有recA1PI之溶液上進行病毒去活化步驟;(b)將該病毒去活化之溶液通過陰離子交換劑使recA1PI結合於該離子交換劑;(c)由該陰離子交換樹脂洗提recA1PI以得到含有recA1PI之陰離子交換洗出液;(d)添加還原劑至含有recA1PI之陰離子交換洗提混合物中以得到還原性溶液;(e)培育該還原性溶液;(f)將該還原性溶液通過疏水交互作用色層分離(HIC)樹脂使得recA1PI結合於該HIC樹脂;及(g)由該HIC樹脂洗提recA1PI以得到含有recA1PI之HIC洗出液。
於本文所說明之一些方面中,該病毒去活化包括溶劑/清潔劑培育。
於本文所說明之一些方面中,該溶劑係以0.01%至約0.5%之範圍添加。
於本文所說明之一些方面中,該清潔劑係以每體積該產生之混合物添加由約0.5%至約2.0重量%。
於本文所說明之一些方面中,該溶劑/清潔劑培育包括於pH約8且溫度約30℃添加約0.5%聚山梨醇酯20及約0.03%三(正丁基磷酸酯)。
於本文所說明之一些方面中,該陰離子交換劑為季銨樹脂。
於本文所說明之一些方面中,該季銨樹脂為卡普多(Capto)TM Q。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為半胱胺酸(Cys)、半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤鮮醇(DTE)、殼胱甘肽(GSH)、2-巰基乙醇(2-ME)、2-巰基乙胺(2-MEA)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、草酸、甲酸、抗壞血酸、菸草醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、菸草醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)或其組合物。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為半胱胺酸或DTT。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為半胱胺酸。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為由約1mM至100mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為約10mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為約1mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原培育步驟係進行約1至24小時。
於本文所說明之一些方面中,該還原培育步驟係由約2℃至60℃進行。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為10mM半胱胺酸且該培育係於約室溫過夜進行。
於本文所說明之一些方面中,該HIC樹脂為辛基瓊脂糖凝膠(Sepharose)TM或卡普多(Capto)TM辛基。
於本文所說明之一些方面中,該方法包括降低該鐵濃度。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度減少(亦即,降低)2至100倍。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度減少(亦即,降低)5至50倍。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度為10μM或更低。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度為1μM或更低。
於本文所說明之另一個具體例為,純化由細胞培養而來的ALPHA1蛋白酶抑制劑(recA1PI)之方法,其包括將含有recA1PI之溶液與還原劑培育且該recA1PI由該還原劑及被還原物種中分離。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為半胱胺酸或DTT。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為半胱胺酸。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為由約1mM至約100mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為約10mM。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑濃度為約1mM。
於本文所說明之一些方面中,該培育步驟係進行由約1至約24小時之時間。
於本文所說明之一些方面中,該培育步驟係於溫度由約2℃至約60℃進行。
於本文所說明之一些方面中,該還原劑為約10mM半胱胺酸且該培育係於約室溫過夜進行。
於本文所說明之一些方面中,該recA1PI由該還原劑及被還原物種中分離係包括色層分離法。
於本文所說明之一些方面中,該色層分離法包括離子交換、疏水交互作用、凝膠過濾、親和性、免疫親和性,或其組合。
於本文所說明之一些方面中,該被還原物種係包括鐵。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度減少(亦即,降低)2至100倍。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度減少(亦即,降低)5至50倍。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度為10μM或更低。
於本文所說明之一些方面中,該鐵濃度為1μM或更低。
本發明係關於用於純化重組體,由細胞培養而來的alpha1-蛋白酶抑制劑及用該recA1PI蛋白質共同純化去除有色物種之方法。
於本文所說明之一個方面為含有recA1PI之水溶液中純化重組
體、細胞培養而來之人類A1PI的方法。
於本文中所說明之另一個方法為,降低重組體,細胞培養而來的A1PI之溶液顯色的方法,其包括將該recA1PI溶液與還原劑培育並將該recA1PI由還原劑及該有色物種中分離。
於本文中所說明之另一個方法為純化重組體,由細胞培養而來的A1PI之方法,其包括將recA1PI溶液與還原劑培育並將該recA1PI由該還原劑及被還原物種中分離。
圖1係闡明人類A1PI之主要序列及顯著的修改位點。
圖2係顯示用於純化recA1PI導致黃色純化溶液之純化過程流程圖。
圖3係顯示recA1PI樣品藉由免疫親和色層分離法(亦即,ATT選擇樹脂,GE醫療保健生命科學)純化之色層譜。
圖4係顯示recA1PI樣品藉由免疫親和色層分離法(亦即,ATT選擇樹脂,GE醫療保健生命科學)純化之UV-Vis光譜。
圖5係顯示recA1PI樣品藉由凝膠過濾(亦即,尺寸排阻)色層分離法,使用SuperdexTM 200預備等級樹脂(GE醫療保健生命科學)純化之色層譜。
圖6係顯示recA1PI樣品藉由凝膠過濾(亦即,尺寸排阻)色層分離法,使用SuperdexTM 200預備等級樹脂(GE醫療保健生命科學)純化之UV-Vis光譜。
圖7係顯示人類重組體,具有黃色之細胞培養而來的A1PI之三個樣品的UV-Vis光譜。樣品1含有4M胍氫氯化物(Gdn.HCl);樣品2含有50mM二硫蘇糖醇(DTT);樣品3含有4M Gdn.HCl及50mM DTT二者。
圖8係顯示以50mM DTT處理recA1PI且然後藉凝膠過濾色層分離法純化之色層譜。
圖9係顯示未經DTT處理之recA1PI且然後藉凝膠過濾色層分離法純化之色層譜。
圖10係顯示以50mM DTT處理recA1PI、recA1PI及高度純化之由血漿而來的A1PI的樣品的UV-Vis光譜。
圖11係顯示recA1PI、以50mM DTT處理之recA1PI及用10mM DTT處理之recA1PI的樣品的UV-Vis光譜。
圖12係顯示含有50mM DTT於PBS中之凝膠過濾色層分離法運轉的色層譜。
圖13係顯示於PBS中,以50mM DTT處理recA1PI之凝膠過濾色層分離法運轉的色層譜。
圖14係顯示以10mM DTT處理純化之由血漿而來之A1PI之凝膠過濾色層分離法運轉的色層譜。
圖15係顯示以10mM半胱胺酸處理recA1PI之凝膠過濾色層分離法管柱的色層譜。
圖16係顯示修訂之recA1PI純化過程包括半胱胺酸培育步驟之流程圖。
需要注意的是半胱胺酸培育可於該過程中之其他步驟,如於疏水交互作用色層分離法後或於通過陽離子交換膜後(黑體箭頭)進行。
圖17係顯示未經半胱胺酸處理之recA1PI於辛基瓊脂糖凝膠(Octyl Sepharose)TM上之疏水交互作用色層分離法的色層譜。
圖18係顯示以10mM半胱胺酸處理後之recA1PI於辛基瓊脂糖凝膠TM上之疏水交互作用色層分離法的色層譜。
圖19係顯示recA1PI、用10mM半胱胺酸處理之recA1PI或高度純化之由血漿而來的A1PI的UV-Vis光譜。
重組體人類A1PI之表現係藉培養含有構建用於表現糖化人類recA1PI之pAATopST3質體的人類PER.C6®細胞(克魯塞爾公司,萊頓,荷蘭)而開始。此等細胞能夠產生高產量之糖化recA1PI,亦即,每天每個細胞多至22微微克recA1PI(pcd)。該PER.C6®/recA1PI培養係採取經由一系列按比例放大之步驟,經由具有目標操作容積150升之10升振動生物反應器及200升生物反應器而進行。於13-14天後,將含有recA1PI之培養上清液採收,以6,000rpm於塞樂斯(Celeros)離心機(塞樂斯分離公司,Foxboro,MA)中離心,接著於純化前過濾。
該細胞培養過程係以含有構建用於表現糖化人類recA1PI之pAATopST3質體的PER.C6®(克魯塞爾公司)人類細胞之離心管解凍而開始。該人類重組體alpha1蛋白酶抑制劑選殖,表現之說明及該表現之重組體A1PI之分析係說明於WO 2010/127939及美國專利申請案號13/138,912中,其係併入本文中作為參考用於此等教示。於該細胞之小瓶解凍後,將該細胞轉移至125毫升平底搖瓶且為了0.5×106±0.1×106細胞/毫升之目標活細胞密度,將CDM4PERMAbTM基礎培養基之最終體積成為15-25毫升(海克隆公司)。將該125毫升搖瓶(Passage #1)以90rpm,36.5℃,5.0% CO2,培育達96±4小時。然後將該細胞轉移至具有目標體積100毫升及活細胞密度0.5×106±0.1×106細胞/毫升之250毫升平底搖瓶。將該250毫升平底搖瓶(Passage #2),以125rpm,36.5℃,5.0% CO2,培育達72至96小時(±4小時)。然後將該細
胞轉移至具有目標體積250毫升及活細胞密度為0.5×106±0.1×106細胞/毫升之500毫升平底搖瓶。將該500毫升平底搖瓶(Passage #3),以125rpm,36.5℃,5.0% CO2,培育達72至96小時(±4小時)。然後將該細胞轉移至具有目標體積600毫升及活細胞密度0.5×106±0.1×106細胞/毫升之1升平底搖瓶。將該1升平底搖瓶(Passage #4),以125rpm,36.5℃,5.0% CO2,培育達72至96小時(±4小時)。
將來自於1升搖瓶之體積轉移至20/50EH WaveTM生物反應器上之10升細胞袋(Cellbag)®中(GE醫療保健生命科學),以達到3.0-4.0升之操作體積及0.5×106±0.1×106細胞/毫升之活細胞密度。將該10升細胞袋®,以25rpm,搖動角度7°,空氣流動速率每分鐘0.2升(lpm),36.5℃,及3.0% CO2,操作達72至96小時(±4小時)。將來自於10升細胞袋之體積轉移至20/50EH振動生物反應器上之50升細胞袋®中,以達到22-25升之操作體積及0.5×106±0.1×106細胞/毫升之活細胞密度。將該50升細胞袋®以22rpm,搖動角度7°,空氣流動速率0.3 lpm,36.5℃,及3.0% CO2,操作達72至96小時(±4小時)。
將該50升細胞袋®之內容物經由無菌KleenpakTM連接器(Xcellerex,Marlborough,MA)轉移至該Xcellerex 200升生物反應器中。該200升生物反應器應含有最小量(100升)之CDM4PERMAbTM基礎培養基(海克隆公司)且於添加接種體前,可於36.5℃,120rpm,pH於7.2±0.4之範圍中操作。於活細胞密度為0.6×106細胞/毫升±0.1×106細胞/毫升時,該目標操作體積為150升。該pH之死區(dead band)(信號
範圍不發生作用的區域)為7.2±0.4且該溶解氧設定值為50%。該pH係藉由添加1N碳酸鈉或CO2氣體而維持。於96小時(±4小時)時,將等於0.3%起始操作體積之PerMABTM進料介質(海克隆公司)以每日巨丸粒加至該生物反應器中;將該進料介質以100-300毫升/分鐘之流動速率添加。於運轉時,將該進料介質維持於室溫且予以覆蓋以避免任何光降解。於該運轉開始時,將防沫劑以12ppm加入且以小的增量添加以保持泡沫程度於該生物反應器中為2英吋或更低。於308-340小時(12.8-14.2天)時,將該200升生物反應器收穫。
將來自於該200升生物反應器之物料,以流動速率0.5 lpm,及離心速度6,000rpm(塞樂斯分離,Foxboro,MA)轉移至Celeros APD-75 1升碗中。該固體百分比值係於轉移之前予以計算,以測量該碗出料所需的數目(該1升碗可容納1公斤固態物)。將該離心液(centrate)(離心作用後之澄清溶液)轉移至含有二個1.1米2 A1HC濾器以1 lpm(EMD密里波爾公司,Billerica,MA)之Millipore Pilot POD支架。深度-過濾後,將該物料通過0.5/0.2微米Millipore SHC濾器過濾。
純化recA1PI係以三小時溶劑/清潔劑處理用於病毒去活化而開始。然後將該recA1PI捕捉且由卡普多TM Q管柱洗提(GE醫療保健生命科學,Piscataway,紐澤西)。次日,繼續於辛基瓊脂糖凝膠TM管柱上進行純化。將該HIC洗出液予以超濾且透析過濾使能夠進行S-膜純
化,接著藉由奈米過濾以額外清除病毒。將該物料緩衝交換至該最終配製物緩衝液中且將該蛋白質濃度調整以製造配製之主體。
將經深度過濾之細胞培養上清液稱量,讀取該A280,且取出等份量以供採樣。用於該病毒去活化步驟之溫度及pH設定值為28℃±2℃及pH 7.8±0.2。用於該處理之TNBP/聚山梨醇酯20之100-×儲備液,係藉混合0.5公斤聚山梨醇酯20,0.06公斤三-(正丁基)磷酸酯(TNBP)而製備,且水用於注射(WFI)以製成1升的混合物。將該儲備液以100倍稀釋加至該細胞培養上清液且將該處理以攪拌進行達2.5小時。該最終濃度為0.5%於聚山梨醇酯20且0.03%於該TNBP。於該TNBP/聚山梨醇酯20處理後,將該細胞培養上清液過濾。
將Cuno 120ZA過濾碟片(3M,聖保羅,明尼蘇達州)用注射用熱水(HWFI)以不超過1升L/分鐘沖洗達至少10分鐘。接著用不少於2升之注射用冷水(CWFI)沖洗且最後以20psi空氣乾燥。使用空氣壓力不低於20psi且流量不大於1升/分鐘,將TNBP/聚山梨醇酯20處理之細胞培養上清液通過該過濾器。取出等份量以供採樣且保留。
此步驟係用於捕捉recA1PI及去除於通過流量中之寄主細胞蛋白質(HCPs)。其係使用30厘米內徑×14厘米基座高度管柱(10升基座體積)。將TNBP/聚山梨醇酯20處理之細胞培養上清液之pH調回至7.0±0.1。將溶劑/清潔劑處理之上清液之導電率於管柱裝載之前予以測定。
將週遭WFI稀釋劑的數量予以測定,以確保用管線內稀釋裝載管柱時,該導電率不高於4mS/cm。
該獨角獸(Unicorn)程式(GE醫療保健生命科學)係用於運轉該卡普多TM Q柱(GE醫療保健生命科學)且該色層分離法系統之入口線係放置在適當的緩衝槽中。將Durapore 0.3微米於管線中之濾器(密里波爾公司)於每一次色層分離法時予以更換。將該卡普多TM Q管柱用1管柱體積(CV)之0.5M冰醋酸預先平衡,接著用5 CV之20mM Na2HPO4,pH 6.0予以平衡。將該細胞培養上清液以注射用水(WFI)藉管線內稀釋裝載於卡普多TM Q管柱上。該色層分離法滑道係經程式設計,以導電率不超過4mS/cm,以300厘米/小時之線性流動速率來執行該裝載。該加載接著用WFI短暫追踨。將該管柱於用2 CV,20mM Na2HPO4,pH 6.0再平衡之前,用8 CV清洗緩衝液(20mM Na2HPO4,20mM NaCl pH 6.0)予以清洗。洗提係使用8 CV梯度於25mM Na2HPO4,200mM NaCl,pH 7.0中結束或藉逐步增加NaCl濃度來完成。將recA1PI之單一洗提峰收集於4 CV開始進入梯度且收集以0.10 AU之UV-監視選通(watch gate)結束。將該洗提餾份採樣用於試驗且保留。將L-半胱胺酸以10mM之濃度加至該洗出液池中且於室溫混合過夜。
將45厘米內徑×9厘米基座高度管柱(15升基座體積)辛基瓊脂糖凝膠TM 4 FF疏水交互作用色層分離法(HIC)管柱(GE醫療保健生命科學)用8 CV之HIC平衡緩衝液(25mM Na2HPO4,0.1M NaCl,1.75M硫酸銨,pH 7.0)予以平衡。將含有A1PI及半胱胺酸之卡普多Q洗出液用該辛基稀釋緩衝劑(25mM Na2HPO4,0.1M NaCl,3 M(NH4)2SO4,pH 7.0),藉由管線內稀釋,以150厘米/小時之流動速率裝載,以於該
加載物料中達到1.75M(NH4)2SO4之最終濃度。於加載後,將該管柱用5 CV之HIC平衡緩衝液清洗。洗提係用逆鹽梯度由1.75M硫酸銨於該清洗緩衝液中至該洗提緩衝液(20mM Na2HPO4,pH 6.0)超過10 CV而完成。UV吸光度監視命令於前面上之0.05 AU及於尾巴上之0.10 AU係用來收集該洗出液池。
將3個30kDa分子量切斷(MWCO)之0.1米2膜用WFI於40-50℃沖洗,直到滲透物及滯留物之pH於5及7之間。將進料壓力設定至目標25psig(例如,24至28之範圍),而出口壓力設定至5psig(例如,4至8psig之範圍)。將該系統用1-2升之HIC洗提緩衝液予以平衡不少於10分鐘。將該HIC洗出液混合且該溫度保持在15-25℃。將該滲透體積予以監測且當該濃度達到30之A280目標時該UF停止。於該進料之體積減少後,用6體積倍數(DV)之陽離子平衡緩衝液(10mM檸檬酸鈉,pH 5.4)進行透析過濾。檢查該滯留物之A280以確保其為30且將該滯留物倒入乾淨的容器中。將二個1-升體積之陽離子平衡緩衝液,每一個用10-15psig之進料壓力再循環達不少於5分鐘。將該沖洗物與該滯留物合併。
將具有2500厘米2膜表面積之薩多賓(Sartobind)® S-膜單次用膠囊(薩多利斯公司,哥廷根,德國)用該陽離子平衡緩衝液(10mM檸檬酸鈉二水合物,pH 5.4)予以平衡,確保該流出物之導電率不超過4mS/cm。將UF/DF處理之HIC洗出液使用蠕動泵以25升/小時加載於該S-膜上且隨即用陽離子平衡緩衝液清洗直到A280不超過0.1 AU。將
該通過的流量收集且調整至pH 7.0±0.1。
奈米過濾係使用具有維雷索(Viresolve)®預濾器(0.11米2)之維雷索® NFP(0.085米2;密里波爾公司)進行。過濾係藉壓力可於不超過50psi之恆壓進行。將該奈米過濾器用四份500毫升體積之陽離子平衡緩衝液沖洗。
將具有0.3米2膜面積之10kDa MWCO膜用於該步驟中。將該支架及膜用WFI於40-50℃清洗直到該滲透及滯留物之pH於5及7之間。將該進料壓力設定至目標25psig(24至28psi之範圍),而該出口壓力設定至5psig(4至8psi之範圍)。將該系統用1-2升之20mM Na2HPO4,pH 7.0予以平衡達不少於10分鐘。將該奈米濾出物充分混合且該溫度保持在15-25℃。將該滲透物定期藉由測定其於280nm之吸光度(亦即,A280)應為<0.04來檢查recA1PI之損失。若該值超過,則停止該UF/DF。將該滲透體積予以監測且當該濃度達到~30之A280目標時停止該UF。於該進料之體積減少後,用5 DV透析過濾緩衝液(20mM Na2HPO4,120mM NaCl,pH 7.0)進行透析過濾。檢查該滯留物之A280以確保其為30且將該滯留物倒入乾淨的容器中。計算該透析過濾緩衝液沖洗之量,當其加至該滯留物時,其將導致最終濃度為50-56毫克/毫升。將該沖洗液體積分成兩半且將各體積用不超過20psig之進料壓力再循環達3-5分鐘。將該沖洗物與該滯留物合併。
將濃縮之大量重組體A1PI經殺菌過濾至Flexel®袋(薩多利斯公司)中且於最終裝填之前儲存於-70℃。
由上述之方法所產生之recA1PI被發現具有顯著的黃色。該黃色種類之身分為未知。雖然該recA1PI為高度純且活性者,但為了美觀的理由想要除去該黃色之著色劑。
A1PI-特定之免疫親和管柱係為了確定是否該黃色種類可由該純化之recA1PI中分離而進行。將特定用於由血漿而來的H1PI之Alpha-1抗胰蛋白酶選擇樹脂(AAT-選;GE醫療保健生命科學)之1.6厘米內徑×10厘米基座高度管柱(20毫升管柱體積)予以填充。將該管柱用20mM Tris.HCl,pH 7.4予以平衡。將約200毫克以10毫克/毫升之recA1PI以5毫升/分鐘加載於該管柱中。將該管柱用20mM Tris.HCl,pH 7.4,100mM NaCl清洗且用20mM Tris.HCl,pH 7.4,2M NaCl洗提(參見圖3)。餾份係根據最大分餾而收集。將該洗提峰下之餾份集中且使用Amicon UltraCelTM 30kDa MWCO濃縮器(EMD密里波爾公司,Billerica,MA)予以濃縮。UV-Vis光譜係由該濃縮之樣品中取得。
該洗出液,於濃縮作用後,為明顯的黃色。當藉由UV-Vis光譜(參見圖4)分析時,該光譜非常類似於進行免疫親和管柱運轉前所看到之於recA1PI者。由該結果得到之結論是,以免疫親和色層分離法由recA1PI分離黃顏色係無效的。
凝膠過濾法實驗(aka尺寸排阻色層分離法;SEC)亦試圖由recA1PI去除黃色種類。將SuperdexTM 200預備等級樹脂之1.6厘米內徑x 90厘米管柱(基座體積181毫升)予以填充(GE醫療保健生命科學)。將該管柱用磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS;12mM磷酸鹽,pH 7.4,137mM NaCl,2.7mM KCl)予以平衡。將recA1PI加載至該管柱體積之5%(9毫升)且以2毫升/分鐘(60厘米/小時)運轉。將12毫升體積之餾份收集用於分析。
該管柱之色層譜係顯示於圖5中。雖然,該負載為99% recA1PI,但觀察到分裂峰,可能係由於該UV偵測器飽和。於此峰下之餾份係藉UV-Vis分光光度法來分析(圖6)。該recA1P餾份為明顯的黃色且此等餾份係類似於該加載物料。因此,該凝膠過濾管柱並未由recA1PI中去除黃色。
因為免疫親和及凝膠過濾色層分離法未能成功地由recA1PI除去黃色,而尋找變性劑及/或還原劑用作為潛在的方式用來去除或減少黃色。
將約1毫升之recA1PI與8M胍氫氯化物或500mM DTT混合以達到最終濃度分別為4M胍氫氯化物或50mM DTT。將第三種樣品與二試劑混合。將該樣品培育於50℃達約2小時,且分別通過PD-10去鹽柱(GE醫療保健生命科學)。將通過此等管柱之流量藉由1,000×克離心達5分鐘來收集。
胍氫氯化物於降低上沒有幫助,且此反映在該樣品之UV-Vis光譜中(圖7)。該50mM DTT處理之樣品,與胍氫氯化物處理之樣品相較
時,為較淡的黃色。該樣品於405nm並未具有用於特性上觀察該recA1PI之光譜特徴(圖7)。用胍及DTT之組合物所處理之樣品幾乎為無色且消失於300-400nm範圍內之光譜特性中。該胍氫氯化物及該DTT二者皆需要減少黃色之事實,表示該黃色之有色物種係共價鍵結合至recA1PI。
另外的實驗係於該DTT還原作用及凝膠過濾色層分離法用PD-10管柱完成後接續進行。本文之目標係使用較長的管柱以達到DTT所處理之樣品的離析更好且處理更大量被還原之recA1PI用來分析。
準備SuperdexTM 200預備等級樹脂(GE醫療保健生命科學)之1.6厘米內徑x 90厘米基座高度管柱(181毫升管柱體積)。將該管柱用含有5mM DTT之PBS預先平衡。將9毫升體積之recA1PI樣品用DTT以50mM之濃度,於周遭溫度,過夜處理。將該樣品裝載於該管柱上;該負載構成該管柱體積之5%且該管柱以2毫升/分鐘(60厘米/小時)運轉。將14.5毫升恆定體積之餾份收集起來用於分析。將適當之餾份集中且使用Amicon UltraCelTM 30kDa MWCO旋轉濃縮器(密里波爾公司)濃縮回至約50毫克/毫升。未用DTT處理之控制樣品亦於相同的條件進行。
經50mM DTT處理之樣品的色層譜係顯示於圖8中且該控制樣品係顯示於圖9中。於用DDT處理之樣品的SEC運轉中,可看到明顯較小之第二個峰。將含有recA1PI之餾份B1-B3集中且使用30kDa MWCO旋轉濃縮器予以濃縮至約50毫克/毫升。將該濃縮之樣品藉由UV-Vis分光光度法分析。該顯示於圖10中之UV-Vis光譜,揭示的是
該黃色起始物質之特性的特徴,於由經還原之凝膠過濾洗出液之濃縮物中,recA1PI係顯著地減少。經高度純化之由血漿而來的人類A1PI係用作為控制組。
低濃度DTT之效應係藉著將recA1PI與DTT培育,使用凝膠過濾色層分離法純化該樣品,且然後得到該濃縮純化樣品之UV-Vis光譜而分析。使用SuperdexTM 200預備等級樹脂之1.6厘米內徑x 90厘米基座高度管柱(181毫升管柱體積)(GE醫療保健生命科學)。將該管柱用含有5mM DTT之PBS預先平衡。將9毫升體積之recA1PI用DTT,以適當濃度,於周遭溫度,過夜處理。該負載構成該管柱體積之5%且該管柱以2毫升/分鐘(60厘米/小時)運轉。將14.5毫升恆定體積之餾份收集起來。將適當的餾份集中且使用30kDa MWCO旋轉濃縮器濃縮回至約50毫克/毫升。
用10mM DTT及50mM DTT處理之樣品的UV-Vis光譜顯示,10mM DTT濃縮者於減低黃色著色之recA1PI之特性光譜之特徴上係如50mM DTT者一樣有效(圖11)。
基質輔助雷射解析/電離飛行時間質譜實驗係於recA1PI上進行。該預期是,由DTT處理所產生具有黃顏色之小峰可能含有質譜儀可識別之種類。然而,於此等樣品中沒有確認出任何種類。可能基質效應
已被100-10,000Da範圍中之分子的電離作用所干擾。
鐵離子被懷疑是該黃色的可能來源。於細胞培養中鐵是重要的過渡金屬且以檸檬酸鐵銨Fex(NH4)yC6H507加至上游細胞培養介質中。鐵分析顯示,相較於具有66μM鐵之起始物料,來自於凝膠過濾管柱之經DTT-還原之recA1PI的合併餾份的鐵含量降低了~30倍。參見圖13。於所負載之數量中,於該色層譜上以箭頭指出之黃色種類具有~50%鐵。
除了主峰餾份,無任何較小之峰餾份具有recA1PI活性。
色層分離法運轉係單獨用DTT,於不含recA1PI中完成,以觀看DTT於不含recA1PI時之色譜態樣。用201毫升洗提體積可觀察到單峰(圖12),其對應於相同洗提體積之最後的峰,可於具有recA1PI樣品之測試運轉中看到。具有微黃色對應於圖13中以箭頭指示之峰的餾份,為DTT所處理之recA1PI樣品之唯一者且不存在於僅有DTT之控制運轉中。
將具有黃色外觀之由血漿而來的A1PI產物予以測試,以確定是否用還原劑處理亦可導致類似之減少黃色。將10毫升等份量由血漿而來的A1PI,以約50毫克/毫升用最終濃度10mM之DTT處理。於SuperdexTM 200預備等級樹脂上之凝膠過濾色層分離法係如本文中所說明者進行
(GE醫療保健生命科學)。來自於用DTT處理由血漿而來的A1PI之運轉的色層譜係顯示於圖14中。
將對應於主峰下之recA1PI的餾份集中且濃縮至50毫克/毫升。該樣品的顏色與未處理樣品的顏色並無不同。此表示,由細胞培養而來的recA1PI之黃色來源與由血漿而來的A1PI者不同。
將半胱胺酸作為替代還原劑而檢查,因為半胱胺酸價格低廉且易於取得。此外,半胱胺酸係如胺基酸,為可接受之賦形劑。該實驗係於等份量之recA1PI用10mM半胱胺酸處理,且進行通過凝膠過濾管柱時完成。該運轉之色層譜係顯示於圖15中。將對應於recA1PI之餾份集中,且濃縮至50毫克/毫升。半胱胺酸作為還原劑亦可接受。
樣品用DTT或半胱胺酸以10mM濃度處理之顏色比較顯示,以可相比較之蛋白質濃度(~50毫克/毫升)時,黃色大幅減少。該A280/A405比被遵循作為樣品之黃色指標,其理由是溶液之吸光度於405nm時是黃色的定量測量。較高之A280/A405比值係對應於該樣品之淺黃色。未處理樣品之顯著的黃色係用DTT或半胱胺酸處理而大量去除。然而,該黃色並未完全去除且於該處理之樣品中仍留著一絲黃色痕跡。該A280/A405比充分反映此等趨勢且用還原劑處理後典型地可看到減少了3倍。高度純化由血漿而來的A1PI具有428之A280/A405比,實際上係明確地。
由用尺寸排阻色層分離法及用還原劑處理之實驗中,該recA1PI活性恢復力係自80-100%之範圍(參見表1)。
該處理樣品之鐵濃度,於用還原劑處理及色層分離純化後,降低很多。經還原及純化之樣品係使用感應偶合電漿原子吸收光譜法(ICP-AA)來分析。當與未處理之樣品相較時,離子濃度降低的程度係自約14倍(經半胱胺酸處理之樣品)至27倍(經10mM DTT處理之樣品)(表2)之範圍。
圖16係顯示該修訂之recA1PI純化過程的流程圖,其中半胱胺酸係加至該合併的陰離子交換洗出液中。接著該修訂之過程。於溶劑/清潔劑病毒去活化步驟後,將具有質量11.2公斤之細胞培養上清液於5厘米內徑×25厘米基座高度(500毫升)卡普多TM Q管柱(GE醫療保健生命科學)上,以300厘米/小時予以純化。將該管柱於20mM Na2HPO4,pH 6.0中平衡;用20mM Na2HPO4,20mM NaCl,pH 6.0清洗;且用25mM Na2HPO4,200mM NaCl,pH 7.0,超過8 CV洗提。Q-洗出液之A280為2.4,相當於2克/升之近似效力。將500毫升等份量之含有約1克recA1PI活性之此等Q-洗出液用10mM半胱胺酸處理(亞克洛斯化學品;賽默費舍科技;紐澤西州),且於室溫培育過夜(~25℃約16小時)。將該處理樣品用HIC稀釋緩衝液,25mM Na2HPO4,100mM NaCl,3M(NH4)2SO4,pH 7.0,以42:58予以稀釋,且用於負載5厘米內徑×10.3厘米基座高度(202毫升基座體積)尺寸之辛基瓊脂糖凝膠TM管柱。將該管柱用25mM Na2HPO4,100mM NaCl,1.75M(NH4)2SO4,pH 7.0,平衡且用20mM Na2HPO4,pH 6.0,超過10 CV之梯度洗提。將620毫升之洗出液體積,使用LabScaleTM TFF系統及Pellicon® 30kDa,3×50cm2濾器(密里波爾公司)濃縮至50毫升。將該樣品,使用Amicon UltraCelTM 30kDa MWCO濃縮器(密
里波爾公司)於4℃,以3,500rpm,藉離心進一步濃縮至50毫克/毫升。然後將該濃縮之樣品通過薩多賓® S-膜膠囊(薩多利斯公司,哥廷根,德國)平衡於10mM檸檬酸鈉緩衝液,pH 5.4中。將該樣品滲透對抗5-管柱容積之PBS。
控制運轉亦使用相同體積之Q-洗出液處理且於該HIC管柱上以相同的方式,於不含半胱胺酸之情況中進行。該控制組及半胱胺酸處理之試驗樣品的HIC色層分離態樣係可相比(參看圖17及圖18)。此說明添加半胱胺酸不能改變recA1PI於疏水相互作用管柱上之純化態樣。當該樣品濃縮至約50毫克/毫升時,可觀察到黃顏色大量減少,其相當於A280/A405比率改善了3.4倍(亦即,73對245)。以半胱胺酸處理之樣品的態樣與高度純化由血漿而來的A1PI者相較時,該UV-Vis光譜亦反映此等差異;參見圖19。
因此,於陰離子交換管柱與疏水交互作用色層分離法間之過夜半胱胺酸培育(參見圖16),於製備性規模運轉中,就黃顏色清除及對應於A280/A405比之改良而言,係可比得上那些於實驗室規模實驗所產生的結果。
於本文所說明之裝置及方法的範圍係包括於本文所說明之具體例、觀點、實例、步驟,及優選之所有的組合。
<110> 蓋立復股份有限公司
<120> 純化由細胞培養而來的ALPHA 1蛋白酶抑制劑
<130> 1300037/paf
<150> US 61/675,560
<151> 2012-07-25
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 418
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(24)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (25)..(418)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (70)..(70)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (256)..(256)
<223> C256 S-亞硝基化
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (271)..(271)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (376)..(376)
<223> 蛋白裂解位
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (382)..(383)
<223> 反應鍵
<400> 1
Claims (35)
- 一種由含有ALPHA1蛋白酶抑制劑(recA1PI)之水溶液中純化由細胞培養而來的人類A1PI之方法,其包括:(a)於含有recA1PI之溶液上進行病毒去活化步驟;(b)將該病毒去活化之溶液通過陰離子交換劑使得recA1PI結合於該陰離子交換劑;(c)由該陰離子交換樹脂洗提recA1PI以得到含有recA1PI之陰離子交換洗出液;(d)添加還原劑至該含有recA1PI之陰離子交換洗出液以得到還原性溶液,其中該還原劑為濃度由約10mM至約50mM之半胱胺酸或DTT;(e)培育該還原性溶液;(f)將該還原性溶液通過疏水交互作用色層分離法(HIC)樹脂使得recA1PI結合於該HIC樹脂;且(g)由該HIC樹脂洗提recA1PI以得到含有recA1PI之HIC洗出液。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該病毒去活化係包括溶劑/清潔劑培育。
- 如申請專利範圍第2項之方法,其中該溶劑係以0.01%至約0.5%之範圍添加。
- 如申請專利範圍第2項之方法,其中該清潔劑係以每體積該產生之混合物添加由約0.5%至約2.0%重量。
- 如申請專利範圍第2項之方法,其中該溶劑/清潔劑培育係包括於pH 約8及溫度約30℃添加約0.5%聚山梨醇酯20及約0.03%三(正丁基磷酸酯)。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該陰離子交換劑係為季銨樹脂。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該季銨樹脂為卡普多(Capto)TM Q。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原劑為半胱胺酸(Cys)、半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤鮮醇(DTE);殼胱甘肽(GSH)、2-巰基乙醇(2-ME)、2-巰基乙胺(2-MEA);三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、草酸、甲酸、抗壞血酸、菸草醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、菸草醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)或其組合物。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原劑為半胱胺酸或DTT。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原劑為半胱胺酸。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原劑濃度為由約1mM至100mM。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原劑濃度為約10mM。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原劑濃度為約1mM。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原培育步驟係進行約1至24小時。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原培育步驟係由約2℃至60℃進行。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該還原劑為10mM半胱胺酸且該培育係於約室溫過夜進行。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該HIC樹脂為辛基瓊脂糖凝膠(Octyl Sepharose)TM或卡普多(Capto)TM辛基。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其包括降低該鐵濃度。
- 如申請專利範圍第18項之方法,其中該鐵濃度減少(亦即,降低)2至100倍。
- 如申請專利範圍第18項之方法,其中該鐵濃度減少(亦即,降低)5至50倍。
- 如申請專利範圍第18項之方法,其中該鐵濃度為10μM或更低。
- 如申請專利範圍第18項之方法,其中該鐵濃度為1μM或更低。
- 一種純化由細胞培養而來的ALPHA1蛋白酶抑制劑(recA1PI)之方法,其包括將含有recA1PI之溶液與還原劑培育並將該recA1PI由該還原劑及該被還原物種中分離,其中該還原劑為半胱胺酸或DTT,且該還原劑濃度為由約10mM至約50mM。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該還原劑為半胱胺酸。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該還原劑濃度為約10mM。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該培育步驟係進行由約1至約24小時之時間。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該培育步驟係於溫度由約2℃至約60℃進行。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該還原劑為約10mM半胱胺酸且該培育係於約室溫過夜進行。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該recA1PI由該還原劑及被還原物種中分離係包括色層分離法。
- 如申請專利範圍第29項之方法,其中該色層分離法包括離子交換、疏水交互作用、凝膠過濾、親和性、免疫親和性或其組合。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該被還原物種包括鐵。
- 如申請專利範圍第31項之方法,其中該鐵濃度減少(亦即,降低)2至 100倍。
- 如申請專利範圍第31項之方法,其中該鐵濃度減少(亦即,降低)5至50倍。
- 如申請專利範圍第31項之方法,其中該鐵濃度為10μM或更低。
- 如申請專利範圍第31項之方法,其中該鐵濃度為1μM或更低。
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