CN1547586A - 提高的活性蛋白回收率 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高所需蛋白构象的产率的方法。在具体实施方案中，本发明包括使重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂接触足以提高所需构型异构体的相对比例的时间。

Description

提高的活性蛋白回收率

本申请要求2001年2月23日提交的临时美国申请60/271,033的优先权，它公开的内容全部引入此处作为参考。

                       发明领域

本发明属于蛋白的处理和纯化领域。

                          背景

许多真核来源的蛋白的高水平表达已经在原核表达宿主中获得。这种真核蛋白常常错折叠，并在原核宿主中累积成不可溶的包含体。为了获得生物活性蛋白，在包含体中捕获的蛋白必须是解折叠的，并在含有离液剂和还原硫醇的严格条件下重折叠。

真核来源的蛋白在真核宿主中表达可避免这些问题。如果能正确设计表达载体(例如，使用分泌信号肽等)，那么真核细胞系可倾向于正确加工并分泌可溶性产物形式的胞外真核蛋白。

然而，因为已经对表达系统和载体作了改进，从而使真核宿主的表达水平达到最大，因此并不是由这些宿主表达和分泌的所有重组蛋白都具有所需的，最大活性的构象。设计本发明用来克服这种表达问题，并使生物活性蛋白的产率最大。

                       发明概述

本发明部分基于下列发现，即，并不是由真核宿主细胞表达的所有重组蛋白制备物都折叠成天然的三级构象。此外，人们已经发现重组蛋白的区域或结构域可正确折叠，而其它区域或结构域则可能具有不需要的构象。因此，一方面，本发明提供一种方法，即，使重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂接触足以提高所需构象异构体的相对比例的时间，其中所述重组蛋白制备物含有重组蛋白的至少两种异构体的混合物，然后测定混合物中所需构象异构体的相对比例。另一方面，本发明包括使哺乳动物细胞产生的重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂在约pH7-11下接触，并分离具有所需构象的重组蛋白制备物的级分。优选的重组蛋白是糖基化重组蛋白，例如，真核细胞产生的那些。本发明还涉及把所得制备物制剂化成无菌单位剂量形式的方法，及通过本发明方法产生的组合物。

                        附图简述

图1.TNFR∶Fc的疏水相互作用层析(HIC)。如图所示，该TNFR∶Fc制备物在HIC过程中洗脱为3个不同的峰，这3个峰收集成#2级分和#3级分。

图2.#2和#3级分的圆二色性分析。以平均剩余(residue)椭圆率表示的近-UV圆二色性测量结果在图2中给出。图2A描述光谱数据；#3级分的线距离约270nM处，用箭头突出显示的负位移最近，这归因于二硫键，#2级分的线是更深的实线。图2B描述#2级分(小虚线)和#3级分(大虚线)的曲线拟合数据。

图3.使用在线大小排阻层析(SEC)，紫外线(UV)，光散射(LS)，和折射率(RI)(在线SEC/UV/LS/RI)连续检测，从而测定分子量。图3A是#3级分，图3B是#2级分。垂直的虚线表示评估主峰周围区域的分子量测定的部分。

图4.#2和#3级分的差示扫描量热分析。图4A是未校数据，图4B是基线-校正数据。热解链转换由垂直的虚线标记。箭头表示焓位移。图4B中的水平虚线用作基线参照。

图5.#2级分与结合活性的相互关系。测试了来源于6个不同细胞系的6个不同TNFR∶Fc制备物(用A-F表示)的#2级分(深色菱形)比例提高的百分比与TNFα结合单位(浅色菱形)提高的百分比之间的相互关系。

图6.各种不同浓度的半胱氨酸对#3级分转化成#2级分的影响。用各种浓度(0.25-5.0mM)的半胱氨酸处理蛋白样品，利用HIC评估#3级分的改变。X-轴表示在指定的半胱氨酸浓度下，测试4批不同的TNFR∶Fc达18小时。每批中#3级分转化成#2级分的百分比在y轴绘制。

图7.半胱氨酸浓度对#3级分比例的影响。用各种浓度的半胱氨酸(0-50mM)处理4批不同的蛋白样品，并通过HIC评估#3级分的所得水平。

图8.温度对二硫键交换的影响。室温或4℃时，在有或没有铜存在的条件下，处理蛋白级分不同的时间。图8A描述6小时后，HIC#3级分的改变，图8B描述18小时后，HIC#3级分的改变。

                         发明详述

本发明提供提高活性重组蛋白回收率的方法。具体而言，本发明包括促进重组蛋白制备物中的所需蛋白构象。值得注意的是，本发明提供在无需进行严格的离液剂(例如，强变性剂，如SDS，盐酸胍或尿素)处理的情况下，改变蛋白结构的温和方法。对重组蛋白制备物使用本发明的方法可使制备物中具有所需构象的重组蛋白百分比较高，或相对比例更高。重组蛋白所需构象是蛋白的三维结构，它与天然存在的蛋白结构域的功能非常相似，和/或可复制它们的功能。当打算把重组蛋白用作体内药物或生物制备物时，这种温和的方法特别有利。

通常，当重组蛋白含有受体蛋白的结构域时，所需构象将对受体的相关配体具有较高的结合亲和性(并，因此，具有较低的解离常数)。例如，TNF-结合分子的所需构象将对TNF(例如，TNF-α)具有较高的结合亲和性和较低的解离常数。

此外，重组蛋白所需构象优选比不需要的构象更耐热(在相同的溶液环境中测量)。耐热性可以任何一种方式测量，例如，解链温度转换(Tm)。重组蛋白所需构象可能具有，或没有不同的二硫键排列，虽然优选所述构象含有天然的二硫键。重组蛋白所需构象还可具有其它三级结构特性。例如，所需构象可以是单体，二聚物，三聚物，四聚物，或某些蛋白的其它更高级形式。对于本发明而言，蛋白的“构象”是它的三维结构。当它们具有与能量最小值相应的不同构象，而且它们彼此之间仅仅是原子的空间定向不同时，具有相同一级氨基酸序列的多肽的两种不同结构互为彼此的“构象异构体”。构象异构体可以相互转化(是指围绕着除断裂键之外的键自由旋转)。当具有与能量最小值相应的不同构象，它们彼此之间仅仅是原子的空间定向不同，而且它们不能在没有共价键断裂的条件下相互转化时，具有相同一级氨基酸序列的多肽的两种不同结构是“构型异构体”。在本发明的实际操作中，构型异构体可通过，例如，断裂并任选重新形成二硫键而相互转化。

因此，一方面，本发明包括使糖基化重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂充分接触足以提高所需构型异构体的相对比例的时间，其中所述重组蛋白制备物含有重组蛋白的至少两种构型异构体的混合物，然后测定混合物中所需构型异构体的相对比例。另一方面，本发明提供一种方法，即，使哺乳动物细胞产生的重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂在约pH7-11下接触，并分离具有所需构象的重组蛋白制备物的级分。优选的重组蛋白是糖基化重组蛋白，如真核细胞产生的那些。

本发明可用于处理几乎任何一种蛋白，从而促进所需构象。蛋白通常被理解为是至少约10个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选至少约75个氨基酸，最优选至少约100个氨基酸的多肽。本发明方法可特别用于处理具有至少约3个半胱氨酸残基，更优选至少约8个半胱氨酸残基，更优选至少约15个半胱氨酸残基，更优选至少约30个半胱氨酸残基，甚至更优选至少约50-150个半胱氨酸残基的蛋白。

通常，本发明方法用于改进重组蛋白的生产过程。重组蛋白是通过基因工程过程产生的蛋白。术语“基因工程”是指用于产生宿主细胞的任何重组DNA或RNA方法，其中所述宿主细胞可高水平，低水平表达基因，和/或基因的突变形式。换句话说，细胞已经用重组多核苷酸分子转染，转化或转导，并由此改变，以便使细胞改变所需蛋白的表达。通过基因工程方法改造细胞和/或细胞系，从而表达目标蛋白的方法和载体是本领域那些技术人员熟知的；例如，各种技术在 Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等，eds.(Wiley & Sons，New York，1988，每个季度更新一次)和Sambrook等， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press，1989)中列举。基因工程技术包括但不限制于表达载体，定向同源重组和基因激活(见，例如，美国专利第5,272,071，Chappel)及通过基因工程转录因子进行的反式激活(见，例如，Segal等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(6)：2758-63)。

本发明可特别用于提高糖基化蛋白的产生。特别是，使真菌细胞系统(例如，酵母，丝状真菌)和哺乳动物细胞系统分泌的蛋白糖基化。优选，所述蛋白是由适于在细胞培养基中生长的哺乳动物生产细胞分泌的。通常用于工业中的这种细胞的例子是CHO，VERO，BHK，HeLa，CV1(包括Cos)，MDCK，293，3T3，骨髓瘤细胞系(特别是鼠的)，PC12和WI38细胞。特别优选的宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其广泛用于生产一些复合重组蛋白，例如，细胞因子，凝血因子，和抗体(Brasel等，1996，Blood 88：2004-2012；Kaufman等，1988，J.Biol.Chem 263：6352-6362；McKinnon等，1991，J Mol Endocrinol6：231-239；Wood等，1990，J.Immunol 145：3011-3016)。二氢叶酸还原酶(DHFR)-缺陷突变细胞系(Urlaub等，1980，ProcNatl AcadSci USA 77：4216-4220)，DXB11和DG-44是可选择的CHO宿主细胞系，这是因为有效DHFR的可选择及可扩增基因表达系统可使这些细胞中的重组蛋白高水平表达(Kaufman R.J.，1990，Meth Enzymol185：527-566)。此外，这些细胞作为粘附或悬浮培养物而易于操纵，并显示出相对较好的遗传稳定性。CHO细胞及在它们中表达的重组蛋白已经被广泛描述过，而且已经被管理机构批准用于临床生产。

人们发现，本发明对于改进蛋白的生产过程而言，是一种温和而且有效的方法，其中所述蛋白可有多个构象和/或含有多于一个的结构域。“结构域”是多肽链的连续区，它具有特定的三级结构和/或特定的活性，并位于多肽链的区域中。例如，蛋白的一个结构域可对一个配体具有结合亲和性，而且蛋白的一个结构域可对另一个配体具有结合亲和性。在耐热的意义上，结构域是指蛋白的协同解折叠单位。这种含有多于一个结构域的蛋白可作为一种蛋白天然存在，或作为融合蛋白而被基因工程改造过。此外，多肽的结构域还可具有亚结构域。

一方面，本发明方法可用于重组蛋白制备物，其中蛋白的至少一个结构域具有稳定的构象，且蛋白的至少一个结构域具有不稳定的构象。术语“稳定”和“不稳定”是相对的术语。当在相同溶液中测量时，具有稳定构象的蛋白的结构域较之蛋白的不稳定结构域具有更高的解链温度(Tm)。在相同溶液中测量时，当Tm的差值至少约为2℃，更优选约4℃，更优选约7℃，更优选约10℃，更优选约15℃，更优选约20℃，甚至更优选约25℃，最优选约30℃时，与另一个结构域相比，其中一个结构域是稳定的。

本发明通常还适用于具有Fc结构域，和其它结构域的蛋白(例如，抗体，和Fc融合蛋白)。例如，在下面列举的其中一个非限制性实施方案中，TNFR∶Fc，分子Fc部分的Tm为69.1℃和83.4℃，而分子TNFR部分的Tm为52.5℃(在更需要的构象中)至49.7℃(在不太需要的构象中)。

特别优选的蛋白是基于蛋白的药物，也称作生物制备物。优选，所述蛋白被表达为胞外产物。可使用本发明方法生产的蛋白包括但不限制于flt3配体(在WO94/28391中描述，其全部引入此处作为参考)，CD40配体(在US6,087,329中描述，其全部引入此处作为参考)，红细胞生成素，血小板生成素，降钙素，Fas配体，NF-κB受体激活剂的配体(RANKL)，肿瘤坏死因子(TNF)-相关的编程性细胞死亡-诱导配体(TRAIL，在WO97/01633中描述，其全部引入此处作为参考)，胸腺基质衍生的淋巴细胞生成素，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，在澳大利亚专利第588819中描述，其全部引入此处作为参考)，肥大细胞生长因子，干细胞生长因子，表皮生长因子，RANTES，生长激素，胰岛素，促胰岛激素，胰岛素样生长因子，甲状旁腺激素，干扰素，神经生长因子，胰高血糖素，白介素1-18，集落刺激因子，淋巴细胞毒素-β，肿瘤坏死因子(TNF)，白血病抑制因子，制癌蛋白-M，和细胞表面分子ELK及Hek的各种配体(如，eph-相关激酶或LERKS的配体)。按照本发明方法纯化的蛋白的描述见，例如， Human Cytokines：Handhook for Basicand Clinical Research，Vol.II(Aggarwal和Gutterman，eds.BlackwellSciences，Cambridge，MA，1998)； Growth Factors：APractical Approach(Mckay和Leigh，eds.，Oxford University Press Inc.，New York，1993)；和 The Cytokine Handbook(A.W.Thompson，ed.，Academic Press，San Diego，CA，1991)。

前述任何一种蛋白的受体，特别是可溶形式的受体制备物，都可使用本发明方法提高，包括两种形式的TNFR(也称为p55和p75)，I和II型白介素-1受体(在EP 0 460 846，US 4,968,607，和US5,767,064中描述，它们全部引入此处作为参考)，白介素-2受体，白介素-4受体(在EP 0 367 566和US 5,856,296中描述，它们全部引入此处作为参考)，白介素-15受体，白介素-17受体，白介素-18受体，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体，粒细胞集落刺激因子受体，制癌蛋白-M和白血病抑制因子，NF-κB受体激活剂(RANK，在US6,271,349中描述，其全部引入此处作为参考)的受体，TRAIL的受体(包括TRAIL受体1，2，3，和4)，及含有死亡结构域的受体，如Fas或编程性细胞死亡-诱导受体(AIR)。

可使用本发明方法改进其产生方法的其它蛋白包括分化抗原的簇(也称为CD蛋白)，例如，在 Leukocyte Typing VI(Proceedings of the VIth International Workshop and Conference；Kishimoto，Kikutani等，eds.；Kobe，Japan，1996)中公开的那些，或在随后讨论会中公开的CD分子。这种分子的例子包括CD27，CD30，CD39，CD40；及其配体(CD27配体，CD30配体和CD40配体)。这些之中，有一些是TNF受体家族的成员，其还包括41BB和OX40；所述配体通常是TNF家族的成员(41BB配体和OX40配体)；因此，TNF和TNFR家族的成员也可使用本发明生产。

酶活性蛋白也可按照本发明制备。例子包括金属蛋白酶-disintegrin家族的成员，各种激酶，葡糖脑苷脂酶，超氧化物歧化酶，组织纤溶酶原激活剂，因子VIII，因子IX，载脂蛋白E，载脂蛋白A-I，珠蛋白，IL-2拮抗剂，α-1抗胰蛋白酶，TNF-α转化酶，及很多其它酶。酶活性蛋白的配体也可通过应用本发明而被表达。

本发明的组合物和方法也可用于制备其它类型的重组蛋白，包括免疫球蛋白分子或其一部分，和嵌合抗体(例如，具有与鼠抗原结合区偶联的人恒定区的抗体)或其片段。许多技术都是已知的，其中编码免疫球蛋白的分子可被操作产生能够表达重组蛋白，如单链抗体，具有较高亲和性的抗体，或其它基于抗体的多肽的DNAs(见，例如，Larrick等，1989，Biotechnology 7：934-938；Reichmann等，1988，Nature 332：323-327；Roberts等，1987，Nature 328：731-734；Verhoeyen等，1988，Science 239：1534-1536；Chaudhary等，1989，Nature 339：394-397)。完全的人类抗体制备物(如使用转基因动物制备，并可任选进一步在体外修饰)，及人源化抗体也可用于本发明中。术语人源化抗体还包括单链抗体。见，例如，Cabilly等，美国专利第4,816,567；Cabilly等，欧洲专利第0,125,023B1；Boss等，美国专利第4,816,397；Boss等，欧洲专利第0,120,694B1；Neuberger，M.S.等，WO86/01533；Neuberger，M.S.等，欧洲专利第0,194,276B1；Winter，美国专利第5,225,539；Winter，欧洲专利第0,239,400B1；Queen等，欧洲专利第0451216B1；和Padlan，E.A.等，EP 0 519 596A1。本发明方法还可在制备含有抗体和细胞毒性或发光物质的偶联物的过程中使用。这种物质包括：美坦素衍生物(如DM1)；肠毒素(如葡萄球菌肠毒素)；碘同位素(如碘-125)；锝同位素(如Tc-99m)；菁荧光染料(如Cy5.5.18)；和核糖体-灭活蛋白(如bouganin，gelonin，或皂草素-S6)。

本发明考虑的抗体或抗体/细胞毒素或抗体/发光团偶联物的例子包括识别上述任何一种蛋白或其组合和/或下列抗原的那些：CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-1α，IL-1β，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受体，IL-4受体，IL-6受体，IL-13受体，IL-18受体亚单位，PDGF-β，VEGF，TGF，TGF-β2，TGF-β1，EGF受体，VEGF受体，C5补体，IgE，肿瘤抗原CA125，肿瘤抗原MUC1，PEM抗原，LCG(它是一种被表达，并与肺癌有关的基因产物)，HER-2，肿瘤相关的糖蛋白TAG-72，SK-1抗原，以较高水平存在于结肠和/或胰腺癌患者血清中的肿瘤相关表位，在乳腺，结肠，鳞状上皮细胞，前列腺，胰腺，肺，和/或肾癌细胞和/或黑素瘤，神经胶质瘤，或成神经细胞瘤细胞，肿瘤坏死核心上表达的癌症-相关抗原决定部位或蛋白，整联蛋白α4β7，整联蛋白VLA-4，B2整联蛋白，TRAIL受体1，2，3，和4，RANK，RANK配体，TNF-α，粘附分子VAP-1，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，胞内粘附分子-3(ICAM-3)，白细胞整联蛋白粘附素，血小板糖蛋白gp IIb/IIIa，心肌球蛋白的重链，甲状旁腺激素，rNAPc2(它是VIIa因子-组织因子的抑制剂)，MHCI，癌胚抗原(CEA)，α-甲胎蛋白(AFP)，肿瘤坏死因子(TNF)，CTLA-4(它是细胞毒性T淋巴细胞-相关的抗原)，Fc-γ-1受体，HLA-DR10β，HLA-DR抗原，L-选择蛋白，IFN-γ，呼吸道合胞病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，乙肝病毒(HBV)，变异链球菌，和金黄色葡萄球菌。

各种融合蛋白制备物也可使用本发明方法制备。这种融合蛋白的例子包括表达为与免疫球蛋白分子的一部分的融合物的蛋白，表达为与拉链部分的融合物的蛋白，和新的多功能蛋白，如细胞因子和生长因子的融合蛋白(即，GM-CSF和IL-3，MGF和IL-3)。WO93/08207和WO96/40918分别描述了CD40L分子的各种可溶性寡聚形式的制备物，包括免疫球蛋白融合蛋白，和拉链融合蛋白；其中讨论的技术也适用于其它蛋白。上述任何一种分子均可被表达为融合蛋白，包括但不限制于细胞受体分子，酶，激素，细胞因子的胞外结构域，免疫球蛋白分子，拉链结构域，和抗原决定部位的一部分。

重组蛋白制备物可以是细胞培养物的上清液，细胞提取物，但优选它们的部分纯化级分。“部分纯化”是指已经进行了一些分级分离过程，但所存在的多肽种类比所需蛋白或蛋白构象还要多(至少10％)。本发明方法的其中一个优点是重组蛋白制备物的浓度可以非常高，优选浓度为0.1-20mg/ml，更优选0.5-15mg/ml，更优选1-10mg/ml。

重组蛋白制备物最初可通过在适于表达多肽的培养条件下培养重组宿主细胞而制备。所述多肽还可被表达为转基因动物的产物，例如，转基因母牛，山羊，猪，或绵羊的奶成分，其特征在于含有编码多肽的核苷酸序列的体细胞或生殖细胞。使用已知方法还可纯化，或部分纯化这种培养物或组分(例如，培养物或细胞提取物或体液)中的所得表达多肽。分级分离过程包括但不限制于一个或多个过滤，离心，沉淀，相分离，亲和纯化，凝胶过滤，离子交换层析，疏水相互作用层析(HIC；使用树脂如苯醚，丁醚，或丙醚)，HPLC步骤，或上述一些步骤的结合。

例如，多肽的纯化包括含有与多肽结合的试剂的亲和柱；在这种亲和树脂，如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖，肝素-toyopearl或Cibacrom蓝3GA Sepharose上进行的一个或多个柱步骤；包括洗脱的一个或多个步骤；和/或免疫亲和性层析。所述多肽可以促进纯化的形式表达。例如，它可被表达成融合多肽，如麦芽糖结合多肽(MBP)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)的那些。表达和纯化这种融合多肽的试剂盒可分别从New England Biolab(Beverly，Mass.)，Pharmacia(Piscataway，N.J.)和InVitrogen购得。所述多肽可用表位标记，随后通过使用针对这种抗原决定部位的特异性抗体而纯化。这种表位(FLAG)是从Kodak(New Haven，Conn.)购得的。还可利用含有多肽-结合多肽，如重组蛋白单克隆抗体，亲和纯化表达多肽的亲和柱。其它类型的亲和纯化步骤可以是蛋白A或蛋白G柱，其中亲和剂结合含有Fc结构域的蛋白。多肽可使用常规技术从亲和柱上除去，例如，先放在高盐洗脱缓冲液中，然后透析到低盐缓冲液中，或根据所用亲和基质改变pH或其它成分，或使用天然存在的亲和部分的底物竞争除去。在下面所列的其中一个实施方案中，重组蛋白制备物已经在蛋白A亲和柱上被部分纯化。

以各种形式组合的上述纯化步骤的一些或全部还可用于制备重组蛋白的适宜制备物，从而用于本发明的方法中，和/或在使重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂接触之后，进一步纯化重组多肽。基本没有其它哺乳动物多肽的多肽被称为“分离的多肽”。

所述多肽还可通过已知的常规化学合成产生。通过合成方式构造多肽的方法对于本领域那些技术人员而言是已知的。所述合成构建的多肽序列可在体外糖基化。

所需的最终纯度取决于多肽的预定用途。例如，当多肽体内给药时，需要相对较高的纯度。在这种情况下，纯化多肽，以便在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析时，检测不到与其它多肽相应的多肽带。相关领域的技术人员应当认识到，由于糖基化作用不同，翻译后加工不同等原因，与多肽相应的多个带可通过SDS-PAGE显示。最优选，将本发明的多肽纯化至基本均一，这可通过进行SDS-PAGE分析后的单一多肽带表示。所述多肽带可通过银染色，考马斯蓝染色，和/或放射自显影(如果多肽被放射性标记过)显示。

“接触”是指与溶液接触，和/或暴露于溶液中。可使蛋白或多肽接触，同时与固体支持物(例如，亲和柱或层析基质)结合。优选，溶液是缓冲的。为使具有所需构象的蛋白产率最大，应选择可保护蛋白稳定性，而且最适于二硫键交换的溶液pH值。在本发明的实际操作中，溶液pH优选不是强酸性的。因此，优选的pH值范围大于pH5，优选约pH6-pH11，更优选约pH7-pH10，更优选约pH7.6-pH9.6。在下面列举的使用TNFR∶Fc的本发明其中一个非限制性实施方案中，最佳pH值约为pH8.6。然而，本发明具体实施方案的最佳pH值可由本领域那些技术人员通过实验很容易地确定。

所述还原/氧化偶联剂是还原剂的来源。优选的还原剂是游离硫醇。所述还原/氧化偶联剂优选包括还原和氧化谷胱甘肽，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，二硫硝基苯甲酸盐，半胱氨酸和胱氨酸。为了便于使用而且更经济，还可使用还原谷胱甘肽和/或还原半胱氨酸。

还原/氧化偶联剂以足以提高所需构象相对比例的浓度存在。还原/氧化偶联剂的最佳浓度取决于蛋白的浓度和蛋白中的二硫键数。例如，人们已经发现使用2mg/ml浓度(大约14μM蛋白或400μM二硫化物)，具有29个二硫键的蛋白(TNFR∶Fc)，具有2mM还原硫醇的还原/氧化偶联剂可更好地作用，从而提高所需构象的相对比例。这与约35个游离硫醇对1个二硫键的比例相一致。然而，人们还发现20-400个游离硫醇/二硫化物的比例也可起作用。当然，特定浓度所用硫醇的量可根据硫醇还原能力的不同而改变，并可由本领域技术人员很容易地确定。

因此，通常，还原/氧化偶联剂中游离硫醇的浓度约为0.05mM-50mM，更优选约0.1mM-25mM，更优选约0.2mM-20mM。

此外，还原/氧化偶联剂可含有比还原硫醇成分大致更高，相等或更低浓度的氧化硫醇。例如，还原/氧化偶联剂可以是还原谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽的组合。人们通过实际的操作发现，还原谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽的比例约为1∶1-100∶1(还原硫醇∶氧化硫醇)时，可发挥同等作用。可选择地，在另一个实施方案中，还原/氧化偶联剂可以是半胱氨酸或半胱氨酸与胱氨酸的组合。因此，当原始还原/氧化偶联剂中含有氧化硫醇时，还原硫醇与氧化硫醇的比例优选约1∶10-1000∶1，更优选约1∶1-500∶1，更优选约5∶1-100∶1，甚至更优选约10∶1。

使重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂充分接触一段时间，从而提高所需构象的相对比例。任何比例的相对提高都是我们所期望的，但优选至少有10％具有不需要构象的蛋白转化成具有所需构象的蛋白。更优选至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，甚至80％的蛋白从不需要的构象转化成所需构象。用本发明方法获得的一般产率为40-80％。如果接触步骤是对部分或高度纯化的重组蛋白制备物进行的，那么接触步骤可进行短至约1-4小时，长至约6小时-4天。人们已经发现约4-16小时或约18小时的接触步骤都可很好地作用。所述接触步骤还可在其它步骤，如固相或过滤或纯化的任何其它步骤过程中进行。

本发明方法可在较宽的温度范围进行。例如，本发明方法可在约4℃-37℃成功进行，然而最好的结果是在低温获得的。使部分或完全纯化的重组蛋白制备物接触的典型温度约为4℃-25℃(室温)，但也可在更低和更高的温度下进行。

重组蛋白制备物还可以各种适宜的体积与还原/氧化偶联剂接触。例如，本发明方法已经在分析实验室规模(1-50mL)，制备规模(50mL-10L)和生产规模(10L或更多)成功进行。因此，本发明方法可小规模和大规模地重复进行。

在优选方面，接触步骤是在没有大量离液剂，如SDS，尿素和盐酸胍存在下进行的。需要大量离液剂是为了观察看得见的解折叠。通常，存在小于1M的离液剂，更优选小于0.5M，更优选小于0.1M的离液剂。当不打算向溶液中加离液剂时，溶液基本上没有离液剂(例如，SDS，尿素和盐酸胍)，而且可能仅仅存在痕量水平(例如，小于10mM)(例如，来源于容器或细胞副产物)。

二硫键交换可以本领域那些技术人员已知的任何方式终止。例如，通过纯化步骤除去还原/氧化偶联剂或使其浓度降低，和/或通过，例如，将溶液酸化而化学灭活。通常，当通过酸化终止反应时，含有还原/氧化偶联剂的溶液pH值降至低于7。优选，pH值降至低于pH6。通常，pH值降至约pH2-pH7之间。

测定蛋白构象，及混合物中蛋白构象的相对比例可使用各种分析和/或定量技术的任何一种进行。如果蛋白构象间存在活性差异，那么可通过活性测定法(例如，与配体结合，酶活性，生物活性等)测定混合物中构象的相对比例。例如，在下面所述的其中一个非限制性实施方案中，可使用固相TNF结合测定法拆分TNFR∶Fc的至少2个不同构象。该测定法，基本上是对于IL-1R进行描述的(Slack等，1993，J.Biol.Chem.268：2513-2524)，可通过配体-受体结合的缔合常数，解离常数或抑制常数的改变来区分各种蛋白构象之间的相对比例。可选择地，结合结果以活性单位/mg蛋白g表示。

如果在层析，电泳，过滤或其它纯化技术过程中，两种构象不同拆分，那么可使用这种纯化技术测定混合物中构象的相对比例。例如，在下面所述的非限制性实施方案中，TNFR∶Fc的至少两种不同构象可通过疏水相互作用层析分离。此外，因为远-UV圆二色性已经用于评估蛋白的二级结构组成(Perczel等，1991，Protein Engrg.4：669-679)，因此这种技术可确定是否存在选择性的蛋白构象。用于测定构象的另一种技术是荧光光谱，它可用于确定归因于色氨酸和酪氨酸荧光的三级结构的补充差异。可用于确定构象差异及构象相对比例的其它技术是测量聚集状态的在线SEC，测量解链转换(Tm’s)的差示扫描量热法，及成分的焓，和离液剂解折叠。

术语“分离”是指混合物中至少一个成分自混合物中其它成分的物理分离。分离成分或特定的蛋白构象可使用任何能够分离这种成分的纯化方法获得。因此，人们可进行一个或多个层析步骤，包括但不限制于HIC，羟磷灰石层析，离子交换层析，亲和，及SEC。其它纯化方法是过滤(例如，切向流过滤)，电泳技术(例如，电泳，电洗脱，等电点聚焦)，和相分离(例如，PEG-葡聚糖相分离)，这些不过是举例说明。此外，可用本发明方法再次处理重组蛋白制备物的级分，从而进一步使具有所需构象的蛋白的产率最佳化，其中所述重组蛋白制备物的级分含有以不需要构象存在的蛋白。

例如，处理后，可通过下列方法制备蛋白样品，并用于进行疏水相互作用层析(HIC)。将等体积的850mM枸橼酸钠，50mM磷酸钠，pH6.5加入到处理过的样品中，室温平衡。过滤后(例如使用0.22μm过滤器)，在ToyopearlButyl 650-M树脂(Tosoh Biosep LLC，Montgomeryville，PA)上进行HIC层析，流速150cm/hr，上样量2.1mg·mL树脂^-1。柱子用3倍柱容积的425mM枸橼酸钠，50mM磷酸钠，pH6.5预平衡，将样品上样，然后用3倍柱容积的425mM枸橼酸钠，50mM磷酸钠，pH6.5洗涤。梯度洗脱可使用总共5倍柱容积中的425mM枸橼酸钠，50mM磷酸钠，pH6.5，到0mM枸橼酸钠，50mM磷酸钠，pH6.5进行。各级分在洗脱过程中收集。柱子可用3倍柱容积的水，然后是3倍柱容积的0.1M NaOH洗脱。因此使用本发明方法可获得含有超过85％，超过90％，甚至超过95％TNFR∶Fc的TNFR∶Fc制备物，而且绝大多数都是以活性构象存在于的(#2级分)。因此本发明提供含有这种#2级分的TNFR∶Fc的组合物，包括药物组合物。

本发明任选包括进一步制剂化所述蛋白。术语“制剂化”是指将所述蛋白缓冲交换，灭菌，批量包装和/或相对于最终的使用者进行包装。对于本发明而言，术语“无菌批量形式”是指制备物没有，或基本上没有微生物污染(食品和/或药物能够接受的程度)，而且制备物的组成和浓度是规定好的。术语“无菌单位剂量形式”是指适于消费者和/或患者给药或消耗的形式。这种组合物含有与其它成分，如生理学上可接受的稀释剂，载体，和/或赋形剂组合的有效量的蛋白。术语“药学上可接受的”是指不会干扰活性成分生物活性有效性的非毒性材料。适于给药的制剂包括含水和不含水的无菌注射液，其中可含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和使制剂与受体血液等渗的溶质；含水和不含水的无菌混悬液，其中含有悬浮剂和增稠剂。此外，无菌批量形式和无菌单位形式可含有小浓度(约1μM-10mM)的还原/氧化偶联剂(例如，谷胱甘肽，半胱氨酸等)。多肽还可按照制备药学上有效的组合物的已知方法制剂化。它们可以是唯一的活性物质，或与其它适于已知适应症的已知活性物质，与药学上可接受的稀释剂(例如，盐水，Tris-HCl，醋酸盐，和磷酸盐缓冲液)，防腐剂(例如，硫汞撒，苯甲醇，对羟基苯甲酸酯)，乳化剂，增溶剂，佐剂和/或载体混合。药物组合物的适宜制剂包括在Remington’s PharmaceuticalSciences，16^th ed.1980，Mack Publishing Company，Easton，PA中描述的那些。此外，这种组合物还可与聚乙二醇(PEG)，金属离子络合，和/或掺入到高分子化合物，如聚乙酸，聚羟基乙酸，水凝胶，葡聚糖等中，或掺入到脂质体，微乳剂，胶束，单层或多层的囊泡，红细胞影或球芽中。用于脂质体制剂中的适宜脂类包括但不限制于，甘油单酯，甘油二酯，硫苷脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂苷，胆汁酸等。这种脂质体制剂的制备在本领域技术人员的水平之内，公开于，例如，美国专利第4,235,871；美国专利第4,501,728；美国专利第4,837,028；和美国专利第4,737,323。这种组合物可影响物理状态，溶解性，稳定性，体内释放速率，体内清除速率，因此可根据预定的应用选择，这样载体的特性将取决于所选择的给药途径。适于使用的持续释放形式包括，但不限制于，将多肽密封在缓慢溶解的生物相容性聚合物中(如美国专利第6,036,978中所述的藻酸盐微颗粒)，与这种聚合物(包括局部使用的水凝胶)混合，和/或嵌入到生物相容性半渗透植入物中。

上面已经描述了本发明，下列实施例是为举例说明而提出的，不是对本发明的限制。

                      实施例1

          TNFR∶Fc#2和#3级分的生物物理评估

通过疏水相互作用柱(HIC)将TNFR∶Fc洗脱为三个不同的峰，它们被称为#1级分，#2级分和#3级分(见图1)。#2级分是所需级分。#3级分是特别感兴趣的，因为它含有20-60％的样品，而且已经显示出与#2级分相比，较低的TNF结合活性及A375生物活性。因此，为了解这两种级分之间的差异，并确定是什么因素导致#3级分活性的损失，例如它与结构和构象有关，进行了生物物理研究。在这个实施例中，我们使用圆二色性，荧光，在线SEC/UV/LS/RI，和差示扫描量热法分析了#2级分和#3级分。

材料和方法：

材料：起始材料是TMS缓冲液(10mM Tris，4％甘露糖醇，1％蔗糖)中的TNFR∶Fc。为了进行下面描述的实验性研究，将该材料通过HIC洗脱的级分分离成#2级分和#3级分。

圆二色性：研究是在近(250-340nm)和远-UV(190-250nm)区进行的。进行近-UV研究是为了说明三级结构的差异，而远-UV研究则是用于描述二级结构的差异。

近-UV圆二色性测量是在下列浓度的TMS溶液中进行的。起始材料被稀释到6.25mg/ml，而#2和#3级分则分别是在它们现有的9.4和5.4mg/ml浓度评估的。使用具有0.1cm径长的圆二色性细胞，并在340-250nm进行扫描。

远-UV圆二色性测量是用交换到10mM磷酸钠(pH7.0)中的蛋白缓冲液进行的，随后用0.1cm径长，在250-190nm扫描进行评估。二级结构组合物是使用凸约束(convex constraint)分析(CCA)评估的(Perczel等，1991，Protein Engrg.4：669-679)。

荧光光谱：用两种不同的激发波长检测稀释到约50微克/ml的样品。酪氨酸和色氨酸的荧光是用270nm的激发波长检测的，而色氨酸的荧光是使用295nm的激发波长专门评估的(Lakowicz，J.R.in“Principles of Fluorescence Spectroscopy”，Plenum Press，1983.New York，N.Y.，342-343)。270nm激发波长的荧光扫描是从300-440nm，295nm激发波长的荧光扫描是从310-440nm。求每个光谱4次连续扫描的信号平均值。报告标准化的数据以评估样品产生的频率的差异。

在线-SEC/UV/LS/RI：使用大小排阻层析洗脱下来的成分的分子量是使用紫外线(UV@280nm)，光散射(90)，折射率(RI)连续检测确定的。该方法已被很好地记载(见Arakawa等，1992，Anal.Biochem.203：53-57和Wen等，1996，Anal.Biochem.240：155-166)，而且具有测量糖基化肽和蛋白的未糖基化分子量的优点。使用具有BioSil-400-5柱(来自BioRad)的Integral HPLC系统(PerSeptiveBiosystems，Inc.)，流速1ml/min，采集SEC和UV数据。洗脱缓冲液由100mM磷酸盐(pH6.8)和100mM NaCl组成。DAWN DSP多角度光散射检测器和Optilab DSP折射计都是从Wyatt Technology，Inc.购买的。测定仪器常数的校准标准包括BSA二聚物，BSA单体和卵清蛋白(图2)。

差示扫描量热法(DSC)：解折叠的物理性质是使用向上扫描(upscan)模式的MicroCal MC-2 DSC仪器测量的。样品通过缓冲交换到pH7.4的相同TMS缓冲液中制备。样品含有约4mg/ml的蛋白，并与作为参照的缓冲液(没有蛋白)对照评估。扫描速率67℃/hr，温度20℃-90℃。集合扫描随后转化成浓度标准化扫描，从而更好地比较解折叠转换的焓行为，同时考虑浓度差异(数据以千卡/摩尔表示)。结果：

圆二色性.以平均剩余椭圆率表示的近-UV圆二色性测量结果在图2给出。正如#3级分光谱较大比例的负椭圆率所示，#2与#3级分之间，在近270nm处的广泛特征的改变很明显(如图2A中的箭头所示)。值得注意的是，起始材料的光谱行为与#2级分的非常匹配，但在270nm周围的相同区中，没有显示出敏锐的负位移。这个结果似乎与构成起始材料一小部分的#3级分相一致，并可显著降低该区中的全部椭圆率，但位移方向相同。#3级分光谱的再现性证实了所观察到的该样品的位移是真实的。知道并了解二硫键可在圆二色性光谱该区中产生显著的负椭圆率特征(见Kahn，P.C.，1978，MethodsEnzymol.61：339-378和Kosen等，1981，Biochemistry 20：5744-5754)，近-UV圆二色性光谱是曲线拟合的，用于评估在该区中观察到的什么变化与三级结构有关。曲线拟合数据的结果在图2B中给出，并显示出较小的红移(3nm)，而且提高了负位移，这些与比较#3和#2级分时，含有二硫键的三级结构的改变相一致。

远-UV圆二色性用于评估蛋白的二级结构组成(Perczel等，1991，Protein Engrg.4：669-679)。使用CCA进行二级结构排布。将二级结构元件总和组成的计算光谱与实验观察到的光谱进行比较，显示出良好的适合性。在实验精确度的范围之内(10％之内)，两个级分的二级结构是可比较的。因此，本实验不能区分这两个级分任何一个的二级结构的任何差异。

荧光光谱.已知在近-UV圆二色性区观察到了显著的差异，应用荧光光谱可确定归因于色氨酸和酪氨酸荧光的三级结构的补充差异。使用两种激发波长，可确定考虑的全部三个例子(SM，#2级分和#3级分)的光谱，而使用近338nm的荧光最大值时，则被认为是绝不可能的。因为已知蛋白的三维结构是造成天然蛋白发射最大值的原因，因此这些结果表明，含有内在荧光团，色氨酸和酪氨酸的平均结构没有被扰乱。

在线SEC/UV/LS/RI.光散射研究是使用SEC产生的主要洗脱峰的分子量在线进行的，其中主要洗脱峰的分子量与TNFR∶Fc的未糖基化多肽的分子量一致(例如，102kD)。虽然使用这种技术评估的洗脱种类的组成存在着明显的差异，当比较#3级分和#2级分的洗脱曲线时(图3A和B)，所测量的含有绝大多数成分的主峰分别为102.5±1.6kD(保留体积＝8.4mL)和101.9±2.1kD(保留体积＝8.3mL)。精确度以图3中的垂直虚线范围内，洗脱峰23个部分的标准差表示。值得注意的是，#3级分下降肩状部分的大量信号可确定多肽的分子量为78.1±3.7kD(该评估包括在8.85mL标记的峰周围的8个部分)。因为是通过与该成分分子量测定有关的精确度表示，因此该峰显示出较高的不均一性，并因此怀疑比主峰具有更高的多分散性。#3级分还含有大量高分子量种类，与TNFR∶Fc主要二聚形式的洗脱体积相一致(接近7.5)。因此，确定#3级分是由若干种类组成的，包括聚集物和分子的片段部分。

差示扫描量热法.对两个级分进行的DSC测量在TNFR∶Fc分子TNFR级分的解折叠方面产生了显著的差异(图4)。从基线校正数据可更清楚地看出(图4B)，当比较52.5℃的Tm(#2级分)和49.7℃的Tm(#3级分)时，解链转换(Tm)下降了2.8℃。与具有6.5℃半-宽度的#2级分相比，半-宽度为8℃转换最大值一半的#3级分的转换更显著一些。这种低温转换已经从TNFR∶Fc单体的热解折叠实验鉴定，这是由于分子的TNFR结构域。69.1℃和83.4℃的热转换是由于分子的Fc部分。这后两种解折叠转换良好排列，而且可比较它们的Tm’s和成分的焓。

讨论：

在试验过的方法中，在近-UV圆二色性和DSC测量中观察到了差异。差示扫描量热法的数据可支持结构的疏松，而结构疏松则归因于Fc的区域中几乎没有观察到改变的分子受体部分。近-UV圆二色性结果表明，二硫键涉及与#3级分相关的三级结构的改变。这些改变可能是由于隐蔽二硫键更暴露于溶剂，并且通过在#3级分HIC洗脱中观察到的保留时间的稍稍提高解释了疏水性提高的原因。有趣的是，可指示构象结构改变的荧光数据没有可识别的差异。如果根据酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的分布考虑TNFR∶Fc的一级结构，那么可明显看出，从TNFR结构域第104个残基的C-末端部分解延伸到FcN-末端部分第296个残基的区缺乏这些内在荧光团。因此，与数据相一致的一个可能解释是距离Fc铰链区较远的三级结构相对未改变，而残基C115-C281在构象上可能有一些改变。分子该区含有10个可能的半胱氨酸，它们可能受结构改变的短暂结果影响，其中所述结构改变可影响酪氨酸和色氨酸的局部结构。值得注意的是，目前还不知道该分子是如何折叠的，而且似乎构成距离任何已知色氨酸或酪氨酸残基更远的二硫键的半胱氨酸是对三级结构改变的合理怀疑，其中所述三级结构的改变产生所观察到的近-UV圆二色性结果，但对含有酪氨酸和色氨酸的邻位结构影响较小。这个意见不排除在一个或两个TNFR臂内，存在着结构的某些不常见改变，所述TNFR臂不会导致酪氨酸和色氨酸引起的荧光净作用的显著改变。荧光数据(对二硫键不敏感)没有变化和近-UV(对二硫键，酪氨酸和色氨酸敏感)显示出与二硫键结构修饰相一致的少量负位移的事实意味着二硫键在#2和#3级分间的差异中发挥了作用。

在总结#3级分产生的剩余数据时，人们发现它与#2级分在有关分子量和二级结构方面不能区别。

                     实施例2

  使用谷胱甘肽对TNFR∶Fc的#3级分进行二硫键交换实验

该试验被设计用来评估在大规模生产过程中，促进TNFR∶Fc的#3级分转化成#2级分构象的各种处理方法。

材料和方法：

材料.起始材料是蛋白A洗脱物TNFR∶Fc，#3级分的纯HIC洗脱物，及#2级分和#3级分HIC洗脱物的50∶50混合物。缓冲液是0.1M枸橼酸盐或0.1M Tris/甘氨酸，pH7.6，pH8.6，或pH9.6。TNFR∶Fc的蛋白浓度为0.2-4.5mg/mL。还原谷胱甘肽和谷胱甘肽(GSH/GSSG的比例为10∶1)的氧化还原偶联系统以0.1-5mM GSH加入。孵育温度为4℃，22℃，或31℃。

方法.二硫键交换是通过用1M醋酸将样品酸化至pH6而终止的。处理过的重组蛋白制备物是通过分析型HIC，SEC(保留时间，集合物浓度)和固相TNF结合测定法描述的，然后测定#2级分的百分比和产率。

结果和讨论：

处理效率是pH和GSH浓度的函数。当使用0.1mM GSH/pH7.6和0.1mM GSH/pH8.6进行处理时，#3级分中的蛋白转化成#2级分的百分比较高(至少10％)。然而，当使用0.1mM GSH/pH9.6；1mMGSH/pH7.6；1mM GSH/pH8.6；和1mM GSH/pH9.6进行处理时，效率大大提高(从45％-几乎70％)。因此，虽然处理效率对pH和游离硫醇的浓度敏感，但也可在这些变量的较宽范围内有效进行。

温度的影响.#3级分是在3个不同的温度，4℃，22℃，或31℃下处理的。GSH浓度保持在1mM，pH8.6。16小时后，处理组全部显示出从#3级分到#2级分的显著转化，但这种转化似乎在两个较低的温度下更有效。

克隆作用.根据上述结果，按照标准方案试验了6个不同的细胞系克隆，它们全部产生TNFR∶Fc。具体而言，使用1M Tris/甘氨酸(最终浓度0.1M Tris/甘氨酸)将含有0.4-0.7mg/mL TNFR∶Fc(约pH4)的蛋白A洗脱物调节至pH8.6。把这些溶液调节至1mM EDTA和2.5mMGSH/0.25mM GSSG，室温孵育16小时。二硫键交换是通过上述酸化终止的。

6个不同的克隆全部显示出#2级分产量和产率的提高。在各个克隆中，处理导致的HIC#3级分的减少分别为64％，72％，77％，78％，78％和83％。相同克隆中HIC#2级分的提高分别为37％，64％，78％，70％，44％和54％。如图5所示，HIC#2级分百分比的提高与结合单位的提高％相互关联。因此，该方法似乎可普遍用于所有进行试验的克隆。

结合测定法.在固相TNF结合测定法中测定3个不同的TNFR∶Fc制备物。样品11-6和12是蛋白A柱的洗脱物。样品8085-47也是从蛋白A柱洗脱下来的，然后经历附加的HIC纯化步骤；该样品仅含有#3级分。如上所述，在进行二硫键交换之前和之后，在结合测定法中检测样品。下面表1给出的结果显示出在用谷胱甘肽处理所有的样品之后，配体的结合活性提高。

                          表1

      二硫键交换之前和之后的TNFR∶Fc的TNF结合活性

样品        交换前         交换后          改变％

                 (活性/m蛋白G)

11-6       4.16×10⁷      5.73×10⁷       27％

12         4.36×10⁷      6.13×10⁷       29％

8085-47    1.90×10⁷      6.75×10⁷       72％

                  实施例3

      L-半胱氨酸处理过的TNFR∶Fc的二硫键交换实验

该实验被设计用来评估作为TNFR∶Fc还原/氧化偶联剂的半胱氨酸/胱氨酸。该方法可评估在大规模生产过程中，HIC#3级分到#2级分构象的改变。该过程可对纯化的#3级分，#2和#3级分的混合物进行，和/或接着使用其它分离技术，如蛋白A层析，具有相似的结果。

材料和方法：

起始材料是作为#3级分纯HIC洗脱物的TNFR∶Fc或含有#2和#3级分的蛋白A洗脱的TNFR∶Fc。缓冲液是0.1M枸橼酸盐或0.2M Tris，pH8.5。TNFR∶Fc的蛋白浓度是2.5-3mg/mL。

使用L-半胱氨酸(0-50mM)的氧化还原偶联系统。该过程还评估了+/-L-半胱氨酸(0.025-0.5mM)和+/-1mM EDTA。孵育温度为4℃，15℃，和22℃，时间为6，18和48小时。二硫键交换是通过用NaH₂PO₄或0.85M枸橼酸盐将样品酸化至pH7而终止的。处理过的重组蛋白制备物是通过分析型HIC和SEC(保留时间，集合浓度)描述的，然后测定#2级分和#3级分的百分比和产率，半胱氨酰和游离硫醇测定法。

结果和讨论：

处理效率是L-半胱氨酸浓度(0-5mM)的函数。在没有L-半胱氨酸或EDTA的条件下，当用0.25mM L-半胱氨酸处理4份重复样品时，HIC#3级分中，有显著百分比的TNFR∶Fc蛋白转化成#2级分。然而，当用1mM L-半胱氨酸或5mM L-半胱氨酸进行处理时，效率大大提高(从45％-几乎70％)(图6)。胱氨酸在这些反应条件中的作用根据EDTA的存在而变化(见下面)。对于已知细胞的分批培养而言(处理来源于4次不同细胞分批培养的样品)，处理过程是可再现的。

处理效率是更高L-半胱氨酸浓度(5-50mM)的函数。用于处理TNFR∶Fc的更高浓度的L-半胱氨酸(5，15，和50mM L-半胱氨酸)导致各种情况下，来源于起始材料的HIC#3级分的减少，但5mM L-半胱氨酸对于促进#2级分的积累最有效(图7)。据估计，较高浓度的L-半胱氨酸或者显著减少分子中的半胱氨酰部分，或需要太长时间以致不能再氧化。

处理效率是额外L-半胱氨酸补料的函数。为了尝试提高二硫键交换的效率，用5mM L-半胱氨酸处理TNFR∶Fc，并在4℃孵育18小时。然后加入额外的L-半胱氨酸(0-5mM)，4℃再孵育样品2天。在这些条件下，通过额外L-半胱氨酸的补料注意到对HIC#3级分与#2级分的比例没有显著影响。

EDTA，胱氨酸和L-半胱氨酸的影响。胱氨酸(0-0.4mM)与L-半胱氨酸(5mM)组合对TNFR∶Fc的影响是在有或没有1mM EDTA的条件下评估的。1mM EDTA存在情况下的最佳结果是使用0.1-0.2mM浓度的半胱氨酸达到的。

铜，温度和时间的影响。4℃和22℃时，用5mM L-半胱氨酸处理TNFR∶Fc 6或18小时。处理后的TNFR∶Fc是通过铜的加入，然后是HIC评估的。孵育6小时后，4℃时的二硫键交换比22℃时更完全，而且在4℃处理18小时后，明显更完全(图8A和8B)。

分析规模与制备规模的L-半胱氨酸处理效率的比较。以小规模的最佳处理条件为基础，用5mM L-半胱氨酸(没有胱氨酸或EDTA)处理3mL或20L量的TNFR∶Fc(在0.2M Tris，pH8.5中为2.5mg/mL)，4℃孵育18小时，用等体积的850mM枸橼酸钠，50mM磷酸钠，pH6.5稀释，从而终止处理，并进行HIC层析。制备和分析规模的TNFR∶Fc对照样品分别具有63％和68％的#3级分。用上述条件处理后，制备和分析规模中的#3级分都降至28％。因此，对于制备型和分析型样品而言，处理效率分别为56％和59％(表2)。该实验证实了该方法适于大规模处理。

                         表2

            分析与制备规模的二硫键交换过程

              制备                     分析

          #2级分    #3级分    #2级分    #3级分

对照       37％      63％      32％      68％

交换       72％      28％      72％      28％

交换“效率”                    56％                59％

因此，虽然处理的氧化还原效率受游离硫醇的浓度，温度和时间的影响，但它也可在较宽范围的变量条件下有效最佳化并进行。该处理方案还可再现性地的，小规模和大规模地进行。

本发明的范围不受此处所述具体实施方案的限制，具体实施方案仅仅是为了举例说明本发明的各个方面，而且功能等同的方法和组合物也在本发明的范围之内。事实上，除了此处所示和描述的那些外，根据前面的描述和附图对本发明进行的各种改进对于本领域那些技术人员来说是显而易见的。这种改进也落在权利要求的保护范围内。

Claims (55)

1.一种方法，包括：使哺乳动物细胞产生的重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂在约pH 7-11时接触，并分离具有所需构象的重组蛋白制备物的级分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白含有至少两个结构域。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白的至少一个结构域具有稳定的构象，且所述蛋白的至少一个结构域具有不稳定的构象。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白含有受体的胞外结构域。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白是TNF-受体的可溶形式。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白是Fc融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组蛋白制备物是从蛋白A或蛋白G柱纯化的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白选自可溶性IL-4受体，可溶性IL-1 II型受体，可溶性Flt3配体，可溶性CD40配体，CD39，CD30，CD27，TEK/Ork，IL-15，可溶性IL-15受体，0x40配体，GM-CSF，RANKL，RANK，TRAIL，可溶性TRAIL受体，组织纤溶酶原激活剂，因子VIII，因子IX，载脂蛋白E，载脂蛋白A-I，IL-2受体，IL-2拮抗剂，α-1抗胰蛋白酶，降钙素，生长激素，胰岛素，促胰岛激素，胰岛素样生长因子，甲状旁腺激素，干扰素，超氧化物歧化酶，胰高血糖素，红细胞生成素，抗体，葡糖脑苷脂酶，Fc-融合蛋白，珠蛋白，神经生长因子，白介素，和集落刺激因子。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述pH约为7-10。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述pH约为7.6-9.6。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述pH约为8.6。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述还原/氧化偶联剂包括谷胱甘肽。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述还原谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽的比例约为1∶1-100∶1。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述还原/氧化偶联剂包括半胱氨酸。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤进行约4-16小时。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤是在约25℃时进行的。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤是在约4℃时进行的。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤是通过酸化终止的。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包括一个或多个层析步骤。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白的浓度约为0.5-10mg/ml。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述还原/氧化偶联剂中的还原硫醇与蛋白中的二硫键的比例约为320∶1-64,000∶1(还原硫醇∶二硫键)。

22.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以无菌批量形式制剂化具有所需构象的重组蛋白制备物的级分。

23.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以无菌单位剂量形式制剂化具有所需构象的重组蛋白制备物的级分。

24.根据权利要求4所述的方法，其中所需构象对受体的相关配体具有较高的结合亲和性。

25.根据权利要求5所述的方法，其中所需构象对TNF具有较高的结合亲和性。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述TNF是TNF-α。

27.一种促进糖基化重组蛋白的所需构象的方法，该方法包括使糖基化重组蛋白制备物与还原/氧化偶联剂接触足以提高所需构型异构体的相对比例的时间，所述糖基化重组蛋白制备物含有糖基化重组蛋白的至少两种构型异构体的混合物，并且测定混合物中所需构型异构体的相对比例。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖基化重组蛋白含有至少两个结构域。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述糖基化重组蛋白的至少一个结构域具有稳定的构象，且所述糖基化重组蛋白的至少一个结构域具有不稳定的构象。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖基化重组蛋白含有受体的胞外结构域。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖基化重组蛋白是TNF-受体的可溶形式。

32.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖基化重组蛋白是Fc融合蛋白。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述糖基化重组蛋白制备物是从蛋白A或蛋白G柱纯化的。

34.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖基化重组蛋白选自可溶性IL-4受体，可溶性IL-1 II型受体，可溶性Flt3配体，可溶性CD40配体，CD39，CD30，CD27，TEK/Ork，IL-15，可溶性IL-15受体，0x40，GM-CSF，RANKL，RANK，TRAIL，可溶性TRAIL受体，组织纤溶酶原激活剂，因子VIII，因子IX，载脂蛋白E，载脂蛋白A-I，IL-2受体，IL-2拮抗剂，α-1抗胰蛋白酶，降钙素，生长激素，胰岛素，促胰岛激素，胰岛素样生长因子，甲状旁腺激素，干扰素，超氧化物歧化酶，胰高血糖素，红细胞生成素，抗体，葡糖脑苷脂酶，Fc-融合蛋白，珠蛋白，神经生长因子，白介素，和集落刺激因子。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述pH约为7-10。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述pH约为8.6。

37.根据权利要求27所述的方法，其中所述还原/氧化偶联剂选自谷胱甘肽，半胱氨酸，DTT(二硫苏糖醇)，2-巯基乙醇和二硫硝基苯甲酸盐。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述还原/氧化偶联剂包括还原谷胱甘肽。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述还原谷胱甘肽的浓度约为1mM-10mM。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述还原/氧化偶联剂包括还原半胱氨酸。

41.根据权利要求37所述的方法，其中还原/氧化偶联剂中的还原硫醇与蛋白中的二硫键的比例约为320∶1-64,000∶1(还原硫醇∶二硫键)。

42.根据权利要求27所述的方法，其中所述蛋白的浓度约为0.5-10mg/ml。

43.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触步骤进行约4-16小时。

44.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触步骤是在约25℃时进行的。

45.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触步骤是在约4℃时进行的。

46.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触步骤是通过酸化终止的。

47.根据权利要求27所述的方法，其中所述测定步骤包括一个或多个层析步骤。

48.根据权利要求27所述的方法，其中所述测定步骤包括结合反应。

49.根据权利要求27所述的方法，包括分离具有所需构型异构体的糖基化重组蛋白制备物的级分。

50.根据权利要求49所述的方法，包括以无菌单位剂量形式制剂化所需的构型异构体。

51.根据权利要求30所述的方法，其中所需构型异构体对受体的相关配体具有较高的结合亲和性。

52.根据权利要求31所述的方法，其中所需构型异构体对TNF具有较高的结合亲和性。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述TNF是TNF-α。

54.一种方法，包括将哺乳动物细胞产生的重组蛋白制剂化为无菌单位剂量形式，与还原/氧化偶联剂接触，并将其从具有不需要构象的蛋白级分中分离出来。

55.一种通过权利要求54的方法产生的TNFR∶Fc的药物组合物。

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