BG108087A - Увеличено възстановяване на активни протеини - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до методи за получаване на протеин с желаната структура и с увеличени добиви. Изобретението се отнася, по-специално до препарати за осъществяване на контакт с рекомбинантен протеин с редукционно-окислителен свързващ реагент, за време, достатъчно да се увеличи пропорционално съдържанието на желания конфигурационен изомер. а

Description

(57) Изобретението се отнася до методи за получаване на протеин с желаната структура и с увеличени добиви. Изобретението се отнася, по-специално до препарати за осъществяване на контакт с рекомбинантен про теин с редукционноокислителен свързващ реагент, за време, достатъчно да се увеличи пропорционално съдържанието на желания конфигурационен изомер.

претенции

Bx. No 108087 / 13.08. 2003 г.

УВЕЛИЧЕНО ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА АКТИВНИ ПРОТЕИНИ

Тази заявка има претенция за ползата от предварителната заявка на САЩ No 60/271,033, подадена на 23 февруари 2001, чието съдържание е изложено изцяло в дадения справочен материал.

ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението е 6 областта на Въздействието (третирането) и пречистването на протеини.

ИСТОРИЯ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Постигнати са Високи ниВа на експресия В прокариотни експресивни домакини на много протеини от евкариотен произход. ТакиВа еВкариотни протеини често се нагъват неправилно и се натрупват като неразтворими Внесени тела В прокариотната клетка - домакин. За да се получи биологически активен протеин, заловените протенини В тези Внесени тела трябВа да се разгънат и нагънат наноВо при трудни услоВия, Включително хаотропни агенти и редуциращи тиоли.

Тези проблеми могат да се избегнат при услоВие, че експресивният Вектор е бил избран правилно (например, със секреторни сигнални пептиди, и др.), еВкариотните клетъчни линии се стремят да обработват и отделят прабилно извънклетъчни еВкариотни протеини като разтворими продукти.

Обаче, тъй като експресивните системи и Вектори са били подобрени, за да се увеличат максимално експресивните нива от еВкариотни клетки - домакини, не Всички рекомбинантни протеини, експресирани и отделени от тези клетки-доманини са желаната най актиВна форма. Изобретението е предвидено да преодолее тези проблеми на експресия и максимално да се увеличи добиба на биологично активен протеин.

КРАТКО ИЗЛОЖЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението се осноВаВа отчасти на откритието, че не Всички препарати от рекомбинантен протеин, който е експресиран от еВкариотните клетки - домакини, са нагънати 6 естестВена третична структура. ОсВен тоВа беше открито, че областите или домените на рекомбинантните протеини може да са прабилно нагънати, докато други области или домени могат да имат нежелателна структура. Съответно, изобретението представя в един аспект метод за контакт с препарат на рекомбинантен протеин, които съдържа смес от поне два изомера на рекомбинантния протеин до редукционноокислителен свързващ реагент в достатъчно време, за да се увеличи относителната пропорция на желания структурен изомер и определящ относителната пропорция на желания структурен изомер в сместа. В друг аспект, изобретението засяга взаимодействието с препарат на рекомбинантен протеин, който е получен от клетки на бозайник с редукционноокислителен свързващ реагент, при pH от 7 до около 11, и изолирайки фракция на препарата от рекомбинантен протеин с желаната структура. Препод почитани рекомбинантни протеини са гликозилирани рекомбинантни протеини, например, като получените от евкариотни клетки. Изобретението се отнася също до методи за определяне на състава на получените препарати във форма на единична стерилна доза и състави, получени чрез методите на изобретението.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ фиг. 1. Хроматография на хидрофобно взаимодействие (HIC) на TNFR:Fc. Този препарат на TNFR:Fc дава по време на

HIC три ясно очертани върха, получени за фракция #2 и фракция #3, както е посочено.

з фиг. 2. Кръгов двуцветен анализ на фракции #2 и #3. Измерванията на близкия go UV кръгов двуцветен анализ, изразени чрез средната остатъчна елиптичност, са показани на фиг. 2. фигура 2А представя спектралните данни. Линията за фракция #3 е най-близката до стрелката, сочеща отрицателното отместване с около 270 пт, дължащо се на влиянието на бисулфида, а линията за фракция 2 е по-тъмната плътна линия, фиг. 2В представя отнасящите се към кривата данни за фракция #2 (линия с малки тирета) и за фракция #3 (линията с по-големи тирета).

фиг. 3. Определянето на молекулното тегло с изключваща по големина on-line хроматография (SEC), последователно откриване с ултравиолетово лъчение (UV), разсейване на светлината (LS) и показателя на пречупване (RI) (On-line SEC/UV/LS/RI). фигура ЗА е фракция #3, а фигура ЗВ е фракция #2. Вертикалните линии с тирета показват къде е определено молекулното тегло в резенчетата в областта около главния пик.

фиг. 4. Анализ на диференциална сканираща калориметрия на фракция #2 и #3. фиг. 4А представя некоригирани данни, а фиг. 4В - коригирани данни на основната крива. Термичните преходи на топене са дадени с вертикални линии с тирета. Стрелките показват отместването на енталпията. Хоризонталните линии от точки на фиг. 4В се използваш като основна линия за справка.

фиг. 5. Корелация на фракция # 2 и свързващата активност. Шест различни препарата от TNFR:Fc (обозначени с букВи om A go F) от шест различни клетъчни линии бяха подложени на тестване за Връзка между процентното увеличение В пропорцията на фракция # 2 (тъмните ромбчета) и процентното увеличение В TNF - алфа сВързВащи единици (светлите ромбчета).

фиг. 6. Влияние на променливата цистеиноВа концентрация Върху конверсията на фракция #3 към фракция #2. Протеиновите проби бяха третирани с различни цистеиноВи концентрации (0.25-5.0 тМ), като промените във фракция #3 се оценяваха с помощта на HIC. Четири различни партиди на TNFR.Fc бяха подложени на Въздействие В продължение на 18 часа при посочената по оста X цистеиноВа концентрация. Процентното съдържание на фракция #3 ВъВ Всяка партида, която беше конвертирана ВъВ фракция #2, е представена по оста У.

фиг. 7. Влияние на цистеиноВата концентрация върху пропорцията на фракция #3. Протеиновите проби от четири различни партиди бяха подложени на Въздействието на различни концентрации на цистеин (0 - 50 тМ), като полученото ниВо на фракция #3 беше оценяВано посредством HIC.

фиг. 8. Влияние на температурата Върху бисулфидния обмен. ПротеиноВите фракции бяха подложени на въздействие за различно Време при стайна температура или 4 °C В присъстВие или при липса на мед. фигура 8А предстаВя промените В HIC фракция #3 след 6 часа, а фиг. 8В - промените

В HIC фракция #3 след 18 часа.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението предоставя методи за увеличено възстановяване на активни рекомбинантни протеини. В частност, изобретението включва промоция на желаната структура на протеина в препаратите на рекомбинантния протеин. Забележително е, че изобретението предлага фини методи за изменение на структурата на протеина, без да е необходимо да се използват груби хаотропни въздействия (като например силни денатуриращи вещества като SDS, гванидинов хидрохлорид или урея). Използването на методите на изобретението при препарати от рекомбинантен протеин има в резултат по-висок процент или по-висока относителна част на рекомбинантния протеин в препарата с желаната структура. Желаната структура на рекомбинантния протеин е тримерната структура на протеина, който най-точно наподобява и/или дуплицира функцията на естествено срещания домен на този протеин. Такива фини методи имат особено предимство, когато се предвижда рекомбинантният протеин да се използва in vivo като лекарство или биологическо средство.

Общо взето, когато рекомбинантният протеин съдържа домен на рецепторен протеин, желаната структура ще има повисок свързващ афинитет (и следователно по-малък коефициент на дисоциация) за сходен лиганд на рецептора.

Например, желаната структура на TNF-свързващата молекула ще има по-Висок сВързВащ афинитет и по-малък коефициент на дисоциация на TNF (например TNF-алфа).

ОсВен тоВа, желаната структура на рекомбинантния протеин е предпочитано по-термостабилна от нежеланата структура (когато е измерена В същата среда на разтвора). Термичната стабилност може да се измери по някой от начините, например чрез температурата на прехода топене (Тт). Желаната структура на рекомбинантния протеин може да има или не различно подреждане на бисулфидните Връзки, Въпреки, че се предпочита структурата да съдържа естестВени бисулфидни Връзки. Желаната структура на рекомбинантния протеин може да има други третични структурни характеристики. Например, желаната структура може да бъде мономер, димер, тример, тетрамер или някоя друга структура на протеина от по-Висок порядък. За целите на изобретението, “структурата” на протеина е негоВата тримерна структура. ДВе различни структури на полипептид със същите пърВични аминокиселинни последователности са структурни елементи (конфор.исри) една на друга, когато имат различни форми, съответстващи на минималната енергия и се различават една от друга само по начина, по който техните атоми са ориентирани в пространството и не са Взаимно-конВертиращи без разкъсване на ковалентната Връзка. В практиката на изобретението, конструктивните изомери могат да се конвертират взаимно по избор, например чрез прекъсване и преобразуване на бисулфидните Връзки.

Така, в един аспект, изобретението довежда до свързването на препарат на гликозилиран рекомбинантен протеин, който съдържа смес от поне два структурни изомера на рекомбинантния протеин, към редукционно-окислителния свързващ реагент за време, достатъчно да се увеличи относителната пропорция на желания структурен изомер и определящ относителната пропорция на желания структурен изомер в сместа. В друг аспект, изобретението води до свързването на препарат на рекомбинантен протеин, получен от клетки на бозайник, с редукционно-окислителния свързващ реагент, с pH от около 7 до около 11, и изолиране на фракция от препарата на рекомбинантния протеин с желаната структура. Предпочитани рекомбинантни протеини са гликозилирани рекомбинантни протеини, като например получените от евкариотни клетки.

Изобретението може да се използва за въздействие върху почти всеки протеин, за да се получи желаната структура. Обикновено се счита, че протеинът е полипептид, съдържащ най-малко около 10 аминокиселини, по-предпочитано поне около 25 аминокиселини, даже по-предпочитано поне около 75 аминокиселини, а най-пред почитано поне около 100 аминокиселини. Методите на изобретението намират особено приложение при третиране на протеини, които имат поне около 3 цистеинови остатъка, по-предпочитано поне около 8 цистеинови остатъка, даже по-предпочитано поне около 15 цистеинови остатъка, или поне 30, а най-предпочитано около 50 - 150 цистеинови остатъка.

Изобщо, методите на изобретението са полезни за подобряване на производствените процеси за рекомбинантни протеини. Рекомбинантните протеини са протеини, получени в процис на генно инженерство. Понятието “генно инженерство” се отнася до всеки рекомбинантен ДНК или РНК метод, използван за създаване на клетка-домакин, която експресира ген от по-високо ниво при по-ниски нива и/или мутантна форма на гена. С други думи, клетката е била трансфектирана, трансформирана или видоизменена с рекомбинантна полинуклеотидна молекула и променена така, че да накара клетката да промени експресията на желания протеин. Методи и Вектори за генно инженерни клетки и/или клетъчни линии за експресия на протеин, който е предмет на интерес, са добре познати на специалистите В тази област, например, показани са различни методики 6 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988 u 6 тримесечните съобщения) u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Издание на Laboratory Cold Spring, 1989). Методиките на генното инженерство ВключВат, но не са ограничени до експресивните Вектори, предвидени за хомоложна рекомбинация и генна активация (Вижте, например, US патент No. 5,272,071 на Chappel) и трансактиВация чрез инженерни описващи фактори (Вижте, например, Segal et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(6): 2758-63).

Изобретението намира особено приложение за подобряване получаването на гликолизирани протеини. Поспециално, протеините, които се отделят от гъбични клетъчни системи (например дрожди, нишковидни гъби) и от клетъчни системи на бозайници, ще бъдат гликозилирани. Предпочита се протеините да се отделят от продуктивни клетки на бозайници, приспособени да растат в клетъчна култура. Примери за такива клетки, използвани обикновено в професията, са СНО, VERO, ВНК, HeLa, CV1 (включително Cos), MDCK, 293, ЗТЗ, клетъчни линии на миелома (особено миши), клетки на .|*С12 и W138. Особено предпочитани клеткиw домакини са от яйчниците на китайски хамстер (СНО), които са използвани широко за получаване на няколко комплексни рекомбинантни протеини, например, цитокини, съсирващи фактори и антитела (Brasel et al., 1996, Blood 88:2004-2012; Kaufman et al., 1988, J. Biol Chem 263: 6352-6362; MacKinnon et al., 1991. J. Mol Endokrinol 6:231-239; Wood et al., 1990, J. Immunol 145:3011-3016). Дехидрофолатната редуктаза (DHFR), непълната мутантна клетъчна линия (Urlaub et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220), DHB11 u DG-44 са CHO ca избрани линии от клетки-домакини, защото ефективната избираема и увеличаваща DHFR генна експресивна система позволява високо ниво на експресия на рекомбинантния протеин в тези клетки (Kaufman R.J., 1990, Meth Enzymol 185:527-566). ОсВен това, тези клетки се манипулират лесно като адхезионни или суспензионни култури и показват добра генетична стабилност. Клетките СНО и рекомбинантните протеини, експресирани в тях, са характеризирани широко и са били одобрени от регулиращите агенции за използване в клиничното производство.

Чий-и·'

Беше установено, че изобретението е фин и ефективен процес на подобряване на процеса за получаване на протеини, които да могат да приемат многообразни форми и/или да съдържат повече от един домен. “Доменът” е близка област на полипетидната верига, която приема особена третична структура и/или има специфична активност, която може да бъде локализирана в тази област на полипетидната верига. Например, един домен на протеина може да има свързващ афинитет за един лиганд, а друг домен на протеина може да има свързващ афинитет за друг лиганд. От термостабилна гледна точка, един домен може да се отнася към обща разгъваща се единица на протеин. Такива протеини, които съдържат повече от един домен, могат да се намерят в естествен вид, като един протеин или получен генетически в резултат на спояване на протеин. Освен това, домените на полипептида могат да имат подразделения.

В един аспект, методите и изобретението могат да се използват за изготвяне на рекомбинантни протеини, в които поне един домен на протеина има стабилна структура и поне един домен има нестабилна структура. Понятията “стабилна” или “нестабилна” структура се използват като относителни понятия. Доменът на протеина със стабилна структура ще има например по-висока температура на топене (Тт) от нестабилния домен на протеина, когато се измерва в същия рязтвор. Доменът е стабилен в сравнение с друг домен, когато разликата в температурата на топене (Тт) е поне около 2 °C, за предпочитане около 4 °C , още по за предпочитане около 7 °C, дори още no за предпочитане около 10 °C или 15 °C, или 20 °C или даже 25 °C, и най за предпочитане около 30 °C, когато са измерени в същия разтвор.

Изобретението се прилага също най-общо към протеини, които имат Fc домен и към друг тип домен (например, антитела и Fc протеини за слепВане). Например, 6 едно от неограничените приложения, дадени по-долу, TNFR;Fc, температуратурите на топене Тт за Fc са 69.1 °C и 83.4 °C, докато температурата на топене за частта от молекулата на TNFR Варират от 52.5 °C (В най-желаната структура) до 49.7 °C (В най-нежеланата структура).

Особено предпочитани протеини са лекарствата, базирани на протеини, известни също като биологически средства. Предпочита се протеините да се експресират като извънклетъчни продукти. Протеини, които могат да се получат чрез използване методите на изобретението, включват, но не са ограничени до лиганд flt3 (както е описан в WO 94/28391, Включен изцяло тук за справка), а лиганд CD40 (както е описан в US 6,087,329, включен изцяло тук за справка), еритропоетин, тромбопоетин, калцитонин, Fas лиганд, лиганд за рецепторен актиВатор на NF-kappa В (RANKL), туморен некротизиращ фактор (ТКР)-свързан апоптозис-индуциращ лиганд (TRAIL, както е описан в WO 97/01633, който е включен изцяло тук за спраВка), тимол-строма производна лимфопоетин, гранилоцитен стимулиращ колония фактор, гранилоцитен-макрофаг стимулиращ колония фактор (GM-CSF, както е описан В Австралийски Патент No 588819, който е включен изцяло тук за справка), фактор на растежа на стълбови клетки, фактор на растежа на клетки от стъблото, епидермален фактор на растежа, RANTES, хормон на растежа, инсулин, инсулинотропин, инсулиноподобни фактори на растежа, паратироиден хормон, интерферони, фактори за растежа на нерви, глюкагон, интерлевкини от 1 до 18, стимулиращи колония фактори, лимфотоксин-β, туморен некротизиращ фактор (TNF), инхибиторен фактор на левкемия, w онкостатин-М и различни лиганди за клетки на повърхностни молекули ELK и Нес (като лиганди за epf-свързани кинази или LERKS). Описание на протеини , които могат да се пречистят с методите на изобретението, могат да се намерят например в Human Cytokines: Handbook for Clinical Research, Vol. II (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993; and The Cytokine Handbook (A. W. Tompson, ed., Academic Press San Diego, Ca, 1991).

Препарати от рецептори, особено разтворими форми на рецепторите, за всеки от горепосочените протеини, могат да бъдат подобрени също като се използват методите на изобретението, включително двете форми на TNFR (споменати на стр. 55 и стр. 57). Рецептори Интерлевкин-1 видове I и II (както са описани в ЕР 0 460 846 , US 4,968,607, и US 5,767,064, който са включени изцяло тук за справка), рецептор Интерлевкин-2, рецептор Интерлевкин-4 ( както е описан в ЕР 0 367 566 и US 5,856,296, които са включенш тук изцяло за спраВка), рецептор ИнтерлеВкин-15, рецептор ИнтерлеВкин-17, рецептор Интерлевкин-18, рецептор на гранилоцитен-макрофаг стимулиращ колония фактор, рецептор на гранилоцитен стимулиращ колония фактор, рецептори за онкостатин-М и левкемия инхибиторен фактор, рецептор активатор на NF-kappa В (RANK, както е описан В US 6,271,349, който е Включен тук изцяло за спраВка), рецептори за TRAIL (Включително рецептори TRAIL 1, 2, 3 и 4) и рецептори, които ВключВат мъртВи домени, като Fas или Apoptosis Inducing Receptor (AIR).

Други протеини, чиито продуктивни процеси могат да се подобрят чрез използване на методи на изобретението, ВключВат група от диференциионни антигени (наричани CD протеини), например, описаните 6 Leukocyte Typing VI (Работата на VI-тия Международен семинар и конференция; Kishimoto, Kikutani et al., издатели; Kobe, Japan, 1996), или CD молекули, разгледани на следващите семинари. Примери за такива молекули ВключВат CD27, CD30, CD39, CD40; и лигандите тук (лиганд CD27, лиганд CD30 и лиганд CD40). Някои от тях са членоВе на семейство рецептори TNF, които ВключВат също и 41ВВ и 0X40; лигандите често са членове на семейство TNF (както са например лиганд 41ВВ и лиганд 0X40); съответно, членове на семейства TNF и TNFR могат да се получат също с помощта на настоящото изобретение.

Протеините, които са ензимно активни, също могат да се изготвят според настоящото изобретение. Примери ВключВат членоВе на семейства на металопротеиназа-дисинтегрин, различни кинази, глюкоцереброцидаза, супероксидна дисмутаза, лазминогеней активатор на тъкани, фактор VIII, фактор IX, аполипопротеин Е, аполипопротеин А-Ι, глобинс, антагонист IL-2, алфа-1 антитрипсин, TNF-алфа конвертиращ ензим и много други ензими. Лигандите за ензимно активните протеини също могат да се експресират чрез използване на това изобретение.

Съединенията и методите на изобретението са полезни също за изготвяне на друг вид рекомбинантни протеини, включително молекули на имуноглобин, или на части от тях и химерични антитела (например, антитяло, което има човешка постоянна област, свързана към свързваща област на миши антиген) или с фрагменти от него. Известни са много методики, чрез които ДНК кодиращи имуноглобулинови молекули могат да бъдат манипулирани, за да се получи ДНК, способна да кодира рекомбинантни протеини, като антитела с единична верига, антитела с с увеличен афинитет или други полипептиди, базирани върху антитяло, (вижте, например, Larrick et al., 1989, Biotechnology 7:934-938; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Roberts et al., 1987, Nature 328:731-734; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536; Chaudhary et al., 1989, Nature 339:394-397). Препарати само от човешки антитела (такива, които са приготвени използвайки трансгенични животни и по избор модифицирани по-нататък ин виво), както и хуманизирани антитела, също могат да се използват в изобретението. Понятието хуманизирано антитяло също съдържа антитела с единична верига. Вижте, например, Cabilly et al.., U.S. Pat. No 4,816,567; Cabilly et al., European Patent No 0,125,023 Bl; Boss et al., U.S. Pat. 4,816,397; Boss et al., European Patent No 0,120,694 Bl; Neuberger, M.S. et al.fNO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., European Patent No 0,194,276 Bl; Winter, U.S. Pat. No 5,225,539; Winter, European Patent No 0,239,400 Bl; Queen et al., European Patent No 0,451,216 Bl; and Padlan, E. A. et al., EP 0 519 596 Al. Методът на изобретението може да се използва също при приготвянето на конюгати, съдържащи антитяло и цитотоксично или луминесцентно вещество. Такива вещества съдържат: мейтанзинови производни (като DM1); ентеротоксини (като стафилококов ентеротоксин); изотопи на йод (като йод-125); изотопи на технеций (като Тс99т); цианинов флуорохром (като Су5.5.18); и рибозомни неактивирани протеини (като буганин, гелонин или canopuH-S6).

Примери за антитела или конюгати на антитяло/цитоксин или антитяло/луминифор, разгледани в изобретението, включват онези, в които се признава някой или комбинация от описаните по-горе протеини и/или следните антигени: CD2, CD3, CD4, CD8, CDlla, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (В7.1), CD86 (В7.2), CD147, IL-la, IL-Ιβ, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 рецептор, IL-4 рецептор, IL-6 рецептор, IL-13 рецептор, IL-18 рецептор, подединици PDGF- β, VEGF, TGF, TGF- β2, JGF- βΐ, EGF рецептор, VEGF рецептор, C5 допълнение, IgE, туморен антиген CA125, туморен антиген MUC1, РЕМ антиген, LCG (който е генен продукт, експресиран във връзка с рак на белия дроб), HER-2, свързания с тумор гликопротеин TAG-72, SK-1, свързаните с тумор епитопи, които се намират β повишените нива в група пациенти с рак в колона и/или панкреаса, свързаните с тумор епитопи или протеини, експресирани върху гърдите, колона, клетките на люспестия епител, простата, панкреаса, белия дроб, и/или рак на бъбреците, и/или меланома, глиома, или клетките на невробластома, некротичната сърцевина на тумор, интегрин алфа 4 бета 7, интегрин VLA-4, В2 интегрини, TRAIL рецептор!., 2, 3 и 4, RANK, RANK лиганд, TNF-α, адхезионната молекула VAP-1, епителната клетка на адхезионната молекула (ЕрСАМ), междуклетъчната адхезионна молекула-3 (ICAM-3), левкоинтегрин адхезин, тромбоцит гликопротеин gp ПЬ/Ша, кардио-миозин тежка верига, паратироиден хормон, rNAPc2 (който е инхибитор на фактор VIIa-тъканен фактор)р МНС I, карциноембрионален антиген (СЕА), алфа-фетопротеин (AFP), туморен некротизиращ фактор (TNF), CTLA-4 (който е цитоксик Т лимфоцит-свързан антиген), Fc-γ-Ι рецептор, HLA-DR 10 бета, HLA-DR антиген, L-селектин, IFN- γ, респираторен синцитиален вирус, човешки имилимоларунодефицитен вирус (HIV), вирус на хепатит В (HBV), Стрептококи мутанс и Стафилококи ауреус.

Препарати на различни протеини за свързване също могат да се приготвят с използване на методите на изобретението. Примери за такива протеини за слепване включват протеини, експресирани като като присъединени към част от молекулата на имуноглобулин, протеини, експресирани като протеини за слепване със зипер група, и най-нови многофункционални протеини, като протеини за слепване на цитокин и фактор на растежа (т.е. GM-CSF u IL-3, MGF и IL-3). WO 93/08207 и WO96/40918 описват приготвянето на различни разтворими олигомерни форми на молекула, дадена като CD40L, включително имуноглобулинов протеин за слепване и съответно зипер протеин за слепване; обсъжданите тук методики са приложими към други протеини. Всяка от горните молекули може да се експресира като протеин за слепване, включително, но не ограничено до извънклетъчния домен на клетъчната молекула на рецептора, ензим, хормон, цитокин, част он молекула на имуноглобулин, зипер домен и епитоп.

Препаратът от рекомбинантен протеин може да бъде клетъчна култура, плаваща на повърхността, клетъчен екстракт, но се предпочита частично пречистена фракция на същия. “Частично пречистена” означава, че е извършена някаква разделителна процедура или процедури, но че има повече полипептидни видове (поне 10%) от желания протеин или протеинова структура. Едно от предимствата на методите на изобретението е, че препаратът от рекомбинантен протеин може да бъде с доста висока концентрация. Предпочитани концентрации са от 0.1 до 20 mg/ml. попредпочитани са от 0.5 до 15 mg/ml, а още по-предпочитани са от 1 до 10 mg/ml.

Препаратът от рекомбинантен протеин може да се приготви отначало с отглеждане на рекомбинантни клеткидомакини при условия на култура в петри, подходяща за експресиране на полипептида. Полипептидът може да се експресира също като продукт на трансгенични животни, т.е.

като компонент в млякото на трансгенични крави, кози, прасета или ови,и, които се характеризират със соматични или със зародишни клетки, съдържащи нуклеотидна последователност, кодираща полипептида. Полученият в резултат експресиран полипептид може да се пречисти след това или да се пречисти частично, от такава култура или компонент (например, от средата на култура или клетъчни екстракти или телесен флуид) с използване на познати процеси. Г Разделителните процедури могат да включват, но не са ’'Шие* ограничени до една или повече фази на филтрация, центрофугиране, утаяване, фазово разделяне, афинитетно пречистване, филтрация на гел, йонно-обменна хроматография, хроматография на хидрофобно взаимодействие (HIC; използвайки такива смоли като фенилов етер, бутилов етер, или пропилов етер), HPLC, или някои комбинация на горните вещества.

Например, пречистването на полипетида може да включва афинитетна колона, съдържаща агенти, които ще се свържат с полипетида, една или повече колонни фази над такива афинитетни смоли, като конканавалин А-агароза, хепаринтойопърл^ или Цибахром син 3 GA СефарозаА една или повече фази, водещи до отмиване и/или имуно афинитетна хроматография. Полипетидът може да се експресира във форма, която улеснява пречистването. Например, той може да се експресира като слепващ полипептид, от рода на малтоза свързващ полиптид (МВР), глутатион-Б-трансфераза (GST) или тиоредоксин (TRX). Набори (китове) за експресиране и пречистване на такива слепващи полипетиди могат да се закупят от Биолабораторията в Нова Англия (Бевърли, Масачузетс), фармация (Пискатауей, Ню Джърси) и съответно Инвитроген. Полипетидът може да бъде белязан с епитоп и след това пречистен, като се използва специфично антитяло, насочено към този епитоп. Такъв епитоп (FLAG^) може да се намери в търговската мрежа от Кодак (Ню Хейвън, Кънектикът). Възможно е също да се използва афинитетна колона, съдържаща полипетид-свързващ полипептид, като моноклонално антитяло към рекомбинантен протеин, към афинитетно-пречистващо експресирани полипептиди. Други видове афинитетно-пречистващи фази може да бъде колона с Протеин А или Протеин G, чиито афинитетни агенти се свързват към протеините, които съдържат Fc домени. Полипептидите могат да се отстранят от афинитетната колона с прилагане на конвенционална методика, например, в силно солен отмиващ буфер и след това подложен на диализа в по-слабо осолен буфер за използване или с изменение на pH или други компоненти, зависещи от използваната афинитетна матрица или може да бъде съответно отстранен с използването на естествено срещащия се субстрат на афинитетна група. В едно от приложенията на изобретението, дадено по-долу, препаратът от рекомбинантен протеин е бил частично пречистен в афинитетна колона с Протеин А.

Някои или всички от горепосочените фази на пречистване, в разнообразни комбинации, могат да се използват за приготвяне на подходящ препарат на рекомбинантен протеин за използване В методите на изобретението, и/или за следващо пречистване на рекомбинантния полипептид след контакта между препарата на рекомбинантния протеин и редукционноокислителния сВързВащ реагент. Полипептидът, който съдържа малко други полипетиди от бозайници, се дефинира като “изолиран полипептид”.

Полипептидът може да се получи още с известния конвенционален химичен синтез. Методи за конструиране на полипептиди по синтетичен път са известни на специалистите в тази област. Синтетично-създадените полипептидни последователности могат да се гликолизират ин Витро.

Желаната степен на крайната чистота зависи от предвижданото използване на полипептида. Необходима е относително висока степен на чистота, когато полипептидът ще бъде предписван например ин ВиВо. В такъв случай, полипептидите се пречистват така, че да не се откриват никакви полипептидни ивици, съответстващи на други полипептиди с анализ електрофореза на SDS-полиакриламидоВ гел (SDS-PAGE). Специалист от съответната област ще признае, че много иВици, принадлежащи на полипептида, могат да се видят с SDS-PAGE, поради диференциално гликолизиране, диференциално след-транслационно обработване и други. Наймного се предпочита полипептидът от изобретението да се пречисти до значителна хомогенност, както се посочва от единична полипептидна ивица при анализ с SDS-PAGE. Полипептидната иВица може да се Визуализира чрез сребърно покритие, Комаси синъо оцветяване и/или (ако полипептидът е белязан с радиоактивни атоми) с авторадиография.

“Влизане В контакт” означава подлагане или излагане на ВъздейстВие в разтвор. Протеинът или полипептидът могат да влезат в контакт също и когато са свързани с твърд;) опора (например, афинитетна колона или хроматографски матрица. Предпочита се разтворът да бъде буферен. За да се увеличи до максимум добивът на протеин с желаната структура, pH на разтвора се избира да защити стабилността на протеина и да бъде оптимално за бисулфидния обмен. В практиката на изобретението, pH на разтвора е предпочитано не силно киселинно. Така, предпочитаните стойности на pH са по-големи от pH 5, предпочита се около pH 6 до около pH 11, повече се предпочита от около pH 7 до около pH 10, още повече се предпочита от около pH 7.6 до около pH 9.6. В едно неограничено приложение на изобретението с използване на TNFR.Fc, което е показано по-долу, оптималното pH беше определено, че е около pH 8.6. Обаче, оптималното pH за определено приложение на изобретението може да се определи лесно експериментално от специалистите в тази област.

Редукционно-окислителният свързващ реагент е източник на редуциращи агенти. Предпочитани редуциращи агенти са свободните тиоли. Редукционно-окислителният свързващ реагент обикновено се съдържа в съединение от групата, състояща се от редуцирани и окислени глутатион, дитиотрейтол (DTT), 2-меркаптоетанол, дитионитробензоат, цистеин и цистин. За лесно използване и икономия могат да се използват редуциран глутатион и/или редуциран цистеин.

Редукционно-окислителният свързващ реагент има концентрация, достатъчна да увеличи относителната пропорция на желаната структура. Оптималната концентрация на редукционно-окислителния свързващ реагент зависи от концентрацията на протеина и броя на бисулфидните връзки в протеина. Например, беше установено използвайки протеин (TNFR:Fc) с 29 бисулфидни връзки при концентрация 2 mg/ml (приблизително 14 микроМ протеин или 400 микроМ бисулфид), редукционно-окислителният свързващ реагент с 2 тМ редуцирани тиоли се справи добре за увеличаване на относителната пропорция на желаната структура. Това съответства на отношението на около 35 свободни тиоли към 1 бисулфидна връзка. Обаче, беше намерено също, че отношението от 20 до 400 свободни тиоли към бисулфида също може да се използва. Разбира се, количеството на използвания тиол за дадена концентрация може да се изменя някак в зависимост от редуциращия капацитет на тиола и може лесно да се определи от специалист в тази област.

Така, общо взето, концентрацията на свободните тиоли от редукционно-окислителния свързващ реагент може да бъде от около 0.05 тМ до около 50 тМ, по за предпочитане около 0.1 тМ до около 25 тМ, и още повече за предпочитане около 0.2 тМ до около 20 тМ.

Освен това, редукционно-окислителният свързващ реагент може да съдържа окислени тиоли при приблизително по-висока, равна или по-ниска концентрация от тази на редуцирания тиолов компонент. Например, редукционноокислителният свързващ реагент може да бъде комбинация от редуциран глутатион и окислен глутатион. Беше установено чрез примери, че откошението на редукционно-окислителния свързващ реагент към окислен глутатион е от около 1:1 до около 100:1 (редуцирани тиоли към окислени тиоли) може да функционира еднакво добре. Алтернативно, в друго приложение редукционно-окислителният свързващ реагент може да бъде цистеин или комбинация от цистеин и цистин. Така, когато окислени тиоли са включени в началния редукционноокислителен свързващ реагент, отношението на редуцираните тиоли към окислените тиоли може в предпочитано приложение да бъде от около 1:10 до около 1000:1, по предпочитано около 1:1 до около 500:1, а още по-предпочитано около 5:1 до около 100:1, дори по-предпочитано около 10:1.

Контактуването на препарат от рекомбинантен протеин с редукционно-окислителен свързващ реагент става в достатъчно време, за да се увеличи относителната пропорция на желаната структура. Желателно е всяко увеличение в пропорцията, но за предпочитане е поне 10% от протеина с нежелана структура да се превърне в протеин с желана структура. По за предпочитане е поне 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% и даже 80% от протеина да се превърне от нежелана до желана структура. Обикновените добиви, които са постигнати с методите на изобретението, се нареждат от 40% до 80%. Ако фазата на контакт се извърши върху частично или силно пречистен препарат на рекомбинантен протеин, фазата за контакт може да се извърши за по-малко от час до около 4 часа и най-много от около 6 ч до около 4 дни. Установено е, че фазата за контакт от около 4 до около 16 часа или 18 часа е добра. Контактната фаза може да се извърши по време на друга фаза, като например твърда фаза или по време на филтриране или друга фаза на пречистването.

Методите на изобретението могат да се използват в широк температурен интервал. Например, методите на изобретението са били използвани при температури от около 4 °C до около 37 °C, обаче, най-добри резултати са постигнати при по-ниски температури. Типична температура за контактуване с частично или напълно пречистен препарат на рекомбинантен протеин е от около 4 °C до около 25 °C (на околната среда), но методите могат да се прилагат и при пониска и по-висока температура.

Препаратът на рекомбинантен протеин може да влиза в контакт с редукционно-окислителния свързващ реагент в различни обеми, както се случи. Например, методите на изобретението са прилагани успешно при аналитични лабораторни скали, (1 - 50 mL), подготвителни скали (50 mL - 10 L) и при производствени скали (10 L или повече). И така, методите на изобретението могат да се прилагат и при малки и при големи скали с повторяемост.

В предпочитани аспекти, фазата на контакт се изпълнява в отсъствие на значителни количества на хаотропни агенти, като например, SDS, урея и гванидинов НС1. Необходими са значителни количестВа от хаотропни агенти, за да се наблюдава забележимо разгъване. Изобщо, има налично помалко от 1 М хаотропно вещество, no-за предпочитане е хаотропно вещество по-малко от 0.1 М. Разтворът обикновено не съдържа хаотропно вещество (например SDS, урея и гванидинова НС1), когато не са добавяни нарочно хаотропни вещиства към разтвора, и може да има само следи (т.е. по-малко от 10 тМ) (например от съда или като клетъчен страничен продукт).

Бисулфидният обмен може да бъде охладен по някой начин, известен на специалистите в тази област. Например, може да се отстрани редукционно-окислителния свързващ реагент или неговата концентрация може да се намали чрез фаза на пречистване, и/или може да се инактивира химически, например е подкисляване на разтвора. Обикновено, когато реакцията е охладена чрез подкисляване, pH на разтвора, съдържащ редукционно-окислителен свързващ реагент, ще бъде намалено под pH 7. Предпочита се pH да се намали go pH 6. Изобщо, pH се намалява между pH 2 и pH 7.

Определяето на структурата на протеина и относителните пропорции на структурата на протеина в смес, може да се направи с някоя от многобройните аналитични и/или качествени методики. Ако има разлика в активността между структурите на протеина, определянето на относителната пропорция на структурата в сместа може да се направи чрез активността на проба (например, свързвайки я към лиганд, ензимна активност, биологическа активност и др.). Например, β едно от неограничените приложения, описани по-долу, поне две различни структури на TNFR:Fc биха могли да се установят като се използВа тВърда фаза на TNF сВързВащата проба. Пробата, особено както е описана за IL-1R (Slack, et al.,1993, J. Biol. Chem. 268:2513-2524), може да се диференцира между относителните пропорции на различни протеинови структури чрез промени В лиганд-рецепторната Връзка на асоциация, дисоциация или инхибиране на създадените константи. По друг начин казано, резултатите от свързването могат да се изразят като единици/mg актиВност на протеина.

Ако две структури се разделят различно по време на хроматография, електрофореза, филтриране или чрез друга методика на пречистване, тогаВа относителната пропорция на структурата В смес може да бъде определена с такиВа методики на пречистване. Например, В неограничените приложение, описани по-долу, най малко дВе различни структури на TNFR:Fc биха могли да се установят чрез използване на хроматография на хидрофобно Взаимодействие. По-нататък, понеже далечцият-UV кръгоВ дихроизъм е бил използван за оценка на вторичния структурен състаВ на протеини (Pcrczel et al.,1991, Protein Engrg. 4:669-679), c makaBa методика може да се определи дали има налични алтернатиВни структури на протеина. Друга методика за определяне на структурата е флуоресцентната спектроскопия, която може да се използВа, за да се установят допълнителни разлики в третичната структура, които се приписВат на флуоресценцията на триптофан и тироизин. Други методики, които може да се използват за определяне на разликите в структурата и следователно в относителната пропорция на структурата са on-line SEC за измерване на на състоянието на агрегация, диференциално сканираща калориметрия за измерване на преходите на топене (Тт) и енталпиите на компонентите и хаотропното разгъване.

Понятието “изолиране” означава физическо разделяне на поне един компонент в смес от други компоненти в сместа. Изолиране на компоненти или на определени структури на протеина може да се постигне като се използва някой метод на пречистване, който има тенденция да раздели тези компоненти. Могат да се извършат съответно една или повече хроматографски фази, включително, но не ограничено go HIC, хидроксиапатитна хроматография, йонно-обменна хроматография, афинитет и SEC. Други методи на пречистване са филтрация (например, филтрация на тангенциален поток), методики за електрофореза (например, електрофореза, електро-отмиване, изоелектрично фокусиране) и фазово разделяне (например, PEG-декстраново фазово разделяне), да споменем просто няколко. В допълнение, фракцията от препарата на рекомбинантен протеин, която съдържа протеин с нежелана структура, може да се третира също с методите на изибретението, за да се оптимизира след това добива на протеин с желаната структура.

Например, след третиране пробите на протеина могат да се подготвят за хроматография на хидрофобно взаимодействие със следния метод. Равен обем от 850 тМ от натриев цитрат, mM натриеВ фосфат, pH 6.5 се добавя към третираната проба и се оставя да достигне стайна температура. След филтриране (например, използвайки филтър No. 0.22 т), се извършва хроматография HIC на смола Тойопърл^ бутил 650-М (Tosoh Biosep LLC, Монтгомеривил, Пенсилвания), при скорост на потока 150 cm/h и масов товар от 2.1 mg/mL смола'¹. Колоната е предварително уравновесена с три обемни единици от 425 тМ натриев цитрат, 50 тМ РО₄ pH 6.5, пробата се зарежда и след това се промива с 3 колонни обема от 425 тМ натриев цитрат, 50 тМ РО₄ pH 6.5. Промиването може да се направи с градиент от 425 тМ натриев цитрат, 50 тМ РО₄ pH

6.5 до 0 тМ натриев цитрат, 50 тМ РО₄ pH 6.5 в общо 5 колонни обема. По време на промиването могат да се съберат фракции. Колоната може да се отмие с 3 колонни обема от 0.1М NaOH. Използвайки методите на изобретението, могат да се получат препарати на TNFR.Fc, които съдържат повече от 85%, 90% и даже повече от 95% от TNFR:Fc, намиращ се в препарата от най-активната структура (фракция #2). Състави, включително фармацевтически състави на TNFR:Fc, съдържащи такива пропорции на фракция #2, се осигуряват следователно също от изобретението.

Изобретението описва също по избор следните състави на протеините. С понятието “формулиране на състава” се означава, че протеините могат да се обменят буферно, да се стерилизират, да се пакетират в насипно състояние, и/или да се пакетират за крайния потребител. За целите на изобретението, понятието “стерилна насипна форма” означава,

че съставът не съдържа микробно замърсяване (до такава степен, която е приемлива за храни и/или лекарствени цели), и е с определен състав и концентрация. Понятието “единична стерилна доза” означава форма, която е удобна за предписване или консумиране от клиента и/или пациента. Такива състави могат да съдържат ефективно количество протеин в комбинация с други компоненти, като физиологически приемлив разтворител, носител, и/или инертен пълнител. Понятието “фарамацевтически приемлив” означава нетоксичен материал, който не влияе на ефективността на биологическата активност на активните съставки. Състави, подходящи за предписване, включват водни и неводни стерилни инжекционни разтвори, които могат да съдържат анти-окислители, буфери, бактериостати и разтворено вещество, които превръщат състава в изотоничен с кръвта на приемащия; водни и неводни суспенсии, които могат да съдържат суспендирани или втвърдяващи агенти. В допълнение, стерилните насипни форми и стерилните единични форми могат да съдържат малка концентрация (приблизително 1 μΜ до приблизително 10 μΜ) на редукционно-окислителен свързващ реагент, (например, глутатион, цистеин и др.). Съставът на полипептидите може да бъде формулиран съгласно известните методи, използвани за приготвяне на полезни фармацевтични съединения. Те могат да се комбинират в добавка, било като единичен активен материал или с други известни активни материали, подходящи за дадена индикация, с фармацевтически приемливи разтворители (например, солен разтвор, Tris-HCl, ацетптни и фосфатни буферни разтвори), консерванти (например, тимерозал, бензилов алкохол, парабени), емулгатори, разтворители, спомагателни вещества и/или носители. Подходящи състави за фармацевтическите съединения включват описаните в Remington”s Pharmaceutical Sciences, 16 издания 1980, Издателска компания Мак, Истън, Филаделфия. Освен това, тези състави могат да се усложнят с полиетилен гликол (PEG), с метални йони и/или с включени вешества в полимерните съединения, като полиоцетна киселина, хидрогелове, декстран и други, или внесени в липозомите, микроемулсиите, разнообразни, едноламелни или многоламелни шуплести вещества, еритроцитни ивици или сферобласти. Подходящи липиди за липозомните състави включват без ограничение моноглицериди, диглицериди, сулфиди, лизолецитин, фосфолипиди, сапонин, жлъчна киселина и подобни. Препарати от такива липозомни състави са на ниво умение в тази област, както е описано например в U.S. Патент No 4,235,871; U.S. Патент No 4,501,728; U.S. Патент No 4,837,323. Такива състави ще въздействат на физическото състояние, разтворимостта, стабилността, скоростта на отделяне ин виво и скоростта на освобождаване ин виво и ето защо са избрани според предвиденото приложение, така че характеристиката на носителя ще зависи от избрания начин на предписване. Поддържащо-освобождаващи форми, подходящи за използване, включват, но не са ограничени до полипептиди, конто са капсуловани в бавно разтварящ се биосъвместим полимер (като алгинатни микрочастици, описани в U.S. Патент No 6,036,978) смесени с такъв полимер (включително върхово използвани хидрогелове), и/или включени в биосъвместим полу-пропусклив имплантант.

След като е направено описанието на изобретението, предлагат се следните илюстриращи примери.

ПРИМЕР 1

Биофизична оценка на TNFR:Fc Фракции #2 и #3

TNFR.Fc се отделя В колона за хидрофобно взаимодействие (HIC) като се очертават ясно три върха, наречени фракция #1, фракция #2 и фракция #3 (вижте фиг.1). Фракция #2 е желаната фракция. Фракция #3 беше от особен интерес, тъй като тя обхваща от 20 до 60% от пробата и е показано, че тя демонстрира ниска TNF свързваща активност и А375 биоактивност в сравнение с фракция #2. Ето защо бяха проведени биофизични проучвания, за да се разберат разликите между тези две фракции и да се установи кои фактори допринасят за загубата на активност на фракция #3, тъй като тя се отнася до структурата и формата. В този пример ние анализирахме фракция #2 и фракция #3, използвайки кръгов дихроизъм, флуоресценция, on-line SEC/UV/LS/RL и диференциално-сканираща калориметрия (DSC).

Материали и методи:

Материали: Началният материал беше TNFR:Fc в буфер TMS (10 тМ Tris, 4% манитол, 1% захароза). Отделените от този материал фракции с HIC бяха изолирани като фракции #2 и #3 за експериментално проучване, описано по-долу.

Кръгов дихроизъм: Бяха проведени проучвания в близката област (250-440 пт) и далечната UV област (190-250 пт). Проучванията в близката UV област бяха проведени, за да се изяснят разликите в третичната структура, докато проучванията в далечната UV област бяха използвани за описване разликите във вторичната структура.

Измерванията в близката UV-област с кръгов дихроизъм бяха проведени в разтвори TMS със следните концентрации. Началният материал беше разреден до 6.25 mg/ml, докато фракции #2 и #3 бяха оценени при техните съществуващи концентрации от 9.4 и съответно 5.4 mg/ml. Беше използван кръгов дихроизъм на клетка със стъпка 0.1 cm и беше проведено сканиране от 340 до 250 пт.

Измерванията на далечната UV област с кръгов дихроизъм бяха проведени с протеинов буфер в 10 тМ натриев фосфат (pH 7.0) и оценен след това, като бе използвана стъпка 0.1 cm и клетката беше сканирана от 250 до 190 пт. Съставът на вторичната структура беше оценен с помощта на конвексен напрегнат анализ (CCA) (Perczel et al., 1991, Protein Engrg. 4:669679).

флуоресцентна спектроскопия: Пробите бяха изследвани след разреждане до приблизително 50 pg/ml, използвайки две различни възбуждащи дължини на вълните. Беше проучена флуоресценцията на тирозин и триптофан с възбуждане 270 пт, а флуоросценцията на триптофан беше оценена изключително е възбуждаща дължина на вълната 295 пт. (Lakowicz, J, R. in “Principles of Fluorescent Spectroscopy”, Plenum Press, 1983. New York, 343-343). флуоресцентното сканиране се проведе от 300 до 440 пт при възбуждане 270 пт и от 310 до 440 пт при възбуждане 295 пт. Четири последователни· сканирания бяха усреднени сигнално за всеки спектър. Нормализираните данни бяха съобщени, за да се направи оценка на разликите в честотата от пробите.

On-line-SECIUVILSIRI: Молекулните тегла на отмиваните компоненти бяха потвърдени, като бе използвана хроматография с изключване на размерите и с използване на ултравиолетови лъчи (UV @ 280 пт), разсейване на светлината (90 °) и показател на пречупване (RI) за последователно откриване. Този метод е добре документиран (вижте Arakawa et al., 1992, Anal. Biochem. 203:53-57 and Wen et al., 1996, Anal. Biochem. 240:155-166), и има предимство в измерването на негликолизирани молекулни тегла на протеини и на пептиди, които са гликозилирани. Данните от SEC и UV бяха събрани с помощта на интегрална HPLC система (PerSeptive Biosystems, Inc.) с BioSil-400-5 колона (от BioRad), при скорост на потока 1 ml/min. Промиващият буфер се състоеше от 100 тМ фосфат (pH 6.8) и 100 тМ NaCl. Един DAWN DSP детектор за разсеяна светлина под много ъгли и рефрактометър Optilab DSP бяха закупени от Wyatt Technology, Inc. Калибровъчните стандарти за определяне инструменталните константи бяха BSA димер, BSA мономер и овалбумин (фиг. 2).

Диференциално-сканираща калориметрия (DSC):

физическите свойства на разгъване бяха измерени с инструмент Microcal МС-2 DSC с горно сканиране. Пробите бяха приготвени с буфер със смесване в същия TNS буфер при pH

7.4. Пробите съдържаха протеин около 4 mg/ml и бяха оценени според буфера (липсващ протеин) за справка. Скоростта на сканиране беше 67 °C /час в температурен интервал от 20 °C до °C. Събраните данни от сканирането бяха превърнати в концентрация - нормализирани данни, за по-добро сравняване на поведението на енталпията при преходите на разгъване, като се взимат предвид разликите в концентрацията (данните са съобщени в kcal/mole).

Резултати:

Кръгов дихроизъм. Измерванията на близката UV област с кръгов дихроизъм, изразени чрез средната остатъчна елептичност, са показани на фиг. 2. Промените в широката характеристика близо до 270 пт бяха очевидни между фракция #2 и #3, както е показано с по-голямата пропорция на отрицателна елиптичност в спектъра на фракция #3 (посочена със стрелка на фиг. 2А). Беше отбелязано, че спектралното поведение на първоначалния материал съотвитства точно на това от фракция #2, но показва слабо отрицателно отместване в същата област около 270 пт. Този резултат изглеждаше съвместим, защото фракция #3 представляваше малка част от началния материал и така нейният принос към цялата елиптичност в тази област беше силно намален, но в същата посока на отклонение. Повторимостта на спектъра на фракция #3 потвърди наблюдаваното отместване в тази проба като реално. Като имаме предвид това, и като знаем, че бисулфидите създават широка негативна елиптична характеристика в тази област на спектъра на кръговия дихроизъм (вижте Kahn, Р.С., 1978, Methods Enzymol. 61:339-378 and Kosen et al., 1981, Biochemistry 20:5744-5754), спектърът на близката UV област на кръговия дихроизъм беше крива, подходяща да се направи оценка какво означават наблюдаваните промени в тази област чрез третичната структура. Резултатите от кривата (съвпадащи данни) са представени на фиг. 2В и показват малко червено преместване (3 пт) и увеличено негативно отместване, съответстващо на приноса от промяната в третичната структура с участие на бисулфиди, когато сравняваме фракция #3 с #2.

Далечният UV кръгов дихроизъм е бил използван за оценка на състава на протеин с вторична структура (Perczel et al., 1991, Protein Engrg. 4:669-679). Със CCA бяха проведени изследзвания на вторичната структура. Изчислените спектрални данни на сумата от елементите с вторична структура бяха сравнени с наблюдаваните експериментални спектри и бе установено добро съвпадение. Вторичните структури на двете фракции бяха сравними в границите на експерименталната точност (около 10%). Следователно, този опит не установи някаква разлика по отношение на вторичната структура за всяка от тези две фракции.

флуоресцентна спектроскопия. Знаейки, че има значителни разлики, наблюдавани в близката UV област на кръговия дихроизъм, беше използвана флуоресцентна спектроскопия, за да се установят допълнителни разлики в третичната структура, приписвани на флуоресценцията на триптофан и тирозин. Използвани бяха две възбуждащи дължини на вълните и така беше възможно да се установи, че спектрите за трите разглеждани случаи (SM, фракция #2 и #3) съвпадаха с максимумите на флуоресценцията близо до 338 пт.

Понеже тримерната структура на даден протеин е причина за емисионните максимуми на естествените протеини, тези резултати подсказват, че средната структура, предизвикваща съответната флуоресценция на триптофан и тирозин, не е смутена.

On-line-SEC/XJV/LS/RI. С изследванията върху разсейване на светлината, проведени on-line със SEC, бяха получени молекулните тегла на главния пик, които бяха в съгласие е молекулното тегло на TNFR:Fc (например, 102 kD). Въпреки че имаше ясно изразени различия в съставите на отделените видове, установени с тази методика, когато сравняваме профила на фракция #3 с фракция #2 (фиг. ЗА и В), главният пик, съдържащ по-голямата част от компонента, беше измерен като 102.5 +/- 1.6 kD (Задържан обем = 8.4 mL) и съответно 101.9 +/- 2.1 kD (Задържан обем = 8.3 mL). Точността беше изразена като стандартно отклонение от 23 резенчета до главния връх, отделен с линии с тирета на фиг. 3. Отбелязано беше също така, че значим сигнал от спускащото се рамо за фракция #3 позволяваше да се определи молекулното тегло на полипептида: 78.1 +/- 3.7 kD (тази оценка предвижда 8 резенчета около пика, означен е 8.85 mL). Както е посочено от точността, свързана с определяне на молекулното тегло на този компонент, този пик показва по-голяма хетерогенност и в резултат беше подозиран за по-голяма полидисперсия от главния пик.фракция #3 също съдържаше значително количество от вида с високо молекулно тегло, съответстващ на отделения обем на предоминантната форма на ТJFR:Fc (около 7.5). И така, беше установено, че фракция #3 се съдържа в няколко вида, включително агрегирани и фрагментирани части от молекулата.

Диференциално-сканираща калориметрия.

Проведените измервания DSC върху две фракции, дадоха значителни разлики при разгъването на групата TNFR от групата на молекулата TNFR:Fc (фиг. 4). Както по-ясно е показано в основните коригирани данни (фиг. 4В), има преместване от 2.8 °C към по-ниска температура на прехода топене (Тт), когато се сравнява Тт 52.5 °C (фракция #2) с Тт 49.7 °C (фракция #3). Преходът е леко разширен за фракция #3 с половин ширина и половин преход максимум с 8 °C в сравнение с фракция #2 с полу-ширина 6.5 °C. Ниско-температурният преход е идентифициран с опити за термично разгъване на мономер TNFR:Fc, който се дължи на домена TNFR в молекулата. Термичните преходи при 69.1 °C и 83.4 °C се приписват на частта Fc на молекулата. Тези последни два разгъващи прехода се подреждат добре и са сраВними чрез Тт и енталпиите на компонентите.

Обсъждане:

С помощта на изпитаните методи бяха наблюдавани разлики в близката UV-област на кръгоВия дихроизъм и измерванията DSC. Данните от диференциално-сканиращата калориметрия подкрепят отпускането на структурата, което се приписВа на рецепторната група на молекулата с малко наблюдавано изменение В областта на Fc. Резултатите от кръговия дихроизъм на близката UV-област подсказват, че бисулфидите имат нещо общо с промените В третичната структура, сВързана с фракция #3. Тези промени могат да Възникнат като следстВие от останалите бисулфиди, които се излагат поВече на действието на разтворителя и са причина за увеличаване на хидрофобността, както подсказва малкото увеличение ВъВ Времето на задържане, наблюдаваното В HIC отделяне на фракция #3. Интересно е, че няма забележими разлики В данните от флуоресценцията, които биха посочили такаВа структура. Ако някой смята първичната структура на TNFR:Fc чрез разпределението на тирозините (Y) и триптофаните (W), стаВа ясно, че областта, която се простира от частта на С-терминала на остатък 104 от домен TNFR до остатък 296 от частта на N-терминала на Fc (съдържаща 40% от линейната последователност на TNFR:Fc) не съдържа тези присъщи флуорофори. СледоВателно, едно Възможно обяснение, което се съгласува с данните, може да бъде, че третичната структура, далеч от Fc областта на скачване е относително непроменена, докато намиращатата се около остатъка от С115 go С281 може да бъде променена структурно по някакъв начин. Тази област на молекулата съдържа 10 Възможни цистеини, които могат да се повлияят от вероятно малко следствие на структурната промяна, засягаща местната структура на тирозините и триптофаните. Трябва да се отбележи, че понастоящем не е известно как се нагъва тази молекула и би изглеждало правдоподобно, цистеините, които образуват бисулфиди, разположени недалеч от даден триптофанов или тирозинов остатък и логически би могло да се предположи, че причиняВат промените В третичната структура, която даВа В резултат наблюдавания близък-UV кръгов дихроизъм, но оказва малко влияние върху близката структура, въвличайки тирозините и триптофаните. Тази идея не изключва възможността, че има някаква необичайна промяна в структурата в единия или в двата клона на TNFR, която не провокира значителна промяна в нетния ефект на флуоресценцията, дължащ се на тирозините и триптофаните. фактът, че данните от флуоросценцията (която не е чувствителна към бисулфидите) показва, че няма промяна и близката UV-област (която е чувствителна към бисулфидите, тирозините и триптофаните) показва малко отрицателно отместване, съгласуващо се с бисулфидната структурна модификация, не означава, че бисулфидите играят някаква роля в разликата между фракция #2 и #3.

Като резюмираме останалите данни, събрани относно фракция #3, аспектите, отнасящи се до молекулното тегло и вторичната структура, се установи, че те са неразличими от фракция #2.

ПРИМЕР 2

Опити с фракция #3 за бисулфиден обмен на TNFRzFc с глутатион

Този експеримент беше предвиден за установяване на разнообразието от третиращи методи, които могат да накарат фракция #3 TNFRiFc да навлезе в структурата на фракция #2 в процес, за който се очаква голяма продукция.

Материали и методи:

Материали. Началният материал беше TNFR.Fc като протеин А, чист отделен HIC продукт на отмиването от фракция #3 и смес 50:50 от HIC отделени фракции #2 и #3. Буферите бяха 0.1 М цитрат или М tris /глицин при pH 7.6, pH

8.6 или pH 9.6. Концентрацията на протеина на TNFRiFc беше от 0.2 до 4.5 mg/mL. Беше добавена редукционно-окислителна свързваща система от редуциран глутатион и глутатион (GSH/GSSG в съотношение 10 : 1) към 0.1 до 5 тМ GSH. Инкубационната температура се променяше от 4 °C на 22 °C или 31 °C.

Методи: Бисулфидният обмен беше охладен чрез подкисляване на пробата go pH 6 с 1 М оцетна киселина. Третираните препарати на рекомбинантния протеин бяха охарактеризирани с аналитичен SEC (време на задържане, агрегатна концентрация) и с твърдотелна TNF свързваща проба, за да се определи процентното съдържание и добива на фракция #2.

Резултати и обсъждане:

Ефективност на третирането като функция на pH и концентрацията на GSH. Значителен процент от протеина във фракция #3 (поне 10%) беше конвертирана фракция #2 при извършване на третиране с 0.1 тМ GSH / pH 7.6 и 0.1 тМ GSH / и с pH 8.6. Ефективността обаче беше значително подобрена (от 45% до почти 70%) когато бе проведено третиране с 0.1 mM GSH / pH 9.6; 1 mM GSH / pH 7.6; 1 mM GSH / pH 8.6; u 1 mM GSH / pH 9.6. И така, въпреки че ефективността на третирането се влияе от pH и няма свободна тиолова концентрация, то може да се проведе успешно в широка област на тези променливи.

Температурни въздействия, фракция #3 беше третирана при три различни температури: 4 °C, 22 °C и 31 °C.

Концентрацията на GSH беше поддържана при 1 mM и pH 8.6. След 16 часа всички третирани групи показаха значителна конверсия на фракция #3 във фракция #2, но конверсията изглеждаше малко по-ефективна при двете по-ниски температури.

Въздействия на клоновете. Шест различни клона на клетъчни линии, всички произвеждащи TNFR:Fc, бяха изпитани съгласно стандартизиран протокол, основаващ се на горните резултати. По-специално, полученият протеин А, съдържащ от 0.4 до 0.7 mg/mL TNFR:Fc (при около pH 4), беше нагласен до pH 8.6, като се използва 1М крайна концентрация на Tris / глицин (окончателна концентрация 0.1 М на Tris / глицин). Тези разтвори бяха нагласени до 1 mM EDTA и 2.5 mM GSH/0.25 тМ GSSG и инкубирани при стайна температура за около 16 часа. Бисулфидният обмен беше охладен чрез подкисляване, както е описано по-горе.

Всеки от шесте различни клона показа подобрение в получаването и добива на фракция #2. Намалението на HIC фракция #3 чрез третиране в различни клонове беше 64%, 72%, 77%, 78%, 78% и 83%. Увеличението във фракция #2 на същите клонове беше съответно 37%, 64%, 78%, 70%, 44% и 54%. Процентното увеличение във фракция #2 се съгласуваше добре с процентното увеличение на свързващите единици, както е показано на фигура 5. Следователно, изглеждаше, че използваните методи се прилагат общо за всички изпитвани клонове.

Свързващи проби. Три различни препарата бяха изпитани в твърдотелна свързваща проба. Пробите 11-6 и 12 бяха отделени от колона с протеин А. Проба 8085-47 също беше отделена от колона с протеин А и след това беше подложена на допълнителна фаза на пречистване; тази проба съдържаше предимно фракция #3. Пробите бяха изследвани в свързващата група преди и след бисулфидния обмен, както е посочено по-горе. Представените по-долу резултати в Таблица 1 показват нарастване на лигандната свързваща активност след третиране на всички проби с глутадион.

Таблица 1.

Свързваща активност TNF на TNFR: Fc преди и след бисулфиден обмен

Проба Преди обмена (активност /mg

11-6 4.16х10⁷

4.36 х 10⁷

8085-47 1.90 х 10⁷

След обмена	%
от протеина)	промяна
5.73 х 107	27%
6.13 х 107	29%
6.75 х 107	72%

ПРИМЕР 3

Експерименти за бисулфиден обмен на TNFR:Fc, третиран с L-цистеин

Този експеримент беше предвиден за оценка на цистеин/цистин като редукционно-окислителни сВързВащи реагенти за TNFR:Fc. Процедурата позволява да се напраВи оценка на промяната В HIC фракция #3 В структурата на фракция #2 В процеса, от който се очаква голяма продукция. Процедурата може да се проВеде Върху пречистена фракция #3, В смес от фракция #2 и #3 и/или след други разделителни методики, като хроматография на Протеин А, с подобни резултати..

Материали и методи:

Началният материал беше TNFR:Fc като чист отделен продукт HIC фракция #3 или като отделен протеин А на TNFR:Fc, съдържащ и двете фракции #2 и #3. Буфери бяха 0.1 М цитрат или 0.2 М Tris при pH 8.5. ПротеиноВата концентрация на TNFR:Fc беше 2.5 до 3 mg/mL.

Беше използвана редукционно-окислителна свързваща система НА L-цистеин (изменящ се от 0 до 50 тМ).

Процедурата беше описана също като +/- L-цистеин (от 0.025 до 0.5 тМ) и +/- 1 тМ EDTA. Инкубационната температура се променяше от 4 °C на 15 °C и на 22 °C за 6, 18 и 48 часа. Бйсулфидният обмен беше охладен чрез подкисляване

Wk*»»' на пробата go pH 7 с NaH₂PO₄ или с 0.85 М цитрат. Третираните препарати на рекомбинантния протеин бяха охарактеризирани с аналитичен HIC и SEC (Време на задържане, агрегатна концентрация) за определяне на процентното съдържание и добиВа на фракция #2 и фракция #3, цистеинизирани и и свободни сулфидни проби.

Резултати и обсъждане:

Ефективност на третирането като функция на LцистеиноВата концентрация (0-5 тМ). Значителен процент от протеина на TNFR:Fc В HIC фракция #3 (средно 10%) беше конвертиран въ$ фракция #2 когато беше извършено третиране с 0.25 тМ L-цистеин при отсъствие на L-цистин или EDTA в 4 дублициращи проби (фиг. 6). Ефективността обаче беше значително подобрена (от 45% до почти 70%) когато бе проведено третиране с 1 тМ L-цистеин или 5 тМ Lцистеин (фигура 6). Ефектът от цистеина в тези реакционни условия се изменяха с присъствието на EDTA (вижте по-долу). За дадена проба от клетъчна култура (бяха третирани 4 различни проби на клетъчни култури), процесът на третиране беше повторяем.

Ефективност на третирането като функция на по-висока L-цистеинова концентрация (5-50тМ). По-високата цистеинова концентрация на L-цистеин (5, 15 и 50 тМ L-цистеин), използвана за третиране на TNFR:Fc, имаше в резултат намаление в HIC фракция #3 от началния материал във всеки от случаите, но 5 тМ L-цистеин беше най-ефективен в промоцирането на фракция #2 (фигура 7). Установи се, че по

Високата концентрация на L-цистеина значително намаляВа сулфихидрилните групи В молекулата или изисква твърде дълго време за реоксидиране.

Ефективност на третирането като функция на допълнително L-цистеиново подхранване. За да опитаме да увеличим ефективността на бисулфидния обмен, TNFR:Fc беше третиран с 5 тМ L-цистеин и инкубиран при 4 °C в продължение на 18 часа. След това беше добавен допълнителен L-цистеин (0-5 тМ) и пробата беше инкубирана при 4 °C в продължение на още два дни. При тези условия, беше отбелязан незначителен ефект върху съотношението на HIC фракция #3 и фракция #2 при допълнителното L-цистеиново подхранване.

Въздействие на EDTA, цистин и L-цистеин. Въздействието на цистин (0-0.4 тМ) в комбинация с L-цистеин. (5тМ) върху TNFR:Fc беше установено в присъствие или отсъствие на 1 тМ EDTA. Получиха се оптимални резултати в присъствито на EDTA 1 тМ, при концентрации на цистина в обхвата'на 0.1 - 0.2 тМ.

Въздействие на мед, температура и време. TNFR:Fc беше третиран с 5 тМ L-цистеин при 4 °C и при 22 °C в продължение на 6 часа или 18 часа. Третирането на TNFR:Fc завърши с добавяне на мед, последвано от HIC. След 5 часа инкубиране, бисулфидният обмен е по-пълен при 4 °C отколкото при 22 °C, и третирането е по-съвършено след 18 часа и 4 °C (фигура 8А и 8В).

Сравнение между аналитичната ефективност и тази при подготвителното L-цистеиново третиране. При условията на третиране, оптимизирани при малък мащаб, TNFR:Fc (2.5 mg/mL в 0.2 М Tris, pH 8.5) количества 3 mL или 20 L бяха третирани с 5 тМ L-цистеин (в отсъствие на цистин или EDTA), инкубирани при 4 °C в продължение на 18 часа, разредени с равен обем от 850 тМ натриев цитрат, 50 тМ натриев фосфат, pH 6.5 за охлаждане на третирането и хроматография на HIC. Контролни проби от подготвителните и аналитични скали на TNFR:FC имаше 63% и съответно 68% от фракция #3. След третирането при горните условия, фракция #3 беше намалена до 28% при двете скали - подготвителна и аналитична. Следователно, ефективността на третирането беше 56% и 59% за подготвителната и респективно за аналитичната скала (Таблица 2). Този експеримент показва, че процесът е приложим към по-щироко обхватно третиране.

Таблица 2

Процедура за бисулфиден обмен при аналитична и подготвителна скала

	ПОДГОТВИТЕЛНА	АНАЛИТИЧНА
Фракция #2	Фракция #3	Фракция #2	Фракция #3
Контрол	37%	63%	32%	68%
Обмен	72%	28%	72%	28%
Обмен
ефектиВност”		56%		59%

Така, Въпреки че ефективността на редукционноокислителното третиране е поВлияна от тиоловата концентрация, температурата и времето, тя може да бъде ефектиВно оптимизирана и извършена за широк обхват от променлиВи. Протоколите за третирането могат също да се изготВят В малък или голям обем с повторяемост.

ОбхВатът на настоящото изобретение не трябва да се ограничаВа със специалните приложения, описани тук, които са предВидени като единични илюстрации на индивидуалните аспекти на изобретението и функционално еквивалентни методи и компоненти са в обхВата на изобретението. Наистина, различни модификации на изобретението, освен тези които са показани и описани тук, ще станат очеВидни за специалистите В тази област от приложените описания и допълващи чертежи. Такива модификации се предвиждат да попаднат в обхВата на приложените претенции.

Claims (53)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Метод, съдържащ контактуване с препарат на рекомбинантен протеин, който е получен от клетки на бозайник с редукционно-окислителен свързващ реагент, при pH от около 7 до около 11 и изолиране на фракция от препарата на рекомбинантния протеин с желана структура.
2. 2. Методът, съгласно претенция 1, където рекомбинантният протеин съдържа поне два домена.
3. 3. Методът, съгласно претенция 2, където поне един домен на протеина има стабилна структура, и поне един домен на протеина има нестабилна структура.
4. 4. Методът, съгласно претенция 1, където рекомбинантният протеин съдържа извънклетъчен домен на рецептор.
5. 5. Методът съгласно претенция, 1, където рекомбинантният протеин е разтворима форма на TNF-рецептор.
6. 6. Методът, съгласно претенция 1, където рекомбинантният протеин е Fc свързващ протеин.
7. 7. Методът, съгласно претенция 6, където препаратът на рекомбинантния протеин е бил пречистен от колона с протеин А и протеин G.
8. 8. Методът, съгласно претенция 1, където рекомбинантният протеин е избран от групата, състояща се от разтворим рецептор IL-4, разтворим рецептор IL-1 вид II, разтворим лиганд Flt3, разтворим лиганд CD40, CD39, CD30, CD27, ТЕК/ Ork, IL-15, разтворим рецептор IL-15, 0x40, GM-CSF, RANKL, RANK, TRAIL, разтворим рецептор TRAIL, тъканен плазминоген активатор, фактор VIII, фактор IX, аполипопротеин Е, аполипопротеин А-Ι, рецептор IL-2, антагонист IL-2, алфа1 антитрипсин, калцитонин, хормон на растежа, инсулин, инсулинотропин, инсулиноподобен фактор на растежа, паратироиден хормон, интерферон, супероксидна дисмутаза, гликагон, еритропоетин, анти-тяло, ллюкоцереброзидаза, Fc-свързващ протеин, глобин, фактор на растежа на нерви, интерлевкин и стимулиращ колония фактор.
9. 9. Методът, съгласно претенция 1, където pH е от около 7 до около 10.
10. 10. Методът, съгласно претенция 9, където pH е от около 7.6 до около 9.6.
11. 11. Методът, съгласно претенция 10, където pH е около 8.6.
12. 12. Методът, съгласно претенция 1, където редукционноокислителният свързващ реагент съдържа глутадион.
13. 13. Методът, съгласно претенция 12, където отношението на редуцирания глутадион към окисления глутадион е около 1:1 до около 100:1.
14. 14. Методът, съгласно претенция 1, където редукционноокислителният свързващ реагент съдържа цистеин.
15. 15. Методът, съгласно претенция 1, където фазата на контакта се извършва за около 4 до около 16 часа.
16. 16. Методът, съгласно претенция 1, където фазата на контакта се изВършВа при около 25 °C.
17. 17. Методът, съгласно претенция 1, където фазата на контакта се изВършВа при около 4 °C.
18. 18. Методът, съгласно претенция 1, където фазата на контакта се охлажда чрез подкислябане.
19. 19. Методът, съгласно претенция 1, където фазата на изолиране съдържа една или поВече хроматографски стъпки.
20. 20. Методът, съгласно претенция 1, където концентрацията на протеина е от около 0.5 до около 10 mg/ml.
21. 21. Методът, съгласно претенция 1, където отношението на редуцираните тиоли В редукционно-окислителния сбързбащ реагент към бисулфидните Връзки В протеина е около 320:1 до около 64 000:1 (редуцирани тиоли : бисулфидна Връзка.
22. 22. Методът, съгласно претенция 1, съдържащ следващо формулиране на фракция от ппрепарата на рекомбинантния протеин с желана структура В стерилна насипна форма.
23. 23. Методът, съгласно претенция 1, съдържащ следващо формулиране на фракция от ппрепарата на рекомбинантния протеин с желана структура Във форма на стерилна единична доза.
24. 24. Методът, съгласно претенция 4, където желаната структура има по-Висок сбързбащ афинитет за сходен лигандна рецептора.
25. 25. Методът, съгласно претенция 5, където желаната структура има по-висок свързващ афинитет за TNF.
26. 26. Методът, съгласно претенция 25, където TNF е TNF-алфа.
27. 27. Метод за промоция на желаната структура на гликолизиран рекомбинантен протеин, методът обхваща:

    контакт с препарата на гликолизиран рекомбинантен протеин, който съдържа смес от най-малко два конфигурационни изомера на гликолизиран рекомбинантен протеин с редукционно-окислителен свързващ реагент за достатъчно време за увеличаване на относителната пропорция на желания конфигурационен изомер, и определяне на относителната пропорция на желания конфигурационен изомер в сместа.
28. 28 Методът, съгласно претенция 27, където гликолизираният рекомбинантен протеин съдържа наймалко два домена.
29. 29. Методът, съгласно претенция 28, където поне един домен на гликолизирания рекомбинантен протеин има стабилна структура и поне един домен на гликолизирания рекомбинантен протеин има нестабилна структура.
30. 30. Методът, съгласно претенция 27, където гликолизираният рекомбинантен протеин съдържа извънклетъчен домен на рецептор.
31. 31. Методът, съгласно претенция 27, където гликолизираният рекомбинантен протеин е разтворима форма форма на TNF-рецептор.
32. 32. Методът, съгласно претенция 27, където гликолизираният рекомбинантен протеин е Fc свързващ протеин.
33. 33. Методът, съгласно претенция 32, където препаратът на гликолизирания рекомбинантен протеин е пречистен от колона с протеин А или протеин G.
34. 34. Методът, съгласно претенция 27, където гликолизираният рекомбинантен протеин е избран от групата, състояща се от разтВорим рецептор IL-4, разтворим рецептор IL-1 вид II, разтворим лиганд Flt3, разтворим лиганд CD40, CD39, CD30, CD27, ТЕК/ Ork, IL15, разтворим рецептор IL-15, 0x40, GM-CSF, RANKL, RANK, TRAIL, разтворим рецептор TRAIL, тъканен плазминоген активатор, фактор VIII, фактор IX, аполипопротеин Е, аполипопротеин А-Ι, рецептор IL-2, антагонист IL-2, алфа-1 антитрипсин, калцитонин, хормон на растежа, инсулин, инсулинотропин, инсулиноподобен фактор на растежа, паратироиден хормон, интерферон, супероксидна дисмутаза, гликагон, еритропоетин, антитяло, ллюкоцереброзидаза, Fcсвързващ протеин, глобин, фактор на растежа на нерви, интерлевкин и стимулиращ колония фактор.
35. 35. Методът, съгласно претенция 27, където pH е от около 7 до около 10.
36. 36. Методът, съгласно претенция 35, където pH е около 8.6.
37. 37. Методът, съгласно претенция 27, където редукционноокислителният свързващ реагент е избран от групата, съдържаща глутатион, цистеин, DDT (дитиотреитол), 2меркаптоетанол и дитионитробензоат.
38. 38. Методът, съгласно претенция 37, където редукционноокислителният сВързВащ реагент съдържа редуциран глутатион.
39. 39. Методът, съгласно претенция 38, където концентрацията на редуцирания глутатион е около 1 тМ до около 10 тМ.
40. 40. Методът, съгласно претенция 37, където редукционноокислителният сВързВащ реагент съдържа редуциран цистеин.
41. 41. Методът, съгласно претенция 37, където отношението на редуциращите тиоли В редукционно-окислителния сВързВащ реагент към бисулфидните Връзки В протеина е около 320:1 към около 64 000:1 (редуциращи тиоли; бисулфидна Връзка).
42. 42. Методът, съгласно претенция 27, където концентрацията на протеина е от около 0.5 до около 10 mg/ml.
43. 43. Методът, съгласно претенция 27, където контактната фаза се съгласно претенция 27, където контактната фаза се извършва при около 25 °C.
44. 45. Методът, съгласно претенция 27, където контактната фаза се изВършва при около 4 °C.
45. 46. Методът, съгласно претенция 27, където контактната фаза се охлажда чрез подкисляВане.
46. 47. Методът, съгласно претенция 27, където определящата фаза съдържа една или повече хроматографски стъпки.
47. 48. Методът, съгласно претенция 27, където определящата фаза обхваща свързваща реакция.
48. 49. Методът на желания конфигурационен изомер в стерилна форма на единична доза.
49. 51. Методът, съгласно претенция 30, където желаният конфигурационен изомер има по-висок свързващ афинитет за подобен лиганд на рецептора.
50. 52. Методът, съгласно претенция 31, където желаният конфигура по-висок свързващ афинитет за TNF.
51. 53. Методът, съгласно претенция 52, където TNF е TNF-алфа.
52. 54. Метод, съдържащ формулиране на рекомбинантен протеин във форма на единична стерилна доза, който е получен от клетки на бозайник, които са били в контакт с редукционно-окислителен свързващ реагент и е изолиран от фракция на протеина с нежелана структура.
53. 55. фармацевтичен състав на TNFR:Fc, получен с метода, съгласно претенция 54.