BR102013016279A2 - Purificação de inibidor de alfa1 protease derivado de cultura de células - Google Patents

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Abstract

Resumo purificação de inibidor de alfa1 protease derivado de cultura de células a presente invenção refere-se a métodos para purificação de inibidor de alfa1-protease recombinante derivado de cultura de células e remoção de espécies coloridas que são copurificadas com a proteína reca1pi. Também são descritos métodos para redução do ferro no inibidor de alfa1-protease recombinante derivado de cultura de células

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PURIFICAÇÃO DE INIBIDOR DE ALFAi PROTEASE DERIVADO DE CULTURA DE CÉLULAS".
CAMPO TÉCNICO São descritos aqui métodos para purificação de inibidor de alfa-i-protease recombinante humano derivado de cultura de células (recAIPI) e remoção de espécies coloridas que são copurificadas com a proteína re-cA1 PI.
ANTECEDENTES
Inibidor de alfa-i-proteinase (abreviado aqui como A1PI; também conhecido como inibidor de alfa-1 protease, alfa-1 PI, A1PI, α-1ΙΡ, α-ιΡΙ, inibidor de tripsina alfa-1, anti-tripsina alfai, anti-tripsina alfa-1, alfalAT, A1A e A1AT, AAT, inter alia), é o principal inibidor de protease de serina (serpina) em seres humanos. A1PI é expresso como uma proteína de 418 aminoáci-dos com resíduos 1-24 sendo um peptídeo sinalizador. A proteína madura, que consiste nos resíduos 25-418, é uma glicoproteína com uma única cadeia tendo um peso molecular de cerca de 51 kD. Vide Figura 1. Embora o A1PI não contenha quaisquer ligações de dissulfeto, a proteína é altamente estruturado, com 80% dos aminoácidos residindo em oito α-hélices bem definidas e três grandes β-folhas. Três carboidratos ligados à asparagina são encontrados sobre Asn 70, Asn 107 e Asn 271 (numerados conforme na proteína de comprimento total). Isto dá origem a múltiplas isoformas de A1PI, tendo pontos isoelétricos na faixa de 4,0 a 5,0. Os monossacarídeos de gli-cana incluem /V-acetilglucosamina, manose, galactose, fucose e ácido siáli-co.
Concentrações plasmáticas normais de A1PI variam de 1,3-3,5 mg/mL. A1PI funciona ao proteger células contra proteases envolvidas em coagulação sanguínea e inflamação. A1PI inibe tripsina, quimiotripsina, várias formas de elastases, colagenase da pele, renina, uroquinase e proteases de linfócitos polimorfonucleares, dentre outros. A1PI serve como um pseudo-substrato para estas proteases, as quais atacam o loop central reativo da molécula de A1PI (resíduos Gly 368-Lys 392) por meio de divagem da ligação entre resíduos Met 358-Ser 359, formando um complexo de A1PI-protease. Este complexo é rapidamente removido da circulação sanguínea. Um dos papéis endógenos de A1 PI é regular a atividade de elastase de neu-trófilos, a qual quebra proteínas estranhas e danifica tecido nativo presente no pulmão. Na ausência de quantidades suficientes de A1PI, a elastase quebra o tecido pulmonar o qual, com o tempo, resulta em dano crônico ao tecido pulmonar e enfisema. A1PI é, muitas vezes, purificado a partir de plasma sanguíneo. Vide, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos 6.284.874; 6.462.180; 6.093.804, 7.879.800; e documentos WO 1998/000154, WO 2002/048176, WO 2010/009388, por exemplo. Além disso, A1PI recombinante (recAIPI) pode ser expresso e purificado a partir de uma variedade de fontes. Vide, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos 4.931.373 e 5.134.119; Publicações de Pedidos de Patente Norte-americanas Nos US 2004/0124143 e US 2007/0218535; Publicações PCT Nos WO 2005/047323 e WO 2010/127939; e Archibald et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 5178-5182 (1990); Wright et al., Nat. Biotechnology 9: 830 (1991). Métodos para expressão e purificação de A1PI recombinante humano derivado de cultura de células para uso terapêutico são descritos aqui. Após purificação, a solução de A1PI tinha uma cor amarela ou âmbar que pode ser indesejável para médicos e/ou pacientes. Métodos para diminuição da coloração também são descritos aqui.
SUMÁRIO
Uma modalidade descrita aqui é um método de diminuição de uma quantidade de colorante em uma solução compreendendo inibidor de alfai proteinase (recAIPI) derivado de cultura de células que compreende incubação da solução compreendendo recAIPI com um agente de redução e separação do recAIPI do colorante.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é ciste- ína ou DTT.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é ciste- ína.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é cerca de 10 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é cerca de 1 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a etapa de incubação para redução é realizada durante um período de cerca de 1 a cerca de 24 horas.
Em alguns aspectos descritos aqui, a etapa de incubação para redução é realizada em uma temperatura de cerca de 20 a cerca de 600.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é ciste-ína a 10 mM e a incubação é realizada durante a noite em temperatura ambiente.
Em alguns aspectos descritos aqui, a separação do recA1 PI do colorante compreende cromatografia.
Em alguns aspectos descritos aqui, a cromatografia compreende troca iônica, interação hidrofóbica, filtração em gel, afinidade, imunoafinidade ou combinações das mesmas.
Em alguns aspectos descritos aqui, o método compreende redução da concentração de ferro.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 2 a 100 vezes.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 5 a 50 vezes.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é 10 μΜ ou menos.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é de 1 μΜ ou menos.
Outra modalidade descrita aqui é um método de purificação A1PI humano derivado de cultura de células a partir de uma solução aquosa compreendendo recAIPI compreendendo: (a) realização de uma etapa de inativação viral com uma solução contendo recAIPI; (b) passagem da solu- ção viralmente inativada através de um trocador de ânions, de modo que o recAIPI se ligue ao trocador de ânions; (c) eluição de recAIPI da resina de troca aniônica para obter um eluato de troca aniônica contendo recAIPI; (d) adição de um agente de redução ao eluato de troca aniônica contendo re-cA1PI para obter uma solução de redução; (e) incubação da solução de redução; (f) passagem da solução de redução através de uma resina de cro-matografia de interação hidrofóbica (Hydrophobic Interaction Chromatogra-phy - HIC), de modo que recAIPI se ligue à resina de HIC; e (g) eluição de recAIPI da resina de HIC para obter um eluato de HIC que contém recAIPI.
Em alguns aspectos descritos aqui, a inativação viral compreende uma incubação com solvente/detergente.
Em alguns aspectos descritos aqui, o solvente é adicionado em uma faixa de 0,01% a cerca de 0,5%.
Em alguns aspectos descritos aqui, o detergente é adicionado de cerca de 0,5% a cerca de 2,0% em peso por volume da mistura resultante.
Em alguns aspectos descritos aqui, a incubação com solvente/detergente compreende adição de cerca de 0,5% de polissorbato 20 e cerca de 0,03% de tri(n-butil-fosfato) em um pH de cerca de 8 e uma temperatura de cerca de 30Ό.
Em alguns aspectos descritos aqui, o trocador de ânions é uma resina de amônio quaternário.
Em alguns aspectos descritos aqui, a resina de amônio quaternário é Capto™ Q.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é ciste-ína (Cys); cisteamina; ditiotreitol (DTT); ditioeritritol (DTE); glutationa (GSH); 2-mercaptoetanol (2-ME); 2-mercaptoetilamina (2-MEA); tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP); ácido oxálico; ácido fórmico; ácido ascórbico; di-nucleotídeo de nicotinamida adenina (NADH); fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADPH); ou combinações dos mesmos.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é DTT ou cisteína.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é ciste-ína.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é de cerca de 1 mM a 100 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é cerca de 10 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é cerca de 1 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a etapa de incubação para redução é realizada durante cerca de 1 a 24 horas.
Em alguns aspectos descritos aqui, a etapa de incubação para redução é realizada de cerca de 2Ό a 600.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é ciste-ína a 10 mM e a incubação é realizada durante a noite em temperatura ambiente.
Em alguns aspectos descritos aqui, a resina de HIC é Octyl Se-pharose™ ou Capto™ Octyl.
Em alguns aspectos descritos aqui, o método compreende redução da concentração de ferro.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 2 a 100 vezes.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 5 a 50 vezes.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é de 10 mM ou menos.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é de 1 μΜ ou menos.
Outra modalidade descrita aqui é um método de purificação de inibidor de alfa-ι proteinase (recAIPI) derivado de cultura de células compreendendo incubação de uma solução compreendendo recAIPI com um agente de redução e separação do recAIPI do agente de redução e das espécies reduzidas.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é DTT ou cisteína.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é cisteína.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é cerca de 10 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de agente de redução é cerca de 1 mM.
Em alguns aspectos descritos aqui, a etapa de incubação é realizada durante um tempo de cerca de 1 a cerca de 24 horas.
Em alguns aspectos descritos aqui, a etapa de incubação é realizada em uma temperatura de cerca de 2Ό a cerca d e δΟΌ.
Em alguns aspectos descritos aqui, o agente de redução é cisteína a cerca de 10 mM e a incubação é realizada durante a noite em temperatura ambiente.
Em alguns aspectos descritos aqui, a separação do recAIPI do agente de redução e das espécies reduzidas compreende cromatografia.
Em alguns aspectos descritos aqui, a cromatografia compreende de troca iônica, interação hidrofóbica, filtração em gel, afinidade, imunoafini-dade ou combinações das mesmas.
Em alguns aspectos descritos aqui, a espécie reduzida compreende ferro.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 2 a 100 vezes.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 5 a 50 vezes.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é de 10 mM ou menos.
Em alguns aspectos descritos aqui, a concentração de ferro é de 1 μΜ ou menos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 ilustra a sequência primária de A1PI humano e sítios de modificação notáveis. A FIGURA 2 mostra um fluxograma do processo de purificação usado para purificar recAIPI que resulta em uma solução de recAIPI purificado tendo uma cor amarela. A FIGURA 3 mostra um cromatograma de uma amostra de re-cA1PI purificado por meio de cromatografia de imunoafinidade (por exemplo, resina ATT Select, GE Healthcare Life Sciences). A FIGURA 4 mostra um espectro de UV-Vis de uma amostra de recAIPI purificado por meio de cromatografia de imunoafinidade (por exemplo, resina ATT Select, GE Healthcare Life Sciences). A FIGURA 5 mostra um cromatograma de uma amostra de re-cA1PI purificado por meio de cromatografia de filtração em gel (isto é, exclusão de tamanho) usando resina Superdex™ 200 de grau prep (GE Healthcare Life Sciences). A FIGURA 6 mostra um espectro de UV-Vis de uma amostra de recAIPI purificado por meio de cromatografia de filtração em gel (isto é, exclusão de tamanho) usando resina Superdex™ 200 de grau prep (GE Healthcare Life Sciences). A FIGURA 7 mostra os espectros de UV-Vis de três amostras de A1PI recombinante humano derivado de cultura de células tendo uma cor amarela. A amostra 1 contém cloridrato de guanidina (Gdn.HCI) a 4 M; a amostra 2 contém ditiotreitol (DTT) a 50 mM; a amostra 3 contém Gdn-HCI a 4 M e DTT a 50 mM. A FIGURA 8 mostra um cromatograma de recAIPI tratado com DTT a 50 mM e, então, purificado por meio de cromatografia de filtração em gel. A FIGURA 9 mostra um cromatograma de recAIPI sem tratamento com DTT e, então, purificado por meio de cromatografia de filtração em gel. A FIGURA 10 mostra espectros de UV-Vis de amostras de re- cA1PI, recAIPI tratado com DTT a 50 mM e A1PI derivado de plasma altamente purificado. A FIGURA 11 mostra espectros de UV-Vis de amostras de re-cA1PI, recAIPI tratado com DTT a 50 mM e recAIPI tratado com DTT a 10 mM. A FIGURA 12 mostra um cromatograma de uma operação de cromatografia de filtração em gel de DTT a 50 mM em PBS. A FIGURA 13 mostra um cromatograma de uma operação de cromatografia de filtração em gel de recAIPI tratado com DTT a 50 mM em PBS. A FIGURA 14 mostra um cromatograma de uma operação de cromatografia de filtração em gel de A1PI derivado de plasma purificado tratado com DTT a 10 mM. A FIGURA 15 mostra um cromatograma de uma coluna de cromatografia de filtração em gel de recAIPI tratado com cisteína a 10 mM. A FIGURA 16 mostra um fluxograma do procedimento de purificação de recAIPI revisto incluindo uma etapa de incubação com cisteína. Note que a incubação com cisteína pode ser realizada em outras etapas no processo, tal como após cromatografia de interação hidrofóbica ou após passagem através da membrana de troca catiônica (setas em negrito). A FIGURA 17 mostra um cromatograma de cromatografia de interação hidrofóbica sobre Octyl-Sepharose™ com recAIPI não tratado com cisteína. A FIGURA 18 mostra um cromatograma de cromatografia de interação hidrofóbica em Octyl-Sepharose™ com recAIPI após tratamento com cisteína a 10 mM. A FIGURA 19 mostra os espectros de UV-Vis de recAIPI, re-cA1PI tratado com cisteína a 10 mM ou A1PI derivado de plasma altamente purificado.
DESCRIÇÃO DETALHADA São descritos aqui métodos para purificação de inibidor de alfa-r protease recombinante derivado de cultura de células e remoção de espé- cies coloridas que são co-purificadas com a proteína recAIPI.
Um aspecto descrito aqui é um método de purificação de A1PI humano recombinante derivado de cultura de células a partir de uma solução aquosa contendo recAIPI.
Outro método descrito aqui é um método de diminuição da coloração de uma solução de A1PI recombinante derivado de cultura de células compreendendo incubação da solução de recAIPI com um agente de redução e separação do recAIPI do agente de redução e das espécies coloridas.
Outro método descrito aqui é um método de purificação de A1PI recombinante derivado de cultura de células A1PI compreendendo incubação de uma solução de recAIPI com um agente de redução e separação do recAIPI do agente de redução e das espécies reduzidas. EXEMPLOS Exemplo 1 Crescimento de Células e Expressão de A1PI Humano Recombinante Sumário A expressão de A1PI recombinante humano começa por meio de cultura de células PER.C6® humanas (Crucell, Leiden, Holanda) contendo um construto de plasmídeo pAATopST3 para expressão de recAIPI humano glicosilado. Estas células são capazes de produzir altos rendimentos de recAIPI glicosilado, isto é, até 22 picogramas de recAIPI por célula por dia (pcd). A cultura de PER.C6®/recA1 PI foi feita através de uma série de etapas de escalonamento através de um biorreator de onda de 10 L e um biorreator de 200 L com um volume-alvo de trabalho de 150 L. O sobrena-dante de cultura contendo o recAIPI foi coletado 13-14 dias depois por meio de centrifugação a 6.000 rpm em uma centrífuga Celeros (Celeros Separati-ons, Foxboro, MA), seguido por filtração antes de purificação.
Treinamento de Inóculo em Frasco de Congelamento e Frasco de Agitação O processo de cultura de células começou com o descongela-mento de um criotubo de células humanas PER.C6® (Crucell) contendo um construto de plasmídeo pAATopST3 para expressar recAIPI humano glicosilado. Descrições do clone de inibidor de alfal protease humano recombinan- te, expressão e análises do A1PI recombinante expresso são descritas no documento WO 2010/127939 e Pedido de Patente Norte Americana N° 13/138.912, os quais são aqui incorporados por referência por tais ensinamentos. Após o frasco de células ser descongelado, as células foram transferidas para um frasco de agitação de fundo plano de 125 mL e levadas a um volume final de 15-25 mL com meio basal CDM4PERMAb™ (Hyclone) para uma densidade alvo de células viáveis de 0,5 * 106 ± 0,1 χ 106 célu-las/mL. O frasco de agitação de 125 mL (Passagem #1) foi incubado durante 96 ± 4 horas a 90 rpm, 36,50, 5,0% de CO 2. As células foram, então, transferidas para um frasco de agitação de 250 mL de fundo plano com um volu-me-alvo de 100 mL e uma densidade de células viáveis de 0,5 χ 106 ± 0,1 χ 106 células/mL. O frasco de agitação de fundo plano de 250 mL (Passagem #2) foi incubado durante 72 a 96 horas (± 4 horas) a 125 rpm, 36,50, 5,0% de CO2. As células foram, então, transferidas para um frasco de agitação de fundo plano de 500 mL com um volume-alvo de 250 mL e uma densidade de células viáveis de 0,5 χ 106 ± 0,1 χ 106 células/mL. O frasco de agitação de 500 mL de fundo plano (Passagem #3) foi incubado durante 72 a 96 horas (± 4 horas) a 125 rpm, 36,50, 5,0% de CO 2. As células foram, então, transferidas para um frasco de agitação de 1 L de fundo plano com um volume-alvo de 600 mL e uma densidade de células viáveis de 0,5 χ 106 ± 0,1 χ 106 célu-las/mL. O frasco de agitação de 1 L de fundo plano (Passagem #4) foi incubado durante 72 a 96 horas (± 4 horas) a 125 rpm, 36,50, 5,0% de CO 2. Treinamento de Inóculo em Biorreator de Onda O volume do frasco de agitação de 1 L foi transferido para um Cellbag® de 10 L sobre um Biorreator 20/50EH Wave™ (GE Healthcare Life Sciences) para atingir um volume de trabalho de 3,0-4,0 L e uma densidade de células viáveis de 0,5 χ 106 ± 0,1 χ 106 células/mL. O Cellbag® de 10 L foi operado durante 72 a 96 horas (± 4 horas) a 25 rpm, ângulo de balanço de 7°, taxa de fluxo de ar de 0,2 litros por minuto (Ipm), 36,513 e 3,0% de C02. O volume do Cellbag® de 10 L foi transferido para um Cellbag® de 50 L sobre um Biorreator 20/50EH Wave™ para obter um volume de trabalho de 22-25 L e uma densidade de células viáveis de 0,5 χ 106 ± 0,1 χ 106 célu- las/mL. O Cellbag® de 50 L foi operado durante 72 a 96 horas (± 4 horas) a 22 rpm, ângulo de balanço de 7° taxa de fluxo de a r de 0,3 Ipm, 36,5Ό e 3,0% de C02, Biorreator de 200 L
Os conteúdos do Cellbag® de 50 L foram transferidas para o biorreator de 200 L Xcellerex através de uma conexão Kleenpak™ (Xcellerex, Marlborough, MA) estéril. O biorreator de 200 L deverá conter uma quantidade mínima (100 L) de meio basal CDM4PERMAb™ (Hyclone) e ser operacional a 36,50, 120 rpm, com um pH na faixa de 7 ,2 ± 0,4 antes da adição de inóculo. O volume-alvo de trabalho foi de 150 L em uma densidade de células viáveis de 0,6 χ 106 células/mL ± 0,1 χ 106 células/ml. A banda morta de pH (uma área de alcance de sinal onde nenhuma ação ocorre) foi de 7,2 ± 0,4 e o valor nominal de oxigênio dissolvido foi de 50%. O pH foi mantido mediante adição de carbonato de sódio a 1 N ou gás C02. Após 96 horas (± 4 horas), meio de alimentação PerMAB™ (Hyclone) foi adicionado como uma dose de bolo diária igual a 0,3% do volume de trabalho inicial no biorreator; o meio de alimentação foi adicionado em uma taxa de fluxo de 100-300 ml/min. O meio de alimentação foi mantido em temperatura ambiente durante a operação e foi coberto para evitar qualquer degradação pela luz. Agente anti-espuma foi adicionado no início da operação a 12 ppm e foi adicionados em pequenos incrementos para manter um nível de espuma no biorreator que era de 2 polegadas ou menos. O biorreator de 200L foi coletado a 308-340 horas (12,8-14,2 dias).
Centrifuqação e Filtração O material do biorreator de 200 L foi transferido para a cuba Ce-leros APD-75 de 1 L em uma taxa de fluxo de 0,5 Ipm com velocidade de centrifugação de 6000 rpm (Celeros Separations, Foxboro, MA). O valor de percentual de sólidos foi calculado antes de transferência para determinar o número de descargas na cuba necessárias (a cuba de 1 L pode conter 1 kg de sólidos). O concentrado (a solução clarificada após centrifugação) foi transferido para um suporte Pilot POD da Millipore que contém dois filtros A1HC de 1,1 m2 a 1 Ipm (Merck Millipore, Billerica, MA). Após filtração pro- funda, o material foi filtrado através de um filtro SHC da Millipore de 0,5/0,2 μιτι.
Exemplo 2 Purificação de A1PI Recombinante Humano de Sobrenadante de Cultura de Células Resumo A purificação de recAIPI começa com um tratamento de três horas com solvente/detergente para inativação viral, O recAIPI foi, então, capturado e eluído de uma coluna Capto™ Q (GE Healthcare Life Science, Pis-cataway, NJ). No dia seguinte, a purificação foi continuada sobre uma coluna Octyl Sepharose™. O eluato de HIC foi ultrafiltrado e diafiltrado para permitir purificação em S-membrana, a qual foi seguida por nanofiltração para clea-rance viral adicional, Este material sofreu troca de tampão para o tampão de formulação final e a concentração de proteína foi ajustada para fazer o grosso formulado.
Inativação Viral de Sobrenadante de Cultura de Células O sobrenadante da cultura de células filtrado em profundidade foi pesado, a A2eo lida e alíquotas tiradas para amostragem. Os pontos de ajuste de temperatura e pH para esta etapa de inativação viral foram de 280 ± 20 e um pH de 7,8 ± 0,2. Um estoque de 100- χ de TNBP/polissorbato 20 foi usado para o tratamento, preparado misturando-se 0,5 kg de polissorbato 20, 0,06 kg de tri-(n-butil)fosfato (TNBP) e água para injeção (Water For Injection - WFI) para fazer um litro da mistura. Este estoque foi adicionado ao sobrenadante de cultura de células em uma diluição de 100 vezes e o tratamento realizado durante 2,5 horas com agitação. As concentrações finais eram de 0,5% para o polissorbato 20 e 0,03% para o TNBP. Após o tratamento com TNBP/polissorbato 20, o sobrenadante de cultura de células foi filtrado.
Filtração Um Cuno 120ZA Filter Disc (3M, St. Paul, MN) foi lavado com água quente para injeção (Hot Water For Injection - HWFI) a não mais de 1 L/min durante pelo menos 10 minutos. Isto foi seguido por um enxague com água fria para injeção (Cold Water For Injection - CWFI) de não menos de 2 L e, finalmente, seco ao ar a 20 psi. O sobrenadante de cultura de células tratado com TNBP/polissorbato 20 foi passado através deste filtro usando uma pressão de ar de não menos de 20 psi e um fluxo de não mais de 1 L/minuto. Alíquotas foram coletadas para amostragem e conserva. Cromatoqrafia Troca Aniônica Esta etapa serve para capturar recAIPI e eliminar proteínas da célula hospedeira (Host Cell Proteins - HCPs) no escoamento. Uma coluna de 30 cm de diâmetro interno χ 14 cm de altura de leito foi usada (volume de leito de 10 L). O pH do sobrenadante de cultura de células tratado com TNBP/polissorbato 20 foi ajustado para 7,0 ± 0,1. A condutividade do sobrenadante tratado com solvente/detergente antes de carregamento à coluna foi medido. A quantidade de diluente WFI ambiente foi determinada para assegurar que a condutividade não fosse maior do que 4 mS/cm durante carregamento da coluna com diluição in-line.
O programa Unicom (GE Healthcare Life Sciences) foi usado para operação na coluna Capto™ Q (GE Healthcare Life Science) e as tubulações de entrada do sistema de cromatografia foram colocadas nos tanques com tampão apropriado. Um filtro Durapore de 0,3 pm in-line (Millipore) foi modificado para cada operação de cromatografia. A coluna Capto™ Q foi pré-equilibrada com um volume de coluna (Column Volume - CV) de ácido acético glacial a 0,5 M, seguido por equilíbrio com 5 CV de Na2HP04 a 20 mM, pH de 6,0. O sobrenadante da cultura de células foi carregado sobre a coluna Capto™ Q por meio de diluição in-line com água para injeção (Water For Injection - WFI). A plataforma de cromatografia foi programada para realizar o carregamento em uma condutividade de não mais de 4 mS/cm em uma taxa de fluxo linear de 300 cm/h. O carregamento foi seguido por uma breve lavagem com WFI. A coluna foi lavada com 8 CV de tampão de lavagem (Na2HP04 a 20 mM, NaCI a 20 mM, pH de 6,0) antes de um re-equilíbrio com 2 CV de Na2HP04 a 20 mM, pH de 6,0. Eluição foi realizada usando um gradiente de 8 CV, terminando em Na2HP04 a 25 mM, NaCI a 200 mM, pH de 7,0 ou por um aumento gradual da concentração de NaCI. O pico de eluição único de recAIPI foi coletado começando a 4 CV no gradiente e a coleta termina com um UV-Watch Gate de 0,10 AU. A fração de eluição foi coletada para testagem e retida. L-cisteína foi adicionada ao poço eluído em uma concentração de 10 mM e deixada misturar durante a noite em temperatura ambiente.
Cromatoqrafia de Interação Hidrofóbica Usando Octvl Seoharose™ FF
Uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (Hydro-phobic Interaction Chromatography - HIC) de 45 cm de diâmetro interno * 9 cm de altura de leito (volume de leito de 15 L) Octyl Sepharose™ 4 FF (GE Healthcare Life Sciences) foi equilibrada com 8 CV de tampão de equilíbrio para HIC (Na2HP04 a 25 mM, NaCI a 0,1 M, sulfato de amônio a 1,75 M, pH de 7,0). O eluato de Capto™ Q contendo A1PI e cisteína foi carregado por meio de diluição in-line com o tampão de diluição de octila (Na2HP04 a 25 mM, NaCI a 0,1 M, (NH4)2S04 a 3 M, pH de 7,0) em uma taxa de fluxo de 150 cm/h para obter uma final concentração de (NH4)2S04 de 1,75 M no material de carregamento. Após carregamento, a coluna foi lavada com 5 CV de tampão de equilíbrio para HIC. Eluição foi realizada com um gradiente de sal inverso de sulfato de amônio a 1,75 M no tampão de lavagem para tampão de eluição (Na2HP04 a 20 mM, pH de 6,0) sobre 10 CV. Comandos de observação de absorbância por UV de 0,05 AU na frente e 0,10 AU na cauda foram usados para coletar o poço de eluato.
Ultrafiltração e Diafiltração do Eluato de HIC
Três membranas de 0,1 m2 com corte de peso molecular (Molecular Weight Cut Off - MWCO) de 30 kDa foram lavadas com WFI a 40-5013 até que o pH do permeado e retentado estivesse entre 5 e 7. A pressão de alimentação foi ajustada para um alvo de (25 psig) (por exemplo, uma faixa de 24 a 28), enquanto que a pressão de saída foi ajustada a (5 psig) (por exemplo, uma faixa de (4 a 8 psig)). O sistema foi equilibrado com 1-2 L de tampão de eluição para HIC durante não menos de 10 minutos. O eluato de HIC foi misturado e a temperatura mantida a 15-2513 . O volume de permeado foi monitorado e a UF foi interrompida quando a concentração atingiu uma A28o alvo de 30. Após a redução no volume da alimentação, diafiltração foi realizada com 6 diavolumes (DiaVolume - DV) do tampão de equilíbrio catiônico (citrato de sódio a 10 mM, pH de 5,4). A A28o do retentado foi verificada para assegurar que era < 30 e o retentado foi drenado para um recipiente limpo. Dois volumes de 1 L de tampão de equilíbrio catiônico foram, cada um, recirculados com uma pressão de alimentação de (10-15 psig) durante não menos de 5 minutos. Os enxágues foram combinados com o retentado.
Cromatoqrafia de Troca Catiônica usando uma S-membrana Uma cápsula de uso único de S-membrana Sartobind® (Sartori-us, Gottingen, Alemanha) com uma área de superfície de membrana de 2500 cm2 foi equilibrada com o tampão de equilíbrio catiônico (di-hidrato de citrato de sódio a 10 mM, pH de 5,4), assegurando que a condutividade do efluente não fosse mais de 4 mS/cm. O eluato de HIC tratado por UF/DF foi carregado sobre a S-membrana a 25 L/h usando uma bomba peristáltica e subsequentemente lavada com um tampão de equilíbrio catiônico até que a A28o fosse não mais de 0,1 AU. O escoamento foi coletado e ajustado para um pH de 7,0 ± 0,1.
Nanofiltracão A nanofiltração foi realizada usando um Viresolve® NFP (0,085 m2; Millipore) com o Viresolve® PreFilter (0,11 m2). Filtração foi pela pressão constante com uma pressão de não mais de 50 psi. O nanofiltro foi enxaguado com quatro volumes de 500 mL de tampão de equilíbrio catiônico. Ultrafiltração/Diafiltração Final Uma membrana com MWCO de 10 kDa com uma área de membrana de 0,3 m2 foi usada nesta etapa. O suporte e a membrana foram lavados com WFI a 40-5013 até que o pH do permeado e retentado estivesse entre 5 e 7. A pressão de alimentação foi ajustada para um alvo de 25 psig (faixa de 24 a 28 psi), enquanto que a pressão de saída foi ajustada a 5 psig (faixa de 4 a 8 psi). O sistema foi equilibrado com 1-2 L de Na2HP04 a 20 mM, pH de 7,0, durante pelo menos 10 minutos. O nanofiltrado foi bem misturado e a temperatura mantida a 15-2513. O permeado foi verificado periodicamente quanto à perda de recAIPI medindo sua absorbância a 280 nm (isto é, A28o), a qual deverá ser < 0,04. Se este valor foi ultrapassado, a UF/DF foi interrompida. O volume de permeado foi monitorado e a UF foi interrompida quando a concentração atingiu uma A28o alvo de ~ 30. Após a redução no volume da alimentação, diafiltração foi realizada com 5 DV do tampão de diafiltração (Na2HPC>4 a 20 mM, NaCI a 120 mM, pH de 7,0). A A28o do retentado foi verificada para assegurar que era <30 e o retentado foi drenado para um recipiente limpo. A quantidade de enxague com tampão de diafiltração foi calculada a qual, quando adicionada ao retentado, resulte em uma concentração final de 50-56 mg/mL. Este volume de enxague foi dividido pela metade e cada volume foi recirculado com uma pressão de alimentação de não mais de (20 psig) durante 3-5 minutos. Os enxágues foram combinados com o retentado.
Armazenamento Ο A1PI recombinante concentrado em massa foi filtrado para esterilização em sacos Flexel® (Sartorius) e armazenado a -700 antes de enchimento final.
Descobriu-se que o recAIPI produzido por meio do método descrito acima tem uma cor amarela acentuada. A identidade das espécies a-marelas era desconhecida. Embora o recAIPI fosse altamente puro e ativo, remoção do colorante amarelo era desejado por motivos estéticos.
Exemplo 3 Cromatoqrafia de Imunoafinidade com Resina Anti-Tripsina Alfa-1 Select Uma coluna de imunoafinidade específica para A1PI foi realizada para determinar se as espécies amarelas poderíam ser separadas do re-cA1PI purificado. Uma colina de 1,6 cm de diâmetro interno χ 10 cm de altura de leito (volume de coluna de 20 mL) de resina Anti-Tripsina Alfa-1 Select (AAT-Select, GE Healthcare Life Science) específica para H1PI derivado de plasma foi empacotada. A coluna foi equilibrada com Tris.HCI a 20 mM, pH de 7,4. Aproximadamente 200 mg de recAIPI a 10 mg/mL foram carregados sobre esta coluna a 5 mL/minuto. A coluna foi lavada com Tris.HCI a 20 mM, pH de 7,4, NaCI a 100 mM e eluída com Tris.HCI a 20 mM, pH de 7,4, NaCI a 2 M (vide Figura 3). As frações foram coletadas com base no fracionamen- to de pico. As frações sob o pico de eluição foram reunidas e concentradas usando dispositivos de concentração com MWCO de 30 kDa Amicon Ultra-Cel™ (Merck Millipore, Billerica, MA). Um espectro de UV-Vis foi adquirido a partir da amostra concentrada. O eluato, após concentração, era distintamente de cor amarela. Quando analisado por meio de espectroscopia de UV-Vis (vide Figura 4), o espectro era muito similar àquele observado para recAIPI antes de passagem na coluna de imunoafinidade. A conclusão a partir deste resultado foi que cromatografia de imunoafinidade era ineficaz na separação da cor amarela do recA1 PI.
Exemplo 4 Cromatografia de Filtracão em Gel Com Resina Superdex™ 200 Um experimento de filtração em gel (cromatografia de exclusão por tamanho; Size Exclusion Chromatography - SEC) também foi tentado para remover as espécies amarelas do recAIPI, Uma coluna de 1,6 cm de diâmetro interno χ 90 cm (volume de leito de 181 mL) de resina Superdex™ 200 de grau prep foi empacotada (GE Healthcare Life Sciences). A coluna foi equilibrada com solução salina tamponada com fosfato (Phosphate Buffered Saline - PBS; fosfatos a 12 mM, pH de 7,4, NaCI a 137 mM, KCI a 2,7 mM). recAIPI foi carregado a 5% do volume da coluna (9 mL) e passado a 2 mL/minuto (60 cm/h). Frações com volume de 12 mL foram coletadas para análise. O cromatograma para esta coluna é mostrado na Figura 5. Embora a carga fosse de 99% de recA1 PI, um pico de separação foi observado, possivelmente em virtude de saturação do detector de UV. As frações sob este pico foram analisadas por meio de espectrofotometria de UV-Vis (Figura 6). As frações de recAIP eram visivelmente amarelas e os espectros de UV-Vis destas frações eram similares àqueles do material de carregamento. Assim, a coluna de filtração em gel não removeu a cor amarela de recA1 PI. Exemplo 5 Análises de Agentes de Desnaturação e Redução Em virtude do fato de que cromatografia de imunoafinidade e fil- tração em gel não foram bem sucedidas na remoção da cor amarela de re-cA1PI, o uso de agentes de desnaturação e/ou redução foi tentado como meios potenciais para remoção ou diminuição da cor amarela.
Aproximadamente 1 ml_ do recAIPI foi misturado com cloridrato de guanidina a 8 M ou DTT a de 500 mM para obter concentrações finais de guanidina a 4 M ou DTT a 50 mM, respectivamente. Um terço da amostra foi misturado com ambos os reagentes. As amostras foram incubadas a 50Ό durante cerca de 2 h e passadas individualmente através de colunas de dessalinização PD-10 (GE Healthcare Life Sciences). O escoamento destas colunas foi coletado por meio de centrifugação a 1000 * g durante 5 minutos.
Cloridrato de guanidina não ajuda com a diminuição e isto se refletiu no espectro de UV-Vis desta amostra (Figura 7). A amostra tratada com DTT a 50 mM era amarela mais clara comparada com a amostra tratada com cloridrato de guanidina. Esta amostra não tem a assinatura espectral a 405 nm que foi caracteristicamente observada para o recAIPI (Figura 7). A amostra tratada com a combinação de guanidina e DTT era quase incolor e carecia de características espectrais na faixa de 300-400 nm. O fato de que tanto o cloridrato de guanidina quanto DTT eram requeridos para diminuir a cor amarela pode indicar que a espécie de cor amarela está covalen-temente ligada ao recAIPI.
Exemplo 6 Redução e Cromatoqrafia de Filtração em Gel Experimentos adicionais foram realizados para acompanhar a redução de DTT e cromatografia de filtração em gel feita com as colunas PD-10. O objetivo aqui é usar uma coluna mais tempo para obter uma melhor resolução da amostra tratada com DTT e processar uma maior quantidade de recAIPI reduzido para análise.
Uma coluna de 1,6 cm de diâmetro interno χ 90 cm de altura de leito (volume de coluna de 181 mL) de resina Superdex™ 200 de grau prep foi empacotada (GE Healthcare Life Sciences). Esta coluna foi pré-equilibrada com PBS contendo DTT a 5 mM. Uma amostra de recAIPI em um volume de 9 ml_ foi tratada com DTT em uma concentração de 50 mM em temperatura ambiente durante a noite. Esta amostra foi carregada sobre a coluna; a carga constituía 5% do volume da coluna e a coluna foi operada a 2 mL/minuto (60 cm/h). Frações de volume constante 14,5 ml_ foram coletadas para análise. Frações apropriadas foram empoçadas e concentradas para aproximadamente 50 mg/ml_ usando dispositivos de concentração por centrifugação com MWCO de 30 kDa Amicon UltraCel™ (Millipore). Uma amostra de controle que não foi tratada com DTT também foi passada sob condições idênticas. O cromatograma para a amostra tratada com DTT a 50 mM é mostrado na Figura 8 e a amostra de controle é mostrada na Figura 9. Há um segundo pico menor distinto que foi observado na operação de SEC com a amostra tratada com DDT. Frações B1-B3 contendo o recAIPI foram empoçadas e concentradas para aproximadamente 50 mg/mL usando um dispositivo de concentração por centrifugação com MWCO de 30 kDa. A amostra concentrada foi analisada por meio de espectrometria de UV-Vis. Os espectros de UV-Vis mostrados na Figura 10 revelam que a assinatura característica do material de iniciação amarelo, recAIPI, é significativamente diminuída no concentrado do eluato de filtração em gel reduzido. A1PI humano derivado de plasma altamente purificado foi usado como controle. Exemplo 7 Análise de Concentração de DTT
Os efeitos de menores concentrações de DTT foram analisados por meio de incubação de recAIPI com DTT, purificação da amostra usando cromatografia de filtração em gel e, então, obtenção dos espectros de UV-Vis das amostras purificadas concentradas. Uma coluna de 1,6 cm de diâmetro interno x 90 cm de altura de leito (volume de coluna de 181 mL) de resina Superdex™ 200 de grau prep foi usada (GE Healthcare Life Sciences). Esta coluna foi pré-equilibrada com PBS contendo DTT a 5 mM. O re-cA1PI, em um volume de 9 mL, foi tratado com DTT na concentração adequada em temperatura ambiente durante a noite. A carga constituía 5% do volume da coluna e a coluna foi operada a 2 mL/minuto (60 cm/h). Foram coletadas frações com volume constante de 14,5 mL. Frações apropriadas foram empoçadas e concentradas para aproximadamente 50 mg/mL usando dispositivos de concentração por centrifugação com MWCO de 30 kDa.
Os espectros de UV-Vis das amostras tratadas com DTT a 10 mM e DTT a 50 mM mostram que a concentração de DTT a 10 mM é tão eficaz quanto DTT a 50 mM para diminuição da assinatura espectral característica do recAIPI de cor amarela (Figura 11).
Exemplo 8 Análise Bioanalítica sobre recAIPI Tratado com DTT, Purificado por Filtra-cão em Gel Análise MALDI TOF
Experimentos de Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization Time of Flight Mass Spectrometry foram realizados sobre recAIPI. A expectativa era de que os pequenos picos gerados por meio de tratamento com DTT tendo uma cor amarela pudessem conter uma espécie identificável por meio de espectrometria de massa. No entanto, nada foi identificado nestas amostras. Efeitos da matriz podem ter interferido com a ionização de moléculas na faixa de 100-10.000 Da.
Concentração de Ferro Suspeitava-se que íons de ferro fossem uma possível fonte da cor amarela. Ferro é um metal de transição essencial em cultura de células e é adicionado aos meios de cultura de células a montante como citrato de amônio férrico, Fex(NH4)yC6H507. Análises de ferro mostraram uma redução de ~ 30 vezes no teor de ferro das frações empoçadas de recAIPI reduzido com DTT da coluna de filtração em gel comparado com o material de iniciação que tinha 66 μΜ de ferro. Vide Figura 13. As espécies amarelas indicadas pela seta no cromatograma tinham ~ 50% do ferro em relação à quantidade carregada.
Análise de Atividade Além das frações de pico principais, nenhuma das frações de pico menores tinha atividade de recAIPI.
Exemplo 9 Análise Filtracão em Gel de DTT
Uma operação de cromatografia foi completada com DTT apenas na ausência de recAIPI para ver o perfil cromatográfico de DTT na ausência de recAIPI. Um único pico foi observado com um volume de eluição de 201 mL (Figura 12), o qual corresponde ao último pico de volume de eluição idêntico observado na operação de teste com amostra de recAIPI. A fração com uma cor ligeiramente amarela que corresponde ao pico indicado pela seta na Figura 13 é única às amostras de recAIPI tratadas com DTT e está ausente na operação de controle apenas com DTT.
Exemplo 10 Tratamento de A1PI Derivado de Plasma Purificado Com DTT a 10 mM
Um produto de A1PI derivado de plasma que tem uma aparência amarela foi testado para determinar se tratamento com agente de redução também resultaria em uma redução similar na cor amarela. Uma alíquota de 10 mL de A1PI derivado de plasma a aproximadamente 50 mg/mL foi tratada com DTT em uma concentração final de 10 mM. Cromatografia de filtração em gel sobre resina Superdex™ 200 de grau prep foi realizada conforme descrito aqui (GE Healthcare Life Sciences). O cromatograma da operação com ο A1PI derivado de plasma tratado com DTT é mostrado na Figura 14.
As frações correspondendo ao recAIPI sob o pico principal foram empoçadas e concentradas para 50 mg/mL. A cor da amostra não era diferente daquela obtida da amostra não tratada. Isto indicou que a fonte da cor amarela do recAIPI derivado de cultura de células era diferente daquela do A1PI derivado de plasma.
Exemplo 11 Análise de Cisteína Como Agente de Redução Cisteína foi examinada como um agente de redução alternativo porque a cisteína é barata e está facilmente disponível. Além disso, como um aminoácido, a cisteína é um excipiente aceitável. Um experimento foi realizado onde uma alíquota de recAIPI foi tratada com cisteína a 10 mM e processada sobre uma coluna de filtração em gel. O cromatograma para a operação é mostrado na Figura 15. As frações correspondendo ao recAIPI foram empoçadas e concentradas para 50 mg/ml_. Cisteína também era a-ceitável como agente de redução.
Exemplo 12 Análise de Cor Uma comparação da cor das amostras tratadas com DTT e cisteína na concentração de 10 mM mostra uma redução substancial na cor amarela em uma concentração de proteína comparável (~ 50 mg/ml_). A proporção A280/A405 foi acompanhada como um indicador de amarelecimento de uma amostra, a razão sendo que a absorção de uma solução a 405 nm é uma medida quantitativa de cor amarela. Uma maior proporção A280/A405 corresponde a uma cor amarela mais clara da amostra. A cor amarela significativa da amostra não tratada é grandemente removida pelo tratamento com DTT e cisteína. No entanto, a remoção da cor amarela não era completa e um tom de amarelo permanece nas amostras tratadas. A proporção A280/A405 também segue esta tendência e uma redução de 3 vezes é, tipicamente, observada após tratamento com agentes de redução. A1PI derivado de plasma altamente purificado é praticamente límpido, com uma proporção A28o/A4o5 de 428.
Recuperação de Atividade de A1PI Recombinante Derivado de Cultura de Células A recuperação de atividade de recAIPI a partir de experimentos com cromatografia de exclusão por tamanho e tratamento com agentes de redução variava de 80-100% (vide Tabela 1).
Tabela 1: Recuperação de Atividade de A1PI Derivado de Cultura de células a partir de Cromatografia de Exclusão por Tamanho Após Tratamento com DTT ou Cisteína Teor de Ferro A concentração de ferro das amostras tratadas foi consideravelmente reduzida após tratamento com agentes de redução e purificação cro-matográfica. Amostras reduzidas e purificadas foram analisadas usando es-pectroscopia de absorção atômica a plasma indutivamente acoplada (Induc-tively Coupled Plasma Atomic Absorption Spectroscopy - ICP-AA). A extensão de redução da concentração de íons variava de aproximadamente 14 vezes para a amostra tratada com cisteína a 27 vezes para a amostra tratada com DTT a 10 mM (Tabela 2) quando comparado com as amostras não tratadas.
Tabela 2: Concentração de ferro de amostras A1PI de cromato-grafia de exclusão de tamanho após tratamento com DTT e cisteína Exemplo 13 Procedimento de Purificação de recAIPI Revisto: Adição de Agente de Redução e Incubação Após Cromatoqrafia de Troca Aniônica A Figura 16 mostra um fluxograma do procedimento de purificação de recAIPI revisto, onde cisteína é adicionada ao eluato empoçado de troca aniônica. Segue o procedimento revisto. Após a etapa de inativação viral com solvente/detergente, o sobrenadante de cultura de células, tendo uma massa de 11,2 kg, foi purificado sobre uma coluna com diâmetro interno de 5 cm x altura de leito de 25 cm (500 mL) Capto™ Q (GE Healthcare Life Sciences) a 300 cm/h. A coluna foi equilibrada em Na2HP04 a 20 mM, pH de 6,0, lavada com Na2HP04 a 20 mM, NaCI a 20 mM, pH de 6,0 e eluída com Na2HP04 a 25 mM, NaCI a 200 mM, pH de 7,0 sobre 8 CV. A A28o do Q-eluato foi de 2,4, correspondendo a uma potência aproximada de 2 g/L. Uma alíquota de 500 mL deste Q-eluato contendo cerca de 1 g de recAIPI por atividade foi tratada com cisteína a 10 mM (Acros Chemicals; Thermo Fisher Scientific, New Jersey) e incubada em temperatura ambiente durante a noite (~ 25Ό, aproximadamente 16 h). A amostra tratada foi diluída com tampão de diluição para HIC para 42:58, Na2HPC>4 a 25 mM, NaCI a 100 mM, (NH4)2S04 a 3 M, pH de 7,0 e usada para carregar uma coluna Octyl Sepha-rose™ com dimensões de 5 cm de diâmetro interno X 10,3 cm de altura de leito (volume de leito de 202 ml_). A coluna foi equilibrada com Na2HP04 a 25 mM, NaCI a 100 mM, (NH4)2S04 a 1,75 M, pH de 7,0 e eluída com um gradiente de Na2HP04 a 20 mM, pH de 6,0 sobre 10 CV. O volume de eluen-te de 620 mL foi concentrada para 50 ml_ usando um sistema LabScale™ TFF e um filtro Pellicon® de 30 kDa, 3 χ 50 cm2 (Millipore). A amostra foi ainda concentrada para 50 mg/mL usando dispositivos de concentração A-micon UltraCel™ de 30 MWCO (Millipore) por meio de centrifugação a 3.500 rpm a 4Ό. A amostra concentrada foi, então, passada através de uma cápsula de S-membrana Sartobind® (Sartorius, Gottingen, Alemanha) equilibrada em tampão citrato de sódio a 10 mM, pH de 5,4. Esta amostra foi dia-filtrada contra 5 volumes de coluna de PBS.
Uma operação de controle também foi realizada usando um volume idêntico de Q-eluato e processado sobre a coluna de HIC de uma maneira idêntica na ausência de cisteína. Os perfis de cromatografia HIC de amostras de controle e tratadas com cisteína eram comparáveis (cf. Figura 17 e Figura 18). Isto indicou que a adição de cisteína não alterou o perfil de purificação de recAIPI sobre a coluna de interação hidrofóbica. Quando as amostras foram concentradas para cerca de 50 mg/mL, uma redução substancial na cor amarela foi observada, a qual correspondia a uma melhora de 3,4 vezes na proporção A28o/A405 (isto é, 73 vs. 245). Os espectros de UV-Vis também refletem esta diferença, com o perfil da amostra tratada com cisteína sendo comparável àquele do A1PI derivado de plasma altamente purificado; vide Figura 19.
Consequentemente, a incubação noturna com cisteína entre a coluna de troca aniônica e cromatografia de interação hidrofóbica (vide Figura 16) em operações de escala preparativa produz resultados comparáveis àqueles dos experimentos em escala de bancada em termos de eliminação da cor amarela e um melhora correspondente na proporção A280/A405, O âmbito dos dispositivos e métodos descritos aqui inclui todas as combinações de modalidades, aspectos, exemplos, etapas e preferências descritos aqui.

Claims (54)

1. Método de diminuição da quantidade de colorante em uma solução compreendendo inibidor de alfai proteinase derivado de cultura de células (recAIPI) compreendendo incubação da solução compreendendo re-cA1PI com um agente de redução e separação do recAIPI do colorante.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente de redução é DTT e cisteína.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente de redução é cisteína.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração de agente de redução é de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração de agente de redução é cerca de 10 mM.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração de agente de redução é cerca de 1 mM.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de incubação para redução é realizada durante um período de cerca de 1 a cerca de 24 horas.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de incubação para redução é realizada em uma temperatura de cerca de 213 até cerca de 6013.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente de redução é cisteína a 10 mM e a incubação é realizada durante a noite em temperatura ambiente.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a separação da recAIPI do corante compreende cromatografia.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a cromatografia de troca iônica compreende interação hidrofóbica, filtração em gel, afinidade, imunoafinidade ou combinações das mesmas.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo redução da concentração de ferro.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a concen- tração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 2 a 100 vezes.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 5 a 50 vezes.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a concentração de ferro é de 10 μΜ ou menos.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a concentração de ferro é de 1 μΜ ou menos.
17. Método de purificação de A1PI humano derivado de cultura de células a partir de uma solução aquosa compreendendo recAIPI compreendendo: (a) realização de uma etapa de inativação viral sobre uma solução contendo recAIPI; (b) passagem da solução viralmente inativada através de um trocador de ânions, de modo que recA1 PI se ligue ao trocador de ânions; (c) eluição de recAIPI da resina de troca aniônica para obter um eluato de troca aniônica contendo recAIPI; (d) adição de um agente de redução ao eluato de troca aniônica contendo recAIPI para obter uma solução de redução; (e) incubação da solução de redução; (f) passagem da solução de redução através de uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), de modo que recAIPI se ligue à resina de HIC; e (g) eluição de recAIPI da resina de HIC para obter um eluato de HIC que contém recA1 PI.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a inativação viral compreende uma incubação com solvente/detergente.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o solvente é adicionado em uma faixa de 0,01% a cerca de 0,5%.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o detergente é adicionado entre cerca de 0,5% a cerca de 2,0% em peso por volume da mistura resultante.
21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a incuba- ção com solvente/detergente compreende a adição de cerca de 0,5% de po-lissorbato 20 e cerca de 0,03% de tri(n-butil-fosfato) em um pH de cerca de 8 e uma temperatura de cerca de 3013.
22. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o trocador de ânions é uma resina de amônio quaternário.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a resina de amônio quaternário é Capto™ P.
24. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o agente de redução é cisteína (Cys); cisteamina; ditiotreitol (DTT); ditioeritritol (DTE); glutationa (GSH); 2-mercaptoetanol (2-ME); 2-mercaptoetilamina (2-MEA); tris(2-carbóxietil)fosfina (TCEP); ácido oxálico; ácido fórmico; ácido ascórbi-co; dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADH), fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADPH); ou combinações dos mesmos.
25. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o agente de redução é DTT e cisteína.
26. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o agente de redução é cisteína.
27. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a concentração de agente de redução é de cerca de 1 mM a 100 mM.
28. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a concentração de agente de redução é cerca de 10 mM.
29. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a concentração de agente de redução é cerca de 1 mM.
30. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a etapa de incubação para redução é realizada durante cerca de 1 a 24 horas.
31. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a etapa de incubação para redução é realizada de cerca de 213 a 6013.
32. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o agente de redução é cisteína a 10 mM e a incubação é realizada durante a noite em temperatura ambiente.
33. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a resina para HIC é Octyl Sepharose™ ou Octyl Capto™.
34. Método de acordo com a reivindicação 17, compreendendo redução da concentração de ferro.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 2 a 100 vezes.
36. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 5 a 50 vezes.
37. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a concentração de ferro é de 10 μΜ ou menos.
38. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a concentração de ferro é de 1 μΜ ou menos.
39. Método de purificação de inibidor de alfal proteinase (re-cA1PI) derivado de cultura de células compreendendo incubação de uma solução compreendendo recAIPI com um agente de redução e separação do recAIPI do agente de redução e das espécies reduzidas.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o agente de redução é DTT e cisteína.
41. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o agente de redução é cisteína.
42. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a concentração de agente de redução é cerca de 1 mM a cerca de 100 mM.
43. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a concentração de agente de redução é cerca de 10 mM.
44. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a concentração de agente de redução é cerca de 1 mM.
45. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a etapa de incubação é realizada durante um tempo de cerca de 1 a cerca de 24 horas.
46. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a etapa de incubação é realizada em uma temperatura de cerca de 213 a cerca de 60Ό.
47. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o agente de redução é cisteína a cerca de 10 mM e a incubação é realizada durante a noite em temperatura ambiente.
48. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a separação de recAIPI do agente de redução e das espécies reduzidas compreende cromatografia.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que a cromatografia compreende troca iônica, interação hidrofóbica, filtração em gel, afinidade, imunoafinidade ou combinações dos mesmos.
50. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a espécie reduzida compreende ferro.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 2 a 100 vezes.
52. Método de acordo com a reivindicação 50, em que a concentração de ferro é reduzida (isto é, diminuída) 5 a 50 vezes.
53. Método de acordo com a reivindicação 50, em que a concentração de ferro é de 10 μΜ ou menos.
54. Método de acordo com a reivindicação 50, em que a concentração de ferro é de 1 μΜ ou menos.
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