JP2014024842A - 細胞培養由来のアルファ１プロテアーゼ阻害剤の精製 - Google Patents

細胞培養由来のアルファ１プロテアーゼ阻害剤の精製 Download PDF

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Abstract

【課題】細胞培養由来のヒト組換えA1PIを発現し精製するための方法を提供すること。
【解決手段】細胞培養由来の組換えアルファ1−プロテアーゼ阻害剤を精製し、recA1PIタンパク質と同時精製される有色種を取り除くための方法が記載されている。細胞培養由来のアルファ1−プロテアーゼ阻害剤に含まれる鉄を減少させるための方法も記載されている。
【選択図】なし

Description

本明細書には、細胞培養由来のヒト組換えアルファ1−プロテアーゼ阻害剤(recA1PI)を精製しrecA1PIタンパク質と同時精製される有色種を取り除くための方法が記載されている。
アルファ1−プロテイナーゼ阻害剤(本明細書ではA1PIとして略記される;アルファ−1プロテアーゼ阻害剤、アルファ−1 PI、A1PI、α-1 PI、α1PI、アルファ−1トリプシン阻害剤、アルファ1アンチトリプシン、アルファ−1アンチトリプシン、アルファ1AT、A1AおよびA1AT、特にAATとしても知られる)はヒトにおける主要なセリンプロテアーゼ阻害剤(セルピン)である。A1PIは418アミノ酸タンパク質として発現され、残基1〜24はシグナルペプチドである。成熟タンパク質は、残基25〜418からなり、約51kDの分子量を有する一本鎖糖タンパク質である。図1参照。A1PIはジスルフィド結合を含有していないが、タンパク質は高度に構造化されており、そのアミノ酸の80%が8つの詳細に定義されたαへリックスおよび3つの大きなβシートに属する。3つのアスパラギン連結炭水化物がAsn70、Asn107およびAsn271上に見出される(完全長タンパク質中として番号付けがされている)。このために、4.0から5.0の範囲の等電点を有する複数のA1PIアイソフォームが生じる。グリカン単糖類には、N−アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース、フコースおよびシアル酸が含まれる。
A1PIの正常な血漿濃度は1.3から3.5mg/mLに及ぶ。A1PIは凝固および炎症に関与するプロテアーゼから細胞を保護することにより機能する。A1PIは、トリプシン、キモトリプシン、様々な種類のエラスターゼ、皮膚コラゲナーゼ、レニン、ウロキナーゼおよびとりわけ、多形核リンパ球のプロテアーゼを阻害する。A1PIはこれらのプロテアーゼの偽基質として機能し、これらのプロテアーゼはA1PI−プロテアーゼ複合体を形成している残基Met 358-Ser 359間の結合を切断することによりA1PI分子の反応性中心ループ(残基Gly 368-Lys 392)を攻撃する。この複合体は血液循環から急速に取り除かれる。A1PIの内在性役割の1つは、好中球エラスターゼの活性を調節することであり、エラスターゼは外来タンパク質を分解し肺に存在する天然組織を損傷する。A1PIの量が十分になければ、エラスターゼは肺組織を破壊し、そのうちに慢性的肺組織損傷および肺気腫をもたらす。
A1PIは血液血漿から精製されることが多い。たとえば、米国特許第6,284,874号、米国特許第6,462,180号、米国特許第6,093,804号および米国特許第7,879,800号;たとえば、国際公開第1998/000154号、国際公開第2002/048176号、国際公開第2010/009388号を参照されたい。さらに、組換えA1PI(recA1PI)は種々の供給源から発現させ精製することが可能である。たとえば、米国特許第4,931,373号、米国特許第5,134,119号、米国特許出願公開第2004/0124143号、米国特許出願公開第2007/0218535号;PCT出願国際公開第2005/047323号、国際公開第2010/127939号;およびArchibald et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5178〜5182頁(1990); Wright et al.、Nat. Biotechnology 9: 830 (1991)を参照されたい。
治療用途のための、細胞培養由来のヒト組換えA1PIを発現し精製するための方法が本明細書に記載されている。精製に続いて、A1PI溶液は、臨床医および/または患者には好ましくないことがある黄色または琥珀色を呈していた。呈色を減少させるための方法も本明細書に記載されている。
米国特許第6,284,874号 米国特許第6,462,180号 米国特許第6,093,804号 米国特許第7,879,800号 国際公開第1998/000154号 国際公開第2002/048176号 国際公開第2010/009388号 米国特許第4,931,373号 米国特許第5,134,119号 米国特許出願公開第2004/0124143号 米国特許出願公開第2007/0218535号 PCT出願国際公開第2005/047323号 国際公開第2010/127939号 米国特許出願第13/138912号
Archibald et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5178〜5182頁(1990) Wright et al.、Nat. Biotechnology 9: 830頁(1991)
本明細書に記載される一実施形態は、細胞培養由来のアルファ1プロテイナーゼ阻害剤(recA1PI)を含む溶液中の色素の量を減少させる方法であって、recA1PIを含む溶液を還元剤と一緒にインキュベートするステップ、および色素からrecA1PIを分離するステップを含む、方法である。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤はシステインまたはDTTである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤はシステインである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約1mMから約100mMまでである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約10mMである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約1mMである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元インキュベーションステップは、約1時間から約24時間までの時間実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、還元インキュベーションステップは、約2℃から約60℃までの温度で実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤は10mMのシステインであり、インキュベーションはほぼ室温で一晩実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、色素からrecA1PIを分離するステップはクロマトグラフィーを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、クロマトグラフィーは、イオン交換、疎水性相互作用、ゲル濾過、親和性、免疫親和性またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、方法は鉄濃度を減少させるステップを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1/2から1/100に減少(すなわち、低下)される。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1/5から1/50に減少(すなわち、低下)される。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は10μMまたはそれ未満である。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1μMまたはそれ未満である。
本明細書に記載される別の実施形態は、recA1PIを含む水溶液から細胞培養由来のヒトA1PIを精製する方法であって、(a)recA1PIを含有する溶液にウイルス不活化ステップを実施するステップ、(b)recA1PIが陰イオン交換体に結合するようにウイルス不活化溶液を陰イオン交換体に通すステップ、(c)陰イオン交換樹脂からrecA1PIを溶出させるステップであって、recA1PIを含有する陰イオン交換溶出液を得る、溶出させるステップ、(d)recA1PIを含有する陰イオン交換溶出液に還元剤を添加するステップであって、還元溶液を得る、添加するステップ、(e)還元溶液をインキュベートするステップ、(f)recA1PIがHIC樹脂に結合するように、還元溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂に通すステップ、および(g)HIC樹脂からrecA1PIを溶出させるステップであって、recA1PIを含有するHIC溶出液を得る、溶出させるステップを含む、方法である。
本明細書に記載される一部の態様では、ウイルス不活化は溶剤/界面活性剤インキュベーションを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、溶剤は0.01%から約0.5%の範囲で添加される。
本明細書に記載される一部の態様では、界面活性剤は、得られた混合物の単位体積当たりの重量として約0.5%から約2.0%まで添加される。
本明細書に記載される一部の態様では、溶剤/界面活性剤インキュベーションは、約8のpHおよび約30℃の温度で、約0.5%ポリソルベート20および約0.03%トリ(n−ブチルリン酸)を添加するステップを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、陰イオン交換体は第四級アンモニウム樹脂である。
本明細書に記載される一部の態様では、第四級アンモニウム樹脂はCapto(商標)Qである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤はシステイン(Cys)、システアミン、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、グルタチオン(GSH)、2−メルカプトエタノール(2-ME)、2−メルカプトエチルアミン(2-MEA)、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、シュウ酸、ギ酸、アスコルビン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)、またはそれらの組み合わせである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤はシステインまたはDTTである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤はシステインである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約1mMから100mMまでである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約10mMである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約1mMである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元インキュベーションステップは約1から24時間実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、還元インキュベーションステップは約2℃から60℃で実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤は10mMのシステインでありインキュベーションはほぼ室温で一晩実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、HIC樹脂はOctyl Sepharose(商標)またはCapto(商標)Octylである。
本明細書に記載される一部の態様では、方法は鉄濃度を減少させるステップを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1/2から1/100に減少(すなわち、低下)される。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1/5から1/50に減少(すなわち、低下)される。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は10μMまたはそれ未満である。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1μMまたはそれ未満である。
本明細書に記載される別の実施形態は、細胞培養由来のアルファ1プロテイナーゼ阻害剤(recA1PI)を精製する方法であって、recA1PIを含む溶液を還元剤と一緒にインキュベートするステップ、ならびに還元剤および還元種(reduced species)からrecA1PIを分離するステップを含む、方法である。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤はシステインまたはDTTである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤はシステインである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約1mMから約100mMまでである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約10mMである。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤濃度は約1mMである。
本明細書に記載される一部の態様では、インキュベーションステップは約1から約24時間の時間実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、インキュベーションステップは約2℃から約60℃の温度で実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、還元剤は約10mMのシステインでありインキュベーションはほぼ室温で一晩実施される。
本明細書に記載される一部の態様では、recA1PIを還元剤および還元種から分離するステップはクロマトグラフィーを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、クロマトグラフィーは、イオン交換、疎水性相互作用、ゲル濾過、親和性、免疫親和性またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載される一部の態様では、還元種は鉄を含む。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1/2から1/100に減少(すなわち、低下)される。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1/5から1/50に減少(すなわち、低下)される。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は10μMまたはそれ未満である。
本明細書に記載される一部の態様では、鉄濃度は1μMまたはそれ未満である。
ヒトA1PIの一次配列および注目すべき修飾部位を示す図である。 黄色を呈する精製recA1PI溶液を生じる、recA1PIを精製するために使用される精製プロセスのフローチャートである。 免疫親和性クロマトグラフィー(すなわち、ATT Select樹脂、GE Healthcare Life Sciences)により精製されたrecA1PIの試料のクロマトグラムを示す図である。 免疫親和性クロマトグラフィー(すなわち、ATT Select樹脂、GE Healthcare Life Sciences)により精製されたrecA1PIの試料のUV-Visスペクトルを示す図である。 Superdex(商標)200調製等級樹脂(GE Healthcare Life Sciences)を使用するゲル濾過(すなわち、サイズ排除)クロマトグラフィーにより精製されたrecA1PIの試料のクロマトグラムを示す図である。 Superdex(商標)200調製等級樹脂(GE Healthcare Life Sciences)を使用するゲル濾過(すなわち、サイズ排除)クロマトグラフィーにより精製されたrecA1PIの試料のUV-Visスペクトルを示す図である。 黄色を呈する、細胞培養由来のヒト組換えA1PIの3つの試料のUV-Visスペクトルを示す図である。試料1は4Mの塩酸グアニジン(Gdn-HCl)を含有し、試料2は50mMのジチオスレイトール(DTT)を含有し、試料3は4MのGdn-HClと50mMのDTTの両方を含有している。 50mMのDTTで処理され、次にゲル濾過クロマトグラフィーにより精製されたrecA1PIのクロマトグラムを示す図である。 DTT処理なしで、次にゲル濾過クロマトグラフィーにより精製されたrecA1PIのクロマトグラムを示す図である。 recA1PI、50mMのDTTで処理されたrecA1PIおよび高度に精製された血漿由来A1PIの試料のUV-Visスペクトルを示す図である。 recA1PI、50mMのDTTで処理されたrecA1PIおよび10mMのDTTで処理されたrecA1PIの試料のUV-Visスペクトルを示す図である。 PBS中50mMのDTTのゲル濾過クロマトグラフィー運用(run)からのクロマトグラムを示す図である。 PBS中50mMのDTTで処理されたrecA1PIのゲル濾過クロマトグラフィー運用からのクロマトグラムを示す図である。 10mMのDTTで処理された精製血漿由来A1PIのゲル濾過クロマトグラフィー運用からのクロマトグラムを示す図である。 10mMのシステインで処理されたrecA1PIのゲル濾過クロマトグラフィーカラムからのクロマトグラムを示す図である。 システインインキュベーションステップを含む改訂されたrecA1PI精製手順のフローチャートを示す図である。システインインキュベーションは、疎水性相互作用クロマトグラフィー後または陽イオン交換膜を通過後(太字矢印)などの、プロセス中の他のステップで実施することが可能であることに留意されたい。 システインで処理されていないrecA1PIを用いたOctyl Sepharose(商標)上での疎水性相互作用クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。 10mMのシステインでの処理に続くrecA1PIを用いたOctyl Sepharose(商標)上での疎水性相互作用クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。 recA1PI、10mMのシステインで処理されたrecA1PIまたは高度に精製された血漿由来A1PIのUV-Visスペクトルを示す図である。
本明細書には、細胞培養由来の組換えアルファ1−プロテアーゼ阻害剤を精製し、recA1PIタンパク質と同時精製される有色種を取り除くための方法が記載されている。
本明細書に記載される一態様は、recA1PIを含有する水溶液から細胞培養由来の組換えヒトA1PIを精製する方法である。
本明細書に記載される別の方法は、細胞培養由来の組換えA1PIの溶液の呈色を減少させる方法であって、recA1PI溶液を還元剤と一緒にインキュベートするステップ、ならびに還元剤および有色腫(colored species)からrecA1PIを分離するステップを含む、方法である。
本明細書に記載される別の方法は、細胞培養由来の組換えA1PIを精製する方法であって、recA1PI溶液を還元剤と一緒にインキュベートするステップ、ならびに還元剤および還元種からrecA1PIを分離するステップを含む、方法である。
(実施例1)
細胞増殖およびヒト組換えA1PIの発現
要約
組換えヒトA1PIの発現は、グリコシル化されたヒトrecA1PIを発現するためのpAATopST3プラスミド構築物を含有するヒトPER.C6(登録商標)細胞(Crucell、Leiden、Netherlands)を培養することから始まる。これらの細胞は、高収量のグリコシル化されたrecA1PI、すなわち1日あたり細胞あたり(pcd)最大22ピコグラムのrecA1PIを産生することができる。PER.C6(登録商標)/recA1PI培養物は、10Lウェーブバイオリアクターおよび200Lバイオリアクターにより目標作業容積が150Lで一連のスケールアップステップを通じて採取された。recA1PIを含有する培養上清は、Celeros遠心分離機(Celeros Separations、Foxboro、MA)における6,000rpmでの遠心分離、続いて精製に先立つ濾過により13〜14日後に収穫された。
バイアル解凍および振盪フラスコ接種列(Inoculum Train)
細胞培養プロセスは、グリコシル化されたヒトrecA1PIを発現するためのpAATopST3プラスミド構築物を含有するPER.C6(登録商標)ヒト細胞のクリオバイアル(cryovial)を解凍することから始まった。ヒト組換えアルファ1プロテアーゼ阻害剤クローン、発現および発現された組換えA1PIの解析の説明は、国際公開第2010/127939号および米国特許出願第13/138,912号に記載されており、これら特許文献はそのような教示のために参照により本明細書に組み込まれている。細胞のバイアルを解凍した後、細胞は125mLの平底振盪フラスコに移され、0.5×106±0.1×106細胞/mLの目標生存細胞密度のために最終体積15〜25mLのCDM4PERMAb(商標)基本培地(Hyclone)にされた。125mLの振盪フラスコ(継代番号1)は、90rpm、36.5℃、5.0% CO2で96±4時間インキュベートされた。次に、細胞は250mLの平底振盪フラスコに移され、目標容積は100mL、生存細胞密度は0.5×106±0.1×106細胞/mLであった。250mLの平底振盪フラスコ(継代番号2)は、125rpm、36.5℃、5.0% CO2で72から96時間(±4時間)インキュベートされた。次に、細胞は500mLの平底振盪フラスコに移され、目標容積は250mL、生存細胞密度は0.5×106±0.1×106細胞/mLであった。500mLの平底振盪フラスコ(継代番号3)は、125rpm、36.5℃、5.0% CO2で72から96時間(±4時間)インキュベートされた。次に、細胞は1Lの平底振盪フラスコに移され、目標容積は600mL、生存細胞密度は0.5×106±0.1×106細胞/mLであった。1Lの平底振盪フラスコ(継代番号4)は、125rpm、36.5℃、5.0% CO2で72から96時間(±4時間)インキュベートされた。
ウェーブバイオリアクター接種列
1Lの振盪フラスコから一定体積を、20/50EH Wave(商標)バイオリアクター(GE Healthcare Life Sciences)上の10LのCellbag(登録商標)に移し、3.0〜4.0Lの作業体積および0.5×106±0.1×106細胞/mLの生存細胞密度を得た。10LのCellbag(登録商標)は、25rpm、7°ロッキング角度、1分あたり0.2リットル(lpm)の空気流量、36.5℃および3.0% CO2で72から96時間(±4時間)動作させた。10LのCellbagから一定体積を、20/50EHウェーブバイオリアクター上の50LのCellbag(登録商標)に移し、22〜25Lの作業体積および0.5×106±0.1×106細胞/mLの生存細胞密度を得た。50LのCellbag(登録商標)は、22rpm、7°ロッキング角度、0.3lpmの空気流量、36.5℃および3.0% CO2で72から96時間(±4時間)動作させた。
200Lバイオリアクター
50LのCellbag(登録商標)の内容物を、無菌Kleenpak(商標)接続(Xcellerex、Marlborough、MA)を通してXcellerex 200Lバイオリアクターに移した。200Lバイオリアクターは、最小量(100L)のCDM4PERMAb(商標)基本培地(Hyclone)を含有し、接種物を添加する前に7.2±0.4の範囲のpHで、36.5℃、120rpmで作動可能となるようにする。目標作業体積は、生存細胞密度0.6×106細胞/mL±0.1×106細胞/mLで150Lであった。pHデッドバンド(何の作用も起こらないシグナル範囲領域)は7.2±0.4であり、溶存酸素設定値は50%であった。pHは、1Nの炭酸ナトリウムまたはCO2ガスを添加することにより維持された。96時間(±4時間)で、PerMAB(商標)流加培地(Hyclone)がバイオリアクター中の最初の作業体積の0.3%に等しい一日ボーラスショット(a daily bolus shot)として添加され、流加培地は流速100〜300mL/分で添加された。流加培地は運用(run)中室温で維持され、光による分解を防ぐために覆いをされた。消泡剤は運用開始時に12ppmで添加され、バイオリアクター中の2インチまたはそれ未満の泡レベルを維持するために僅かに増分して添加された。200Lのバイオリアクターは308〜340時間(12.8〜14.2日)で収穫された。
遠心分離および濾過
200Lのバイオリアクターから材料を、流速0.5lpm、遠心分離速度6,000rpmでCeleros APD-75 1Lボウル(Celeros Separations、Foxboro、MA)に移した。移す前に固体百分率(percent solids value)を計算し、必要とされるボウル放出(bowl discharges)の数を決定した(1Lボウルは1kgの固体を保持することができる)。遠心分離液(遠心分離の後の清澄化した溶液)を、2つの1.1m2 A1HCフィルターを含有するMillipore Pilot PODホルダー(EMD Millipore、Billerica、MA)に1lpmに移した。深層濾過後、材料を、0.5/0.2μm Millipore SHCフィルターを通して濾過した。
(実施例2)
細胞培養上清からのヒト組換えA1PIの精製
要約
recA1PIの精製は、ウイルス不活化のための3時間溶剤/界面活性剤処理で始まる。次にrecA1PIは捕捉され、Capto(商標) Qカラム(GE Healthcare Life Science、Piscataway、NJ)から溶出された。次の日、精製はOctyl Sepharose(商標)カラムで続行された。HIC溶出液は限外濾過されダイアフィルトレーション(diafilter)されて、S−膜精製を続いて追加のウイルス排除のためのナノフィルトレーション(nanofiltration)を可能にした。この材料は最終製剤バッファー(formulation buffer)にバッファー交換され、タンパク質濃度は調整されて処方バルクformulated bulk)を作製した。
細胞培養上清のウイルス不活化
深層濾過された細胞培養上清は秤量され、A280が読み取られ、サンプリングのためにアリコートが採取された。このウイルス不活化ステップのための温度およびpH設定点は、28℃±2℃およびpH 7.8±0.2であった。TNBP/ポリソルベート20の100×貯蔵液は、0.5kgのポリソルベート20、0.06kgのトリ−(n-ブチル)リン酸(TNBP)および注射用蒸留水(WFI)を混合して1リットルの混合液を作ることにより調製されて、処理用に使用された。この貯蔵液は100倍希釈で細胞培養上清に添加され、処理は撹拌しながら2.5時間実施された。最終濃度はポリソルベート20で0.5%、TNBPで0.03%であった。TNBP/ポリソルベート20処理に続いて、細胞培養上清は濾過された。
濾過
Cuno 120ZAフィルターディスク(3M、St.Paul、MN)は、少なくとも10分間最大1L/分で熱注射用蒸留水(HWFI)ですすがれた。これに続いて、少なくとも2Lの冷注射用蒸留水(CWFI)ですすがれ、最後は20psiで風乾された。TNBP/ポリソルベート20処理細胞培養上清は、少なくとも20pisの空気圧および1L/分以下の流速を使用してこのフィルターを通した。アリコートはサンプリングおよび保存(retains)のために採取された。
陰イオン交換クロマトグラフィー
このステップは、recA1PIを捕捉し通過画分中の宿主細胞タンパク質(HCP)を取り除く働きをする。30cm内径×14cmベッド高カラムを使用した(10Lベッド容量)。TNBP/ポリソルベート20処理細胞培養上清のpHは、戻して7.0±0.1に調整された。カラム負荷に先立つ溶剤/界面活性剤処理上清の伝導率が測定された。周囲のWFI希釈液の量は、確実に伝導率がインライン希釈液を用いたカラム負荷中に4mS/cm以下になるように決定された。
Unicornプログラム(GE Healthcare Life Science)を使用してCapto(商標)Qカラム(GE Healthcare Life Science)を運用させ、クロマトグラフィーシステムの吸込み管路は適切なバッファータンク内に置かれた。Durapore 0.3μmインラインフィルター(Millipore)はクロマトグラフィー運用ごとに交換された。Capto(商標)Qカラムは、1カラム容量(CV)の0.5M氷酢酸で前平衡化され、続いて5CVの20mM Na2HPO4、pH6.0で平衡化された。細胞培養上清は、注射用蒸留水(WFI)を用いたインライン希釈によりCapto(商標)Qカラム上に負荷された。クロマトグラフィースキッド(skid)は、4mS/cm以下の伝導率、300cm/時の直線流速で負荷を実施するようにプログラムされた。負荷に続いて、WFIを用いたブリーフチェイスを行った。カラムは、20mM Na2HPO4、pH6.0を用いた2CV再平衡化に先立って、8CVの洗浄バッファー(20mM Na2HPO4、20mM NaCl pH6.0)で洗浄された。溶出は、25mM Na2HPO4、200mM NaCl、pH7.0で終わる8CV勾配を使用してまたはNaCl濃度の段階的増加により実現された。recA1PIの単回溶出ピークは、4CVで開始して勾配中に収集され、収集は0.10AUのUVウォッチゲートで終わる。溶出画分は試験のために試料採取され、保持された。L−システインは濃度10mMで溶出液プールに添加され、室温で一晩混合させておいた。
Octyl Sepharose(商標)FFを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー
45cm内径×9cmベッド高カラム(15Lベッド容量)Octyl Sepharose(商標)4 FF疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラム(GE Healthcare Life Science)は、8CVのHIC平衡バッファー(25mM Na2HPO4、0.1M NaCl、1.75M硫酸アンモニウム、pH7.0)で平衡化された。A1PIおよびシステインを含有するCapto Q溶出液は、Octyl希釈バッファー(25mM Na2HPO4、0.1M NaCl、3M (NH4)2SO4、pH7.0)を用いたインライン希釈により流速150cm/時で負荷されて、負荷物質中最終濃度1.75M(NH4)2SO4を達成した。負荷に続いて、カラムは5CVのHIC平衡バッファーで洗浄された。溶出は、洗浄バッファー中1.75Mの硫酸アンモニウムから10CVを超える溶出バッファー(20mM Na2HPO4、pH6.0)までの逆塩勾配を用いて実現された。フロントでは0.05AUおよびテイルでは0.10AUのUV吸収度ウォッチコマンドを使用して溶出液プールを収集した。
HIC溶出液の限外濾過およびダイアフィルトレーション
3つの30kDa分画分子量(MWCO)0.1m2膜は、透過分と残余分のpHが5から7までの間になるまで40〜50℃のWFIで洗い流された。フィード圧は25(たとえば、24から28の範囲)psigの目標に設定され、出口圧は5psig(たとえば、4から8psigの範囲)に設定された。システムは、少なくとも10分間1〜2LのHIC溶出バッファーで平衡化された。HIC溶出液は混合され、温度は15〜25℃に維持された。透過量はモニターされ、UFは濃度が30のA280目標に到達した時点で停止された。フィードの容量の減少に続いて、ダイアフィルトレーションは6ダイア容量(DV)の陽イオン平衡バッファー(10mMクエン酸ナトリウム、pH5.4)を用いて実施された。残余分のA280は、確実にそれが≦30になり、残余分が清潔な容器内に流失するように確認された。2つの体積1Lの陽イオン平衡バッファーはそれぞれが、少なくとも5分間10〜15psigのフィード圧で再循環された。リンスは残余分と組み合わされた。
S膜を使用する陽イオン交換クロマトグラフィー
膜表面積が2500cm2のSartobind(登録商標)S−膜1回使い切りカプセル(Sartorius、Gottingen、Germany)は、確実に溶出液の伝導率が4mS/cm以下であるようにして陽イオン平衡バッファー(10mMクエン酸ナトリウム二水和物、pH5.4)で平衡化された。UF/DF処理HIC溶出液は、蠕動ポンプを使用して25L/時でS-膜上に負荷され、それに続いてA280が0.1AU以下になるまで陽イオン平衡バッファーで洗浄された。通過画分は収集されpH7.0±0.1に調整された。
ナノフィルトレーション
ナノフィルトレーションは、Viresolve(登録商標)PreFilter(0.11m2)付のViresolve(登録商標)NFP(0.085m2、Millipore)を使用して実施された。濾過は、50psi以下の圧力缶を用いた定圧によった。ナノフィルターは、4回の体積500mLの陽イオン平衡バッファーですすがれた。
最終限外濾過/ダイアフィルトレーション
膜面積が0.3m2の10kDa MWCO膜がこのステップでは使用された。ホルダーと膜は透過分と残余分のpHが5と7の間になるまで40〜50℃のWFIで洗い流された。フィード圧は25psig(24から28psiの範囲)の目標に設定され、出口圧は5psig(4から8psiの範囲)に設定された。システムは、少なくとも10分間1〜2Lの20mM Na2HPO4、pH7.0で平衡化された。ナノ濾過液はよく混合され、温度は15〜25℃に維持された。透過分は、<0.04であるべき280nm(すなわち、A280)でのその吸光度を測定することによりrecA1PIの喪失について定期的に検査された。この値を超えた場合は、UF/DFは停止された。透過量はモニターされ、UFは濃度が約30のA280目標に到達した時点で停止された。フィードの体積の減少に続いて、ダイアフィルトレーションは5DVのダイアフィルトレーションバッファー(20mM Na2HPO4、120mM NaCl、pH7.0)を用いて実施された。残余分のA280は、確実にそれが≦30になり、残余分が清潔な容器内に流失するように確認された。残余分に添加されると、最終濃度50〜56mg/mLを生じることになるダイアフィルトレーションバッファーリンスの量が計算された。このリンス体積は半分に分けられ、それぞれの体積は、3〜5分間20psig以下のフィード圧で再循環された。リンスは残余分と組み合わされた。
貯蔵
濃縮されたバルク組換えA1PIはFlexel(登録商標)バッグ(Sartorius)中に無菌濾過され、最終充填に先立って-70℃で貯蔵された。
上記の方法により生成されたrecA1PIは際立った黄色を呈しているのが分かった。黄色種の素性は未知であった。recA1PIは高純度で活性であったが、美的な理由から黄色の色素の除去が望まれた。
(実施例3)
アルファ−1アンチトリプシンセレクト樹脂を用いる免疫親和性クロマトグラフィー
精製されたrecA1PIから黄色種を分離することができるかどうかを判定するために、A1PI特異的免疫親和性カラムを実施した。1.6cm内径×10cmベッド高カラム(20mLのカラム容量)の血漿由来H1PIに特異的であるアルファ−1アンチトリプシンセレクト樹脂(AAT-Select; GE Healthcare Life Science)が充填された。カラムは20mM Tris-HCl、pH7.4で平衡化された。10mg/mLのrecA1PIのおよそ200mgをこのカラムに5ml/分で負荷した。カラムは20mM Tris-HCl、pH7.4、100mM NaClで洗浄し、20mM Tris-HCl、pH7.4、2M NaClで溶出した(図3参照)。画分はピーク分画に基づいて収集された。溶出ピーク下の画分をプールし、Amicon UltraCel(商標) 30kDa MWCO濃縮機(EMD Millipore、Billerica、MA)を使用して濃縮した。UV-Visスペクトルは濃縮試料から得られた。
濃縮に続く溶出液の色ははっきりした黄色であった。UV-Vis分光法により分析すると(図4参照)、スペクトルは免疫親和性カラムに流す前のrecA1PIについて見られたスペクトルと非常に類似していた。この結果から、免疫親和性クロマトグラフィーはrecA1PIから黄色を分離するのには効果がないことが結論された。
(実施例4)
Superdex(商標)200樹脂を用いるゲル濾過クロマトグラフィー
recA1PIから黄色種を取り除くためにゲル濾過実験(akaサイズ排除クロマトグラフィー;SEC)も試みた。1.6cm内径×90cmカラム(ベッド容量181mL)のSuperdex(商標)200調製等級樹脂(GE Healthcare Life Science)が充填された。カラムはリン酸緩衝食塩水(PBS; 12mMリン酸、pH7.4、137mM NaCl、2.7mM KCl)で平衡化された。recA1PIはカラム容量の5%(9mL)で負荷され2mL/分(60cm/時)で流された。体積12mLの画分が分析のために収集された。
このカラムのクロマトグラムは図5に示されている。負荷は99% recA1PIであるが、おそらくUV検出器が飽和したせいで分裂したピークが観察された。このピーク下の画分はUV-Vis分光光度法により分析された(図6)。recA1PI画分は明白に黄色であり、これらの画分のUV-Visスペクトルは負荷物質のスペクトルに類似していた。したがって、ゲル濾過カラムはrecA1PIから黄色を取り除かなかった。
(実施例5)
変性剤および還元剤分析
免疫親和性とゲル濾過クロマトグラフィーはrecA1PIから黄色を取り除くのに成功しなかったので、変性剤および/または還元剤の使用が黄色を取り除くまたは減少するための潜在的手段として追求された。
およそ1mLのrecA1PIは8Mの塩酸グアニジンまたは500mMのDTTと混合されて、それぞれ最終濃度4Mの塩酸グアニジンまたは50mMのDTTが達成された。第三の試料は両試薬と混合された。試料は50℃でおよそ2時間インキュベートされ、個別にPD-10脱塩カラム(GE Healthcare Life Science)に通された。これらのカラムからの通過画分は、1000×gで5分間の遠心分離により収集された。
塩酸グアニジンは減少に役立たず、このことはこの試料のUV-Visスペクトルに反映されていた(図7)。50mM DTT処理試料は、塩酸グアニジン処理試料と比べて淡い黄色であった。この試料は、recA1PIに特徴的に観察される405nmでの分光シグネチャがなかった(図7)。グアニジンとDTTの組み合わせで処理された試料はおよそ無色であり、300〜400nm範囲でのスペクトル特徴が見当たらなかった。塩酸グアニジンとDTTの両方が黄色を減少するのに必要であるという事実は、黄色呈色種がrecA1PIに共有結合していることを示している可能性がある。
(実施例6)
還元およびゲル濾過クロマトグラフィー
PD-10カラムを用いて行われるDTT還元およびゲル濾過クロマトグラフィーをさらに追及するための追加に実験が実施された。ここでの目標は、もっと長いカラムを使用してDTT処理試料のさらに良好な分解能を達成し分析のためにもっと大量の還元されたrecA1PIを処理することであった。
1.6cm内径×90cmベッド高(181mLカラム容量)カラムのSuperdex(商標)200調製等級樹脂(GE Healthcare Life Science)が準備された。このカラムは5mMのDTTを含有するPBSで前平衡化された。9mLの体積のrecA1PI試料は、外気温で一晩濃度50mMのDTTで処理された。この試料はカラムに負荷され、負荷はカラム容量の5%を構成し、カラムには2mL/分(60cm/時)で流された。14.5mLの定容積画分が分析のために収集された。適切な画分がプールされ、Amicon UltraCel(商標)30kDa MWCO回転濃縮機(Millipore)を使用して、ふたたびおよそ50mg/mLまで濃縮された。DTTで処理されない対照試料も同一条件下で流された。
50mM DTT処理試料のクロマトグラムは図8に示されており、対照試料は図9に示されている。DTT処理試料を流したSECでははっきりしたもっと小さな二番目のピークが見られた。recA1PIを含有する画分B1〜B3はプールされ、30kDa MWCO回転濃縮機を使用して、およそ50mg/mLまで濃縮された。濃縮された試料はUV-Vis分光光度法により分析された。図10に示されるUV-Visスペクトルにより、黄色開始材料、recA1PIの特徴的シグネチャは還元されたゲル濾過溶出液からの濃縮物では著しく減少していることが明らかになっている。高度に精製された血漿由来ヒトA1PIは対照として使用された。
(実施例7)
DTT濃度分析
DTTのさらに低い濃度の効果は、recA1PIをDTTと一緒にインキュベートし、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して試料を精製し、次に濃縮され精製された試料のUV-Visスペクトルを得ることにより分析された。1.6cm内径×90cmベッド高(カラム体積181mL)カラムのSuperdex(商標)200調製等級樹脂(GE Healthcare Life Science)が使用された。このカラムは5mM DTTを含有するPBSで前平衡化された。9mLの体積中のrecA1PIは、外気温で一晩、適切な濃度のDTTで処理された。負荷はカラム体積の5%を構成し、カラムには2mL/分(60cm/時)で流された。14.5mLの定容積画分が分析のために収集された。適切な画分がプールされ、30kDa MWCO回転濃縮機を使用して、ふたたびおよそ50mg/mLまで濃縮された。
10mM DTTおよび50mM DTTで処理された試料のUV-Visスペクトルは、黄色呈色recA1PIの特徴的スペクトルシグネチャを減少させるのに10mM DTT濃度が50mM DTTと同じ程度に効果的であることを明らかにしている(図11)。
(実施例8)
DTT処理ゲル濾過精製recA1PIに対する生化学分析的分析
MALDI TOF分析
マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間質量分析実験はrecA1PIに対して実施された。予想では、DTT処理により発生し黄色を呈する小さなピークは質量分析により同定可能な種を含有している可能性があるというものであった。しかし、これらの試料中では何も同定されなかった。マトリックス効果が100〜10,000Da範囲の分子のイオン化を妨害していた可能性がある。
鉄濃度
鉄イオンが潜在的黄色源として疑われた。鉄は細胞培養では不可欠な遷移金属であり、クエン酸鉄アンモニウムFex(NH4)yC6H5O7として上流の細胞培養培地に添加される。鉄分析により、ゲル濾過カラム由来のDTT還元recA1PIのプールされた画分の鉄含有量は、66μMの鉄を有していた開始材料と比べて約30分の1に減少していることが明らかになった。図13を参照されたい。クロマトグラム上の矢印により示される黄色種は負荷量由来の鉄の約50%を有していた。
活性分析
主ピーク画分以外では、もっと小さなピーク画分のどれもrecA1PI活性を有してはいなかった。
(実施例9)
DTTゲル濾過分析
recA1PIの非存在下でのDTTのクロマトグラフプロファイルを調べるためにクロマトグラフィー運用はrecA1PIの非存在下、DTT単独で完了された。recA1PI試料を流された試験において見られた同一溶出体積の最後のピークに一致する単一ピークが201mLの溶出体積を用いて観察された(図12)。図13において矢印で示されるピークに対応する僅かに黄色の画分はDTT処理recA1PI試料に特有であり、DTTのみを流される対照では存在しない。
(実施例10)
10mM DTTを用いた精製血漿由来A1PIの処理
還元剤で処理しても黄色は同様に減少するのかどうかを判定するために、黄色い外見をしている血漿由来A1PI生成物が試験された。およそ50mg/mLの血漿由来A1PIの10mLアリコートは、最終濃度10mMのDTTで処理された。Superdex(商標)200調製等級樹脂(GE Healthcare Life Science)でのゲル濾過クロマトグラフィーは本明細書に記載される通りに実施された。DTT処理血漿由来recA1PIを用いた運用からのクロマトグラムは図14に示されている。
主ピーク下のrecA1PIに対応する画分はプールされ、50mg/mLまで濃縮された。試料の色は未処理の試料の色とは全く違いはなかった。これにより、細胞培養由来のrecA1PIの黄色源は血漿由来recA1PIの黄色源とは異なることが示された。
(実施例11)
還元剤としてのシステインの分析
システインは安価で入手しやすいために、代替の還元剤として試験された。さらに、アミノ酸としてシステインは許容される賦形剤である。実験はアリコートのrecA1PIが10mMのシステインで処理され、ゲル濾過カラム上で処理されたところで完了した。運用のクロマトグラムは図15に示されている。recA1PIに対応する画分がプールされ、50mg/mLまで濃縮された。システインも還元剤として許容可能であった。
(実施例12)
色分析
10mM濃度のDTTまたはシステインのいずれかで処理された試料の色を比較することにより、比較可能なタンパク質濃度(約50mg/mL)での黄色の実質的な減少が明らかにされている。A280/A405比は試料の黄色度の指標として追跡され、理論的根拠は、405nmでの溶液の吸光度は黄色の定量的測度であることである。さらに高いA280/A405比は試料のもっと淡い黄色に対応する。未処理試料の顕著な黄色は、DTTまたはシステインのいずれを用いた処理でも大部分取り除かれる。しかし、黄色の除去は完全ではなく薄い黄色の色合いが処理試料に残る。A280/A405比はこの傾向を十分にたどり、典型的には還元剤での処理に続いて3分の1の減少が見られる。高度に精製された血漿由来A1PIは、A280/A405比428で事実上澄んでいる。
細胞培養由来の組換えA1PI活性の回収
サイズ排除クロマトグラフィーおよび還元剤での処理を用いた実験からのA1PI活性の回収は80〜100%に及んだ(表1参照)。
鉄含有量
処理された試料の鉄含有量は、還元剤を用いた処理およびクロマトグラフィー精製後かなり減少した。還元され精製された試料は、誘導結合型プラズマ原子吸光分析(ICP-AA)を使用して分析された。鉄濃度減少の程度は、未処理試料と比べた場合、システイン処理試料でのおよそ14倍から10mM DTT処理試料での27倍に及んだ(表2)。
(実施例13)
改訂recA1PI精製手順:陰イオン交換クロマトグラフィーに続く還元剤添加およびインキュベーション
図16は改訂recA1PI精製手順のフローチャートを示しており、これではシステインがプールされた陰イオン交換溶出液に添加される。改訂された手順は以下の通りである。溶剤/界面活性剤ウイルス不活化ステップ後、質量11.2kgの細胞培養上清は、5cm内径×25cmベッド高(500mL)Capto(商標)Qカラム(GE Healthcare Life Sciences)上300cm/時で精製された。カラムは20mM Na2HPO4、pH6.0中で平衡化され、20mM Na2HPO4、20mM NaCl、pH6.0で洗浄され、25mM Na2HPO4、200mM NaCl、pH7.0で8CVにわたり溶出された。Q−溶出液のA280は2.4で、2g/Lの近似効力に相当していた。活性でおよそ1gのrecA1PIを含有するこのQ−溶出液の500mLアリコートは10mMシステイン(Acros Chemicals;Thermo Fisher Scientific; New Jersey)で処理され、室温で一晩(約25℃で約16時間)インキュベートされた。処理された試料はHIC希釈バッファー、25mM Na2HPO4、100mM NaCl、3M(NH4)2SO4、pH7.0を用いて42対58で希釈され、これを使用して、寸法5cm内径×10.3cmベッド高(202mLのベッド体積)のOctyl Sepharose(商標)カラムに負荷した。カラムは25mM Na2HPO4、100mM NaCl、1.75M(NH4)2SO4、pH7.0で平衡化され、10CVにわたり20mM Na2HPO4、pH6.0の勾配で溶出された。620mLの溶出液体積はLabScale(商標)TFFシステムおよびPellicon(登録商標)30kDa、3×50cm2フィルター(Millipore)を使用して50mLまで濃縮された。試料は、3,500rpm、4℃での遠心分離によりAmicon UltraCel(商標)30kDa MWCO濃縮機(Millipore)を使用して50mg/mLまでさらに濃縮された。次に、濃縮された試料は、10mMクエン酸ナトリウムバッファー、pH5.4で平衡化されたSartobind(登録商標)S−膜カプセル(Sartorius、Gottingen、Germany)に通した。この試料は5カラム容積のPBSに対してダイアフィルトレーションされた。
対照運用も、システインの非存在下、同一体積のQ−溶出液を使用して実施され、同一の方法でHICカラム上で処理された。対照およびシステイン処理された試験試料のHICクロマトグラフプロファイルは比較可能であった(図17および図18参照)。これは、システインを添加しても疎水性相互作用カラム上ではrecA1PIの精製プロファイルに変化はないことを示していた。試料をおよそ50mg/mLまで濃縮した場合、A280/A405比の3.4倍の改善(すなわち、73対245)に相当する黄色の実質的減少が観察された。UV-Visスペクトルもこの違いを反映しており、システイン処理試料のプロファイルは高度に精製された血漿由来A1PIのプロファイルに匹敵していた(図19参照)。
したがって、分取スケール運用における陰イオン交換カラムと疎水性相互作用クロマトグラフィー間の一晩システインインキュベーションは、黄色排除およびA280/A405比の相当する改善に関してベンチスケール実験に匹敵する結果を生じる。
本明細書に記載される装置および方法の範囲は、本明細書に記載される実施形態、態様、実施例、ステップおよび優先度のあらゆる組み合わせを含む。

Claims (54)

  1. 細胞培養由来のアルファ1プロテイナーゼ阻害剤(recA1PI)を含む溶液中の色素の量を減少させる方法であって、recA1PIを含む溶液を還元剤と一緒にインキュベートするステップ、および色素からrecA1PIを分離するステップを含む、方法。
  2. 還元剤がシステインまたはDTTである、請求項1に記載の方法。
  3. 還元剤がシステインである、請求項1に記載の方法。
  4. 還元剤濃度が約1mMから約100mMである、請求項1に記載の方法。
  5. 還元剤濃度が約10mMである、請求項1に記載の方法。
  6. 還元剤濃度が約1mMである、請求項1に記載の方法。
  7. 還元インキュベーションステップが約1から約24時間の時間実施される、請求項1に記載の方法。
  8. 還元インキュベーションステップが約2℃から約60℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
  9. 還元剤が10mMのシステインでありインキュベーションがほぼ室温で一晩実施される、請求項1に記載の方法。
  10. 色素からrecA1PIを分離するステップがクロマトグラフィーを含む、請求項1に記載の方法。
  11. クロマトグラフィーがイオン交換、疎水性相互作用、ゲル濾過、親和性、免疫親和性またはそれらの組み合わせを含む、請求項10に記載の方法。
  12. 鉄濃度を減少させるステップを含む、請求項1に記載の方法。
  13. 鉄濃度が1/2から1/100に減少(すなわち、低下)される、請求項12に記載の方法。
  14. 鉄濃度が1/5から1/50に減少(すなわち、低下)される、請求項12に記載の方法。
  15. 鉄濃度が10μMまたはそれ未満である、請求項12に記載の方法。
  16. 鉄濃度が1μMまたはそれ未満である、請求項12に記載の方法。
  17. recA1PIを含む水溶液から細胞培養由来のヒトA1PIを精製する方法であって、
    (a)recA1PIを含有する溶液にウイルス不活化ステップを実施するステップ、
    (b)recA1PIが陰イオン交換体に結合するようにウイルス不活化溶液を陰イオン交換体に通すステップ、
    (c)陰イオン交換樹脂からrecA1PIを溶出させるステップであって、recA1PIを含有する陰イオン交換溶出液を得る、溶出させるステップ、
    (d)recA1PIを含有する陰イオン交換溶出液に還元剤を添加するステップであって、還元溶液を得る、添加するステップ、
    (e)還元溶液をインキュベートするステップ、
    (f)recA1PIがHIC樹脂に結合するように、還元溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂に通すステップ、および
    (g)HIC樹脂からrecA1PIを溶出させるステップであって、recA1PIを含有するHIC溶出液を得る、溶出させるステップを含む、方法。
  18. ウイルス不活化が溶剤/界面活性剤インキュベーションを含む、請求項17に記載の方法。
  19. 溶剤が0.01%から約0.5%の範囲で添加される、請求項18に記載の方法。
  20. 界面活性剤が、得られた混合物の単位体積当たりの重量として約0.5%から約2.0%添加される、請求項18に記載の方法。
  21. 溶剤/界面活性剤インキュベーションが、約8のpHおよび約30℃の温度で、約0.5%のポリソルベート20および約0.03%のトリ(n−ブチルリン酸)を添加するステップを含む、請求項18に記載の方法。
  22. 陰イオン交換体が第四級アンモニウム樹脂である、請求項17に記載の方法。
  23. 第四級アンモニウム樹脂がCapto(商標)Qである、請求項22に記載の方法。
  24. 還元剤がシステイン(Cys);システアミン;ジチオスレイトール(DTT);ジチオエリトリトール(DTE);グルタチオン(GSH);2−メルカプトエタノール(2-ME);2−メルカプトエチルアミン(2-MEA);トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP);シュウ酸;ギ酸;アスコルビン酸;ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH);ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH);またはそれらの組み合わせである、請求項17に記載の方法。
  25. 還元剤がシステインまたはDTTである、請求項17に記載の方法。
  26. 還元剤がシステインである、請求項17に記載の方法。
  27. 還元剤濃度が約1mMから100mMである、請求項17に記載の方法。
  28. 還元剤濃度が約10mMである、請求項17に記載の方法。
  29. 還元剤濃度が約1mMである、請求項17に記載の方法。
  30. 還元インキュベーションステップが約1から24時間実施される、請求項17に記載の方法。
  31. 還元インキュベーションステップが約2℃から60℃で実施される、請求項17に記載の方法。
  32. 還元剤が10mMのシステインであり、インキュベーションがほぼ室温で一晩実施される、請求項17に記載の方法。
  33. HIC樹脂がOctyl Sepharose(商標)またはCapto(商標)Octylである、請求項17に記載の方法。
  34. 鉄濃度を減少させるステップを含む、請求項17に記載の方法。
  35. 鉄濃度が1/2から1/100に減少(すなわち、低下)される、請求項34に記載の方法。
  36. 鉄濃度が1/5から1/50に減少(すなわち、低下)される、請求項34に記載の方法。
  37. 鉄濃度が10μMまたはそれ未満である、請求項34に記載の方法。
  38. 鉄濃度が1μMまたはそれ未満である、請求項34に記載の方法。
  39. 細胞培養由来のアルファ1プロテイナーゼ阻害剤(recA1PI)を精製する方法であって、recA1PIを含む溶液を還元剤と一緒にインキュベートするステップ、ならびに還元剤および還元種からrecA1PIを分離するステップを含む、方法。
  40. 還元剤がシステインまたはDTTである、請求項39に記載の方法。
  41. 還元剤がシステインである、請求項39に記載の方法。
  42. 還元剤濃度が約1mMから約100mMである、請求項39に記載の方法。
  43. 還元剤濃度が約10mMである、請求項39に記載の方法。
  44. 還元剤濃度が約1mMである、請求項39に記載の方法。
  45. インキュベーションステップが約1から約24時間の時間実施される、請求項39に記載の方法。
  46. インキュベーションステップが約2℃から約60℃の温度で実施される、請求項39に記載の方法。
  47. 還元剤が約10mMのシステインであり、インキュベーションがほぼ室温で一晩実施される、請求項39に記載の方法。
  48. 還元剤および還元種からrecA1PIを分離するステップがクロマトグラフィーを含む、請求項39に記載の方法。
  49. クロマトグラフィーが、イオン交換、疎水性相互作用、ゲル濾過、親和性、免疫親和性またはそれらの組み合わせを含む、請求項48に記載の方法。
  50. 還元種が鉄を含む、請求項39に記載の方法。
  51. 鉄濃度が1/2から1/100に減少(すなわち、低下)される、請求項50に記載の方法。
  52. 鉄濃度が1/5から1/50に減少(すなわち、低下)される、請求項50に記載の方法。
  53. 鉄濃度が10μMまたはそれ未満である、請求項50に記載の方法。
  54. 鉄濃度が1μMまたはそれ未満である、請求項50に記載の方法。
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