CN102631672B

CN102631672B - 一种冻干灭活乙型脑炎疫苗

Info

Publication number: CN102631672B
Application number: CN201210131115.5A
Authority: CN
Inventors: 石慧颖; 任秀宝
Original assignee: TIANJIN BAINUOKE MEDICINE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Tianjin Jiacheng Shun long Trading Co., Ltd.
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-04-27
Also published as: CN102631672A

Abstract

本发明提供了一种乙脑全病毒冻干制剂，其包含：(a)灭活的乙脑全病毒；(b)稳定剂，其包含麦芽糖，乳糖，和任选地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸；以及任选地(c)缓冲剂，表面活性剂，等渗调节剂，和/或螯合剂。

Description

一种冻干灭活乙型脑炎疫苗

技术领域

本发明涉及一种新型冻干灭活乙型脑炎全病毒疫苗。

背景技术

流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis B，简称乙脑)的病原体1934年在日本发现，故又称日本乙型脑炎(Japanese Encephalitise)。乙脑病毒属披膜病毒科黄病毒属，球形病毒颗粒外有囊膜，对温度、乙醚等有机溶剂敏感。乙脑病毒经蚊虫传播，夏秋季流行。全球每年发病约50000例，主要流行地区为我国南方、东南亚及热带地区等国家，WHO建议所有乙脑流行国家均应实施乙脑疫苗免疫。

目前国际上使用的乙脑疫苗主要为全病毒乙脑灭活疫苗和减毒活疫苗。疫苗在运输和储存过程中保持良好稳定性是保证疫苗免疫效果的关键。与液体制剂相比，冻干疫苗具有更好的稳定性。目前我国绝大部分冻干疫苗含有动物源蛋白，如人血白蛋白、明胶等。人血白蛋白及明胶具有携带源自动物本身病毒等外源因子的潜在危险，同时，明胶或血清蛋白也常常引起疫苗受种者的过敏反应。因此有必要寻找一种适合于全病毒灭活疫苗的稳定的不含蛋白的赋形剂，尤其是适合于乙脑全病毒的稳定剂。另外，由于纯化疫苗中杂蛋白含量较低，与疫苗有效蛋白加在一起总蛋白含量也仅为100微克以内，病毒颗粒处于完全裸露状态，因此比起未经纯化的疫苗，纯化疫苗更加不稳定。本发明的目的就是建立一种不含明胶和人血白蛋白的稳定剂和赋形剂配方，使疫苗在冻干、储存及运输过程中保持良好的稳定性。

发明内容

本发明提供了一种乙脑全病毒冻干制剂，其包含：

(a)灭活的乙脑全病毒；

(b)稳定剂，其包含麦芽糖，乳糖，和任选地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸(优选地，精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸中的一种或更多种，更优选地为精氨酸)；

以及任选地

(c)缓冲剂(优选地，磷酸盐)，表面活性剂(优选地，tween80)，等渗调节剂(优选地钠盐，更优选地氯化钠)，和/或螯合剂(优选地EDTA或EDTA钠盐)。

在一个实施方式中，本发明的乙脑全病毒冻干制剂中稳定剂为麦芽糖，乳糖。在一个实施方式中，本发明的乙脑全病毒冻干制剂中稳定剂为麦芽糖，乳糖和海藻糖。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖和甘露醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，甘露醇和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖和甘露醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，甘露醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，山梨醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，甘露醇，山梨醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，山梨醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇和精氨酸。

在一个实施方式中，本发明的冻干制剂包含灭活的乙脑全病毒，麦芽糖，乳糖，甘露醇，氯化钠和磷酸盐缓冲剂。

在一个实施方式中，本发明的冻干制剂包含灭活的乙脑全病毒，麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，氯化钠和磷酸盐缓冲剂。

在一个实施方式中，本发明的冻干制剂包含灭活的乙脑全病毒，麦芽糖，乳糖，海藻糖，精氨酸，和磷酸盐缓冲剂。

本文所述稳定剂并不排除所述物质除了稳定作用之外还起其它作用，例如，所述麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇等物质还可以起赋形剂的作用。其它物质的命名(例如，缓冲剂，表面活性剂，等渗调节剂，螯合剂等等)也是类似的。

本发明的乙脑全病毒冻干制剂不包含动物源蛋白质，例如明胶和人血白蛋白。

本发明的乙脑全病毒冻干制剂中所述灭活的乙脑全病毒是以VERO细胞或者人二倍体细胞为基质生产的，优选地，采用生物反应器和无血清培养基培养细胞和繁殖病毒。

本发明的乙脑全病毒冻干制剂中所述灭活乙脑病毒采用下述方法灭活：将收获的病毒悬液经过超滤浓缩、超速离心纯化后用甲醛灭活。

本发明的乙脑全病毒冻干制剂在使用前需要进行重构，重构按照本领域的已知方法并根据生产商提供的说明书进行。例如，在一个实施方式中，本发明的冻干制剂用0.1-1ml注射用水/一次人用剂量(例如，0.4-0.6ml注射用水/一次人用剂量，例如0.5ml注射用水/一次人用剂量)进行重构。本文所述一次人用剂量优选地为一个包装单元的剂量，例如一瓶冻干制剂剂量。

在本发明的乙脑全病毒冻干制剂重构后的溶液中病毒的浓度为10-20微克/ml，并且总蛋白不高于20微克/ml，糖类(例如，麦芽糖，乳糖和海藻糖)的浓度(W/W)为1％-15％(例如，1-14％，1-13％，1-12％，1-11％，1-10％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％等)，例如，麦芽糖浓度(W/W)为1-10％(例如，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％等)，乳糖浓度(W/W)为1-10％(例如，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％等)，海藻糖浓度(W/W)为0-10％(例如，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％等)。

下述物质如果存在的话，其在所述冻干制剂重构后的溶液中的浓度分别为如下所述：甘露醇2％-20％(W/W)，山梨醇2-10％(W/W)，EDTA或者EDTA钠盐0.03-3％(W/W)，tween80 0.001-0.1％(W/W)，磷酸盐缓冲液10mM-100mM，氯化钠0.05-0.15M，精氨酸0.35～0.9mM，谷氨酸0.8～1.6mM，谷氨酰胺0.15～0.45mM，赖氨酸0.385～0.77mM。本文所用的“W/W”表示“重量/重量”。

在一个实施方式中，本发明冻干制剂中麦芽糖与乳糖的重量比为0.5∶1-1∶0.5，在一个实施方式中，所述重量比为0.6∶1-1∶0.6，在一个实施方式中，所述重量比为0.7∶1-1∶0.7，在一个实施方式中，所述重量比为0.8∶1-1∶0.8，在一个实施方式中，所述重量比为0.9∶1-1∶0.9，在一个实施方式中，所述重量比为1∶1。在一个实施方式中，本发明冻干制剂中麦芽糖与海藻糖的重量比为10∶1-2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为9∶1.2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为8∶1.2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为7∶1-2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为6∶1.2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为5∶1-2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为4∶1-2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为3∶1-2∶1，在一个实施方式中，所述重量比为5∶2。在一个实施方式中，本发明冻干制剂中麦芽糖∶乳糖∶海藻糖的重量比为5∶5∶2，在一个实施方式中，所述重量比为10∶5∶4，在一个实施方式中，所述重量比为10∶10∶1，在一个实施方式中，所述重量比为10∶5∶1。

本发明还提供了上述任一种乙脑全病毒冻干制剂重构所得的液体制剂。在一个实施方式中，所述液体制剂为用0.5ml注射用水将冻干制剂重构获得。

本文所述“包含”，“包括”等类似开放式用语也涵盖了“由......组成”的情形。

本发明与现有的疫苗相比具有显著的优越性。表1为本发明疫苗的一种配方与现有乙脑疫苗配方的比较：

表1现行乙脑疫苗赋形剂与本发明配方比较

成分	辽宁成大乙脑疫苗	天坛生物乙脑疫苗	本发明
				明胶	无	有，为主要辅料	无
人血白蛋白	有	有，为主要辅料	无
				麦芽糖	无	有，为主要辅料	有
乳糖	无	无	有
				海藻糖	无	无	有
甘露醇	无	无	有
				山梨醇	无	无	有

人血白蛋白可使病毒在较高温度下保持生物活性，因此，在病毒培养及冻干过程中均使用人血白蛋白作为病毒保护剂。我国目前免疫所用的乙脑灭活疫苗，每生产1000万人份需人血白蛋白20000g。人血白蛋白系由健康人血浆，经纯化、灭活病毒及冻干制成。人血白蛋白原材料来源珍贵，生产工艺复杂，成本高，而且资源有限，目前全国各医院的人血白蛋白已经严重供不应求，而随着疫苗种类的不断增加和疫苗市场的日益扩大，人血白蛋白的供求矛盾会愈加激烈，因此，从疫苗冻干赋形剂中省去人血白蛋白，利国利民，意义重大。

明胶是人用疫苗常用的另一种保护剂和赋形剂，来源于动物，其生产过程无法完全控制所有病毒的污染，而且，明胶与疫苗接种后过敏反应有关，WHO在多次疫苗生产相关指南上建议全球疫苗生产企业，尽可能采用明胶替代物作为疫苗的冻干赋形剂。本发明疫苗赋形剂中彻底摆脱了明胶，以来源方便，质量可控的麦芽糖、山梨醇、乳糖为原料，添加少量无机盐和氨基酸，获得了外观及溶解时间符合现行中国药典要求，稳定效果符合疫苗质量要求的新赋形剂配方。

本发明的冻干制剂相对于现有技术的优点包括形态好，溶解速度快，稳定期长，其特点包括：

1.没有动物来源的蛋白质和添加剂，如不含明胶、不合人血白蛋白。

2.成分明确，易于定量和定性，质量易于控制。

3.成本低，本发明赋形剂配方成本仅为含人白赋形剂(以1％计)的三十到六十分之一。

4.新配方乙脑疫苗的稳定性优于现行乙脑灭活疫苗。

附图说明

图1不同乙脑疫苗放置37度的抗原稳定性。

图2不同乙脑疫苗放置37度的效价稳定性。

图3不同乙脑疫苗放置2-8度的抗原稳定性。

图4不同乙脑疫苗放置2-8度的效价稳定性。

具体实施方式

实施例1

不同配方赋形剂冻干状态比较

a)乙脑病毒灭活原液的制备

用175cm2培养瓶(corning公司)复苏136代工作细胞库Vero细胞(ATCC，CCL81)1支，于二氧化碳孵箱内37度培养3-5天，弃去培养液，加入0.25％胰蛋白酶(GIBCO)消化3-5min，加入新鲜生长液(无血清培养基PV2，天津百若克公司)吹打分散细胞，1∶6分种至6个175cm2培养瓶，同样条件培养。如此传代扩增出24个10层1750瓶(Corning公司)，成致密单层后消化接种生物反应器。

采用APPLIKAN生产的7.5L细胞培养反应器；cytodex1微载体(GE公司)，浓度为20g/l。采用无血清培养基PV2，培养温度为37度，pH为7.2，溶氧50％，搅拌速度为60rpm。培养5-7天后，感染乙脑病毒P3株，为乙脑病毒的Vero细胞适应株P3V5，感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.01。

感染前，先降低培养温度至35度，停止灌流培养，降低转速至30rpm。将病毒稀释至病毒维持液内，缓慢泵入反应器，作用30分钟。逐渐提高转速，提高灌流速度。于感染后第二天开始收获病毒，连续收获7天。

病毒收获液经1.0、0.22微米滤膜(Millipore公司)多层过滤后，在垂直板超滤器(Sartorius公司)上经100KD截留分子量的超滤膜(Sartorius公司)超滤浓缩100倍。浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白(药用级，sigma公司)，使终浓度达到2.0mg/ml，2～8度作用过夜。次日8000g，离心30分钟，取上清液进一步蔗糖密度梯度区带离心。蔗糖密度梯度为5～60％(w/w)，2000rpm转速上样200ml，28000rpm，离心8小时。

收取抗原活性峰(ELISA阳性)，用100KD截留分子量的超滤膜和PBS透析除糖，收取糖浓度低于5％的病毒回流液。

在病毒透析液内加入甲醛，使甲醛终浓度为200微克/ml，置37度灭活2天。灭活到期后，取样进行灭活验证试验。证明病毒被完全灭活后，可用于后续配制试验。

b)乙脑病毒抗原测定方法

采用双抗体夹心法：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将乙脑病毒糖蛋白单抗稀释至2微克/ml，100微升/孔包板，2～8度16小时；次日用含有0.05％tween20的0.01M PBS洗板3次；用洗液稀释乙脑疫苗供试品和乙脑疫苗参考品(购自中国食品药品检定研究院)。将1∶2系列稀释的供试品和参考品加入板内，100微升/孔，每个样品加5个稀释度，37度作用1小时；洗板，去除未反应物质，加入1∶10000稀释(稀释液同上)的辣根过氧化物酶标记乙脑病毒糖蛋白单抗，37度继续作用1小时。洗去未作用酶标记物，加入pH5.2的邻苯二胺(OPD)柠檬酸磷酸缓冲液，100微升/孔，25度避光作用30分钟。用2N硫酸溶液终止反应，100微升/孔，震荡混匀后，于650nm波长测定。

用平行线法计算待检疫苗相对于疫苗参考品的相对效价。

c)乙脑疫苗效价测定

按照2010版《中国药典》(三部)冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)的效价测定方法。具体如下：

采用免疫小鼠中和抗体测定法，以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。参考疫苗以及中和试验阳性血清由中国食品药品检定研究院提供。

将被检疫苗(T)稀释成1∶32，参考疫苗(R)按要求的稀释度稀释，分别腹腔免疫体重为12-14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第二次免疫后7天眼眶采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56度灭活30分钟。稀释阳性血清、被检疫苗血清、参考疫苗血清，分别与稀释病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合，同时将稀释后的病毒液与正常小鼠血清等量混合，作为病毒对照。所有中和物置37度水浴90分钟，接种6孔细胞培养板BHK-21细胞，每孔0.4ml，置37度二氧化碳孵箱培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于37度二氧化碳孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算被检疫苗和参考疫苗相对于病毒对照的蚀斑减少率。病毒对照的蚀斑数应在50～150之间。

蚀斑减少率(％)＝(1-S/CV)×100；

其中，S为被检疫苗蚀斑数的平均值；

CV为病毒对照组蚀斑数的平均值。

按以下公式计算被检疫苗效力T值。

T＝(T-50)/47.762+lgX

式中，T为被检疫苗引起50％蚀斑减少的抗体稀释度的对数；

Y为被检疫苗的蚀斑减少数；

d)疫苗配制

表2100ml半成品不同赋形剂配方(ml)

e)冻干条件

各组采用相同冻干条件，同时冻干，具体条件如下：

预冻：-45度，2小时

干燥温度：-45度～30度

过程：维持-45度，0.02Mpa 4小时，然后每小时升高2度。

f)冻干疫苗外观检

表3冻干乙脑疫苗添加不同赋形剂冻干效果比较

g)结论

A组为传统赋形剂，含有人血白蛋白和明胶；B、C和D组配方中不含人血白蛋白和明胶，由10％麦芽糖和不同浓度的乳糖和甘露醇组成。D组没有乳糖和甘露醇，冻干后不成型，状态最差，不能满足稳定疫苗抗原的要求；C组虽然成型，但冻干体不结实，轻微震荡即成分散的碎块；B组和A组疫苗的冻干体状态最好，呈白色疏松体，可以整体摇动。即B组配方可以取代A组的人血白蛋白和明胶。

实施例2

不同海藻糖浓度的乙脑疫苗稳定性比较

a)乙脑疫苗灭活原液制备

方法同实验1，用双抗体夹心法测得灭活原液的抗原浓度为30EU/ml。

b)在实验1配方B的基础上，添加不同浓度海藻糖(2％、0.5％、0％)，然后将疫苗分别放置在4度和37度，定期取样，用双抗体夹心法测定各组疫苗的抗原含量，用小鼠免疫中和抗体测定法测定疫苗效价。

c)37度的抗原结果如图1，每两天测定一次抗原，随着疫苗在37度放置时间的延长，抗原含量有所下降，但含海藻糖2％组疫苗下降速度明显比另外两组低，即热稳定性优于不含海藻糖或者仅含0.5％的疫苗。

d)37度的效价结果如图2，含海藻糖2％疫苗效价下降速度最慢，即其37度稳定性明显优于另外两组。

e)4度放置24个月后，含海藻糖2％的疫苗抗原(图3)和效价(图4)均没有明显的下降趋势，而不含海藻糖和含0.5％海藻糖的疫苗均有不同程度的下降。

实施例3

冻干疫苗稳定性测定结果

a)疫苗制备

Vero细胞，139代，复苏扩增至5L反应器；cytodex1微载体，10g/L；

乙脑病毒：P3株的Vero细胞传代毒种P3V5。MOI，0.02

细胞培养温度：36.5度，搅拌速度：80RPM，80％溶解氧，pH7.2；

病毒培养温度：34.5度，搅拌速度：80rpm，80％溶解氧，pH7.8

病毒收获液经1.0+0.22微米过滤，用100KD超滤膜浓缩100倍，再经蔗糖密度梯度离心，超滤脱糖，甲醛灭活，测定灭活原液抗原浓度。

b)半成品配制：

用含有麦芽糖、乳糖、精氨酸、海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液配制半成品，使乙脑病毒抗原终浓度为3EU/ml。

c)分装冻干

配制后立即分装至西林瓶，0.5ml/支；然后冻干。

d)留样检定

将冻干疫苗分别置37度、25度、4度、-20度放置，定时取样，测定抗原浓度和效价。

e)结果

表4新型赋形剂冻干乙脑灭活疫苗37度稳定性测定结果

注：*放置时间，周。

表5新型赋形剂冻干乙脑灭活疫苗25度稳定性测定结果

注：*放置时间，周。

表6新型赋形剂冻干乙脑灭活疫苗4度稳定性测定结果

注：*放置时间，月。

表7新型赋形剂冻干乙脑灭活疫苗-20度稳定性测定结果

注：*放置时间，月。

结论

新型赋形剂冻干乙脑灭活疫苗，-20度和4度保存1.5年抗原和效价均未出现下降趋势，25度保存3个月抗原和效价依然稳定不变，37度保存1个月，抗原和效价保持不变。实验结果证明，新型赋形剂适于乙脑灭活疫苗的冻干和保存。新型赋形剂抛弃了明胶和人血白蛋白，是新一代理想的乙脑灭活疫苗赋形剂。

Claims

1.一种乙脑全病毒冻干制剂，其包含：

(a) 30EU/ml的纯化的灭活的乙脑全病毒；

(b) 稳定剂，其包含比例为10％的浓度为50％(W/W)的麦芽糖，比例为10％的浓度为50％(W/W)的乳糖，和比例为5％的浓度为50％(W/W)的甘露醇以及

(c) 比例为55％的浓度为0.01M 的磷酸盐缓冲剂，比例为10％的浓度为9％(W/W)的氯化钠等渗调节剂。

2.权利要求1的乙脑全病毒冻干制剂，还包含浓度为2％(W/W)的海藻糖。

3.权利要求1的乙脑全病毒冻干制剂，其中乙脑全病毒的生产采用无血清培养基。

4.权利要求1-3中任一项的乙脑全病毒冻干制剂，所述制剂不包含动物源蛋白质。

5.权利要求4的乙脑全病毒冻干制剂，其中所述动物源蛋白质是明胶。

6.权利要求4的乙脑全病毒冻干制剂，其中所述动物源蛋白质是人血白蛋白。

7.权利要求1-3中任一项的乙脑全病毒冻干制剂，所述灭活的乙脑全病毒是以VERO细胞或者人二倍体细胞为基质生产的。

8.权利要求7的乙脑全病毒冻干制剂，其中采用生物反应器和无血清培养基培养细胞和繁殖病毒。

9.权利要求7的乙脑全病毒冻干制剂，所述灭活乙脑病毒采用下述方法灭活：将收获的病毒悬液经过超滤浓缩、超速离心纯化后用甲醛灭活。

10.权利要求8的乙脑全病毒冻干制剂，所述灭活乙脑病毒采用下述方法灭活：将收获的病毒悬液经过超滤浓缩、超速离心纯化后用甲醛灭活。

11.由权利要求1-10任一项的乙脑全病毒冻干制剂重构所得的液体制剂。

12.权利要求11的液体制剂，其中所述液体制剂中病毒的浓度为10-20微克/ml，并且总蛋白不高于20微克/ml。

13.权利要求12的液体制剂，其中所述重构是用0.5ml注射用水/一次人用剂量进行的。