CN101537186B - 一种不含明胶的疫苗冻干保护剂 - Google Patents

一种不含明胶的疫苗冻干保护剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用作疫苗冻干保护剂的组合物，所述组合物所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：蔗糖30-100g/l、海藻糖10-30g/l、右旋糖酐10-50g/l、谷氨酸钠6-12g/l、尿素3-9g/l以及精氨酸0.5-2g/l，并且所述组合物中不含有明胶。本发明还提供了使用本发明的冻干保护剂制备冻干疫苗的方法以及本发明的冻干保护剂用于提高冻干疫苗的稳定性的用途。

Description

一种不含明胶的疫苗冻干保护剂
技术领域
本发明属于疫苗生产工艺技术领域，具体涉及一种不含明胶的疫苗保护剂的配方和使用方法。
背景技术
目前，预防性疫苗的应用使常见流行性传染病得到了有效控制，有效地降低了这些传染病的发病率和死亡率。但是，在贮藏、运输和临床使用过程中，应用现有生产工艺生产的疫苗产品不断地浮现一系列问题，诸如稳定性差，有效期短和不良反应率高等问题。随着疫苗的广泛应用和分子生物学和细胞生物学的飞速发展，研究发现，很多问题与疫苗产品的保护剂和佐剂有直接关系，特别是冻干疫苗产品中均需要使用冻干保护剂，其中的明胶或明胶衍生物能直接引起使被接种者过敏的变态反应。1993年，Kelso等报道，有些孩子对MMR联合疫苗过敏是由于疫苗中的明胶在被接种者机体内产生抗明胶分子的IgE抗体所致。明胶既可以引起细胞介导免疫反应，也可以引起非细胞介导免疫反应。为了减轻或避免在疫苗使用过程中出现的由明胶而引起的不良反应，专家们建议，使用明胶替代品或直接生产不含明胶的疫苗产品。
现有疫苗产品多数是以世界卫生组织所颁发的生物制品规程为标准生产的，标准中没有对保护剂中的明胶使用量明确加以限制。日本FDA于1986年批准的疫苗上市许可中，以及美国FDA批准的疫苗上市许可中，均没有把明胶作为生产疫苗的禁用成分。在早期的专利文献中，大多数生产技术的疫苗保护剂都含有明胶成分。
目前已经逐步开始研究和使用不含有明胶的疫苗产品。目前现有技术中不含明胶的疫苗保护剂虽然降低了对于人体的刺激性，但是对疫苗的保护效果不如常用的含有明胶的保护剂，使得疫苗在冻干过程中和储存过程中的稳定性下降，易发生失效。
目前，使用疫苗进行免疫接种已经成为世界各国预防流行病的主要手段。因此，本领域中急需一种改进的疫苗冻干保护剂，在降低对于人体的刺激性的同时仍能使疫苗具有较高的稳定性。
发明内容
本发明的发明人经过研究，发明了一种新的疫苗冻干保护剂，使用该保护剂得到的疫苗制品对于人体的刺激性大大降低，并且仍然能保持较高的稳定性和较长的有效期。
因此，本发明提供了一种用作疫苗冻干保护剂的组合物，所述组合物在用于疫苗的冻干过程时，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：人血清白蛋白3-20g/l、蔗糖30-100g/l、海藻糖10-30g/l、右旋糖酐10-50g/l、谷氨酸钠6-12g/l、尿素3-9g/l、精氨酸0.5-2g/l以及甘露醇10-100g/l，并且所述组合物中不含有明胶。
此外，本发明还提供了一种冻干疫苗的制备方法，其特征在于冻干过程中采用本发明的组合物。
此外，本发明还提供了本发明的组合物用于提高疫苗稳定性和安全性的用途。
本发明的冻干保护剂与现有技术的保护剂相比，对疫苗的保护效果更好。将本发明的冻干保护剂用于制备冻干疫苗时，可以提高疫苗在冻干过程和储存过程中的稳定性，并且大大提高了冻干疫苗产品对人体的安全性。
具体实施方式
因此，本发明提供了一种用作疫苗冻干保护剂的组合物，所述组合物在用于疫苗的冻干过程时，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：人血清白蛋白3-20g/l、蔗糖30-100g/l、海藻糖10-30g/l、右旋糖酐10-50g/l、谷氨酸钠6-12g/l、尿素3-9g/l、精氨酸0.5-2g/l以及甘露醇10-100g/l，并且所述组合物中不含有明胶。
在本发明的一个优选实施方案中，所述右旋糖酐为右旋糖酐70。
在本发明的另一个优选实施方案中，上述的本发明组合物中的蔗糖在冻干原液中的初始浓度为40-60g/l。
在本发明的又另一个优选实施方案中，上述的本发明组合物中的海藻糖在冻干原液中的初始浓度为10-30g/l。
在本发明的再另一个优选实施方案中，上述的本发明组合物中的甘露醇在冻干原液中的初始浓度为10-20g/l。
在本发明的第二方面，提供了一种冻干疫苗的制备方法，其特征在于在冻干过程中采用本发明的组合物。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种冻干水痘疫苗的制备方法，包括下列步骤：
(1)以水痘病毒Oka株为毒种，MRC-5株人二倍体细胞为培养基质；
(2)用培养基对MRC-5株人二倍体细胞进行扩增传代，其中细胞传代比例为1∶2-1∶4，以37℃培养3-5天；
(3)待MRC-5株人二倍体细胞生长成均匀、致密的单层细胞后，更换培养基维持液并加入毒种感染细胞；
(4)当MRC-5株人二倍体细胞出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用相当于维持液2倍-3倍体积的洗涤液洗涤细胞表面；
(5)加入疫苗液收获细胞培养物，所述疫苗液为含有3-20g/l人血清白蛋白、30-100g/l蔗糖、10-30g/l海藻糖、10-50g/l右旋糖酐、6-12g/l谷氨酸钠、3-9g/l尿素和0.5-2g/l精氨酸的199综合培养基或PBS缓冲液；
(6)将细胞培养物经-70℃以下冻融、超声破碎细胞、经澄清过滤后，即为原液；
(7)原液内加入终浓度为10-100g/l的甘露醇，进行冻干。
在上述方法的一个优选实施方案中，其中在步骤(3)中维持液为pH7.2-7.6、含2％-5％小牛血清的MEM培养基。
在上述方法的另一个优选实施方案中，其中在步骤(3)中毒种与细胞接种比例为1∶60-1∶250。
在上述方法的再另一个优选实施方案中，其中在步骤(4)中洗涤液为Earle’s液或PBS缓冲液。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，制备冻干水痘疫苗的方法具体如下所述：取人二倍体细胞MRC-5按1∶2-1∶4比例，以pH7.2-7.6、添加10-15％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基，37℃下，培养3-5天扩增传代，33代以内；待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，更换pH7.2-7.6、含2-5％小牛血清的MEM培养基维持液，在培养瓶内按毒种与细胞接种比例1∶60-1∶250加入水痘病毒0ka株感染细胞：当MRC-5细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液二倍体积以上的Earle’s液或PBS缓冲液洗涤细胞表面，洗去牛血清；加入含3-20g/l人血清白蛋白、30-100g/l蔗糖、10-30g/l海藻糖、10-50g/l右旋糖酐、6-12g/l谷氨酸钠、3-9g/l尿素和0.5-2g/l精氨酸的199综合培养基或PBS缓冲液，收获细胞培养物；将细胞培养物经-70℃以下冻融、20KHz超声破碎细胞、过滤收集上清液，即为原液；原液内加入终浓度为10-100g/l的甘露醇制成半成品，检定合格的半成品冰浴下分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干；检定合格即为冻干水痘疫苗成品。
实施例
制备实施例1
(1)取人二倍体细胞MRC-5按1∶2比例，以pH7.2、添加10％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基。
(2)37℃下，培养3天扩增传代33代以内。
(3)待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，更换pH7.2、含2％小牛血清的MEM培养基维持液，在培养瓶内按毒种与细胞接种比例1∶60加入水痘病毒0ka株感染细胞。
(4)当MRC-5细胞中75％以上出现典型病变时，倒去原维持液，用相当于原维持液二倍体积以上的Earle’s液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
(5)加入疫苗液收获细胞培养物；所述疫苗液为：含有10g/l人血清白蛋白、40g/l蔗糖、15g/l海藻糖、50g/l右旋糖酐70、6g/l谷氨酸钠、3g/l尿素和1g/l精氨酸的PBS缓冲液。
(6)将细胞培养物经-70℃以下冻融、20KHz超声破碎细胞、经澄清过滤后，即为原液。
(7)原液内加入终浓度为10g/l的甘露醇制成半成品，检定合格的半成品冰浴下分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。
制备实施例2
本实施例的步骤与制备实施例1相类似，区别在于：
步骤(3)中使用的维持液为pH7.4、含2％小牛血清的MEM培养基，毒种与细胞接种比例为1∶90。
步骤(4)中使用相当于原维持液2倍体积的PBS缓冲液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
步骤(5)中使用的疫苗液为：含有20g/l人血清白蛋白、50g/l蔗糖、10g/l海藻糖、20g/l右旋糖酐70、10g/l谷氨酸钠、9g/l尿素和0.5g/l精氨酸的199综合培养基。
步骤(7)中在原液内加入的甘露醇终浓度为15g/l。
制备实施例3
本实施例的步骤与制备实施例1相类似，区别在于：
步骤(3)中使用的维持液为pH7.6、含3％小牛血清的MEM培养基，毒种与细胞接种比例为1∶120。
步骤(4)中使用相当于原维持液3倍体积的Earle’s液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
步骤(5)中使用的疫苗液为：含有3g/l人血清白蛋白、60g/l蔗糖、15g/l海藻糖、40g/l右旋糖酐70、12g/l谷氨酸钠、6g/l尿素和2g/l精氨酸的PBS缓冲液。
步骤(7)中在原液内加入的甘露醇终浓度为15g/l。
制备实施例4
本实施例的步骤与制备实施例1相类似，区别在于：
步骤(3)中使用的维持液为pH7.6、含5％小牛血清的MEM培养基，毒种与细胞接种比例为1∶200。
步骤(4)中使用相当于原维持液3倍体积的Earle’s液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
步骤(5)中使用的疫苗液为：含有15g/l人血清白蛋白、60g/l蔗糖、30g/l海藻糖、10g/l右旋糖酐70、8g/l谷氨酸钠、6g/l尿素和1.5g/l精氨酸的PBS缓冲液。
步骤(7)中在原液内加入的甘露醇终浓度为20g/l。
比较实施例
本实施例将本发明的疫苗冻干保护剂与现有技术中含明胶的疫苗冻干保护剂进行比较。
按照本申请人已经公开的中国专利申请200610017132.0中所述的方法，使用含有明胶的冻干保护剂制备冻干水痘疫苗，分别称为制备实施例1’、2’、3’和4’，具体制备步骤如下：
制备实施例1’
(1)取人二倍体细胞MRC-5按1∶2比例，以pH7.2、添加10％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基。
(2)37℃下，培养3天扩增传代33代以内。
(3)待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，更换pH7.2、含2％小牛血清的MEM培养基维持液，在培养瓶内按毒种与细胞接种比例1∶60加入水痘病毒0ka株感染细胞。
(4)当MRC-5细胞中75％以上出现典型病变时，倒去原维持液，用相当于原维持液二倍体积以上的Earle’s液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
(5)加入含有3g/l人血清白蛋白、100g/l蔗糖的199综合培养基收获细胞培养物。
(6)将细胞培养物经-70℃以下冻融、20KHz超声破碎细胞、经澄清过滤后，即为原液。
(7)在原液内加入终浓度为5g/l的明胶、12g/l的谷氨酸钠、9g/l的尿素和0.5g/l的精氨酸，制成半成品，检定合格的半成品冰浴下分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。
制备实施例2’
本实施例的步骤与制备实施例1’相类似，区别在于：
步骤(1)中取人二倍体细胞MRC-5按1∶4比例，以pH7.6、添加12％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基。
步骤(2)中培养时间为5天。
步骤(3)中使用的维持液为pH7.4、含5％小牛血清的MEM培养基，毒种与细胞接种比例为1∶100。
步骤(4)中使用相当于原维持液2倍体积的PBS缓冲液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
步骤(5)中加入含有20g/l人血清白蛋白、30g/l蔗糖的PBS缓冲液收获细胞培养物。
步骤(7)中在原液内加入终浓度为12g/l的明胶、9g/l的谷氨酸钠、6g/l的尿素和1g/l的精氨酸，制成半成品，检定合格的半成品冰浴下分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。
制备实施例3’
本实施例的步骤与制备实施例1’相类似，区别在于：
步骤(1)中取人二倍体细胞MRC-5按1∶3比例，以pH7.4、添加15％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基。
步骤(2)中培养时间为4天。
步骤(3)中使用的维持液为pH7.6、含3.5％小牛血清的MEM培养基，毒种与细胞接种比例为1∶120。
步骤(4)中使用相当于原维持液3倍体积的Earle’s液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
步骤(5)中加入含有10g/l人血清白蛋白、80g/l蔗糖的199综合培养基收获细胞培养物。
步骤(7)中在原液内加入终浓度为8g/l的明胶、6g/l的谷氨酸钠、3g/l的尿素和2g/l的精氨酸，制成半成品，检定合格的半成品冰浴下分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。
制备实施例4’
本实施例的步骤与制备实施例1’相类似，区别在于：
步骤(1)中取人二倍体细胞MRC-5按1∶4比例，以pH7.6、添加15％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基。
步骤(2)中培养时间为5天。
步骤(3)中使用的维持液为pH7.6、含3.5％小牛血清的MEM培养基，毒种与细胞接种比例为1∶200。
步骤(4)中使用相当于原维持液3倍体积的Earle’s液洗涤细胞表面，洗去牛血清。
步骤(5)中加入含有15g/l人血清白蛋白、50g/l蔗糖的199综合培养基收获细胞培养物。
步骤(7)中在原液内加入终浓度为10g/l的明胶、9g/l的谷氨酸钠、3g/l的尿素和1.5g/l的精氨酸，制成半成品，检定合格的半成品冰浴下分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。
对上述四个制备实施例1-4以及1’-4’制得的冻干疫苗分别于37℃、2-8℃放置不同时间，然后分别检测样品外观、水分和病毒滴度。
合格样品的外观应为白色疏松体，按标示量加入灭菌注射用水，复溶后应为澄明液体，无异物。
样品中的水分按2005年版《中华人民共和国药典》(三部)附录VII D检查，应不高于3.0％。
病毒滴度通过蚀斑法测定，具体步骤如下：
取人二倍体细胞MRC-5，以pH7.4、添加15％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基接种六孔板，置37℃±0.5℃、5％CO2培养箱培养3天，待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，接种用添加10％小牛血清、5％蔗糖和1％谷氨酸钠的PBS缓冲液稀释的病毒液0.1ml/孔，置36.5℃±0.5℃、5％CO2吸附60分钟，期间每20分钟轻轻摇动一次。吸附完毕，补加pH7.6、含5％小牛血清的MEM培养基维持液，3ml/孔，置36.5℃±0.5℃、5％CO2培养7天，培养到期后，吸出培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞表面1次，加染色液1ml/孔，置室温5分钟，吸出染色液，流水冲洗晾干后计数蚀斑形成单位。
试验结果见以下各表：
表1本发明的冻干水痘减毒活疫苗在37℃下放置的稳定性结果：
Figure G2009101384116D00081
Figure G2009101384116D00091
表2本发明的冻干水痘减毒活疫苗在2-8℃下放置的稳定性结果：
Figure G2009101384116D00092
表3现有技术中含有明胶的冻干水痘减毒活疫苗在37℃下放置的稳定性结果：
Figure G2009101384116D00093
Figure G2009101384116D00101
表4现有技术中含有明胶的冻干水痘减毒活疫苗在2-8℃下放置的稳定性结果：
Figure G2009101384116D00102
由以上数据可以看出，本发明的不含明胶的疫苗冻干保护剂与目前常规使用的含有明胶的保护剂相比，保持疫苗稳定性的能力基本相同。但是由于在本发明的保护剂中不使用明胶，所以大大提高了对人体的安全性。

Claims (10)

1.一种用作水痘疫苗冻干保护剂的组合物，所述组合物所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：人血清白蛋白3-20g/l、蔗糖30-100g/l、海藻糖10-30g/l、右旋糖酐10-50g/l、谷氨酸钠6-12g/l、尿素3-9g/l、精氨酸0.5-2g/l以及甘露醇10-100g/l，并且所述组合物中不含有明胶。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述右旋糖酐为右旋糖酐70。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述蔗糖在冻干原液中的初始浓度为40-60g/l。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述海藻糖在冻干原液中的初始浓度为15-30g/l。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述甘露醇在冻干原液中的初始浓度为10-20g/l。
6.一种冻干水痘疫苗的制备方法，其特征在于在冻干过程中采用权利要求1所述的组合物。
7.一种冻干水痘疫苗的制备方法，其特征在于在冻干过程中采用权利要求2-5任一项所述的组合物。
8.权利要求6所述的制备方法，包括下列步骤：
(1)以水痘病毒Oka株为毒种，MRC-5株人二倍体细胞为培养基质；
(2)用培养基对MRC-5株人二倍体细胞进行扩增传代，其中细胞传代比例为1∶2-1∶4，以37℃培养3-5天；
(3)待MRC-5株人二倍体细胞生长成均匀、致密的单层细胞后，更换培养基维持液并加入毒种感染细胞；
(4)当MRC-5株人二倍体细胞出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用相当于维持液2倍-3倍体积的洗涤液洗涤细胞表面；
(5)加入疫苗液收获细胞培养物，所述疫苗液为含有3-20g/l人血清白蛋白、30-100g/l蔗糖、10-30g/l海藻糖、10-50g/l右旋糖酐、6-12g/l谷氨酸钠、3-9g/l尿素和0.5-2g/l精氨酸的199综合培养基或PBS缓冲液；
(6)将细胞培养物经-70℃以下冻融、超声破碎细胞、经澄清过滤后，即为冻干原液；
(7)在所述冻干原液内加入10-100g/l的甘露醇，进行冻干。
9.权利要求8所述的方法，其中在步骤(3)中维持液为pH7.2-7.6、含2％-5％小牛血清的MEM培养基；和/或其中在步骤(3)中毒种与细胞接种比例为1∶60-1∶250；和/或其中在步骤(4)中洗涤液为Earle’s液或PBS缓冲液。
10.权利要求1至5任一项的组合物用于提高冻干疫苗的稳定性和安全性的用途。
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