CN102512686B - 一种疫苗保护剂、狂犬病疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗保护剂，它包含以下百分含量的成分：二糖50-80份、人血白蛋白20-30份、明胶10份、氨基酸1.5-1.65份。本发明还提供了一种狂犬病疫苗及其制备方法。本发明疫苗保护剂可有效增强狂犬病疫苗冻干剂的热稳定性，具有较强的应用价值。

Description

一种疫苗保护剂、狂犬病疫苗及其制备方法

背景技术

本发明涉及一种疫苗保护剂，特别涉及一种狂犬病疫苗保护剂。

背景技术

狂犬病又称恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率高达100％。全球有87个国家和地区有狂犬病发生，但主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家，其中98％在亚洲，中国的发病人数仅次于印度，居世界第二位。自1997年起，我国狂犬病疫情已保持了10余年的上升趋势，发病人数和病死人数都不断增加，2006年-2008年全国共报告狂犬病9045例，占同期各种传染病病死总数的24.9％，位居第三位。其中2007年报告狂犬病例的县(区)数占全国总数的34.4％，较2006年上升了17.3％。我国防控狂犬病的形式依然严峻。狂犬病症状严重、死亡率达100％。

一旦发病目前尚无法医治，其控制主要依赖于疫苗接种。抗狂犬病免疫接种是早期免疫预防医学史中成功的范例之一。1885年首先由巴斯德利用感染了狂犬病毒的狗脑组织通过脑内注射感染兔子，再将兔子的脊髓干燥后免疫狗，并通过反复在猴体内传代后狂犬病毒的毒力减弱了。这就是最原始的狂犬病疫苗的免疫。1908年Dr.Fermi利用1％酚将兔脑组织中的病毒部分灭活。1911年Dr.Semple将脑组织悬液于37℃用酚固定、灭活，制备了无毒性的Semple苗。1925年Dr.Hempt通过补加乙醚处理，进一步保证了疫苗的无毒性。我国自1949年起，一直使用由羊脑制备的Semple疫苗，直到1980年停止使用，由原代地鼠肾细胞疫苗取代。为了减少对脑脊髓组织的过敏反应，1959年Dr.Peck采用鸭胚组织和β-丙内酯(β-propiolatone)灭活病毒方法制备了鸭胚组织狂犬苗(DEV，Duck Embryo Vaccine)，结果副反应降低了许多即从神经组织苗(NTV，Nerve Tissue Vaccine)引起的副反应为1.5％降至1/25000。但是DEV的效力和保护性不好。另外，由于鸭胚蛋白引起过敏反应也时有报道。1960年以后以培养细胞为基质的疫苗有了很大发展，也是目前正在使用和广泛使用的。60年代，Dr.Kissling和Fenje首先尝试用组织细胞培养狂犬病毒。二学者将狂犬病毒在原代地鼠肾细胞和鸭胚细胞培养后，经福尔马林灭活，制备疫苗。1964年，Dr.Wiktor等将巴斯德于1882年从兔脑中分离出的Pitman-Moore(PM)固定株适应至人胚肺二倍体细胞2BS(Wistar-38)，即利用感染了狂犬病毒的细胞与新鲜的细胞混合培养，通过传代47代后，病毒完全适应到了2BS细胞，且也可以让病毒能在无细胞状态下传代。由此制备的疫苗接种后可产生可靠的免疫应答，产生高滴度的中和抗体。在1980年代，法国Merieux研究所率先研究使用传代细胞——Vero细胞生产狂犬病疫苗，其后WHO制定看生产疫苗用的传代细胞规程，并于1987年制定传代细胞生产狂犬病疫苗的规程。我国从1980年年代末开始进行人用精制Vero细胞培养狂犬病疫苗研制，于1990年代末得到批准生产。目前用于生产人用的传代细胞多为Vero细胞，它是非洲绿猴肾细胞的细胞系，经多次鉴定是公认安全的。

现在市场上人用狂犬病疫苗的质量良莠不齐，关键指标就是效价不稳定，这与制备狂犬病使用的剂型以及保护剂不理想有很大的关系。目前也有文献报道对狂犬病疫苗保护剂的研究，如：沈铭强，等，狂犬病疫苗耐热保护剂的研究，《中国兽药杂志》，1990年4期，报道了采用脱脂牛奶、明胶、蔗糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠、磷酸盐缓冲液等作为保护剂材料。由于灭活的病毒蛋白不能在常温下长时间稳定存在，即使在2-8℃的低温条件下也只有6-12个月的贮存有效期。采用冻干剂型的狂犬病疫苗稳定效价理论上可以保存18个月以上，但如果如果冻干保护剂不理想就不能有效的保持效价的稳定，疫苗质量也大大打折。由于狂犬病疫苗的不稳定性，必需在低温冷藏条件下通过冷链运输、贮存和使用，从而使狂犬病疫苗的大规模推广使用，特别是经济不发达地区及热带和亚热带地区的推广使用受到广大的限制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种新的疫苗保护剂。本发明的另一目的是提供了一种狂犬病疫苗。

本发明提供了一种疫苗保护剂，它包含以下重量配比的成分：

二糖50-80份、人血白蛋白20-30份、明胶10份、氨基酸1.5％-1.65份。

其中，所述的二糖为蔗糖、乳糖、海藻糖或麦芽糖；所述的氨基酸为脯氯酸、精氨酸、甘氨酸或赖氨酸。

进一步优选地，所述的二糖为乳糖、麦芽糖；所述的氯基酸为脯氯酸和精氨酸，其成分的重量配比为：

麦芽糖40份、乳糖40份、人血白蛋白25份、明胶10份、脯氨酸0.3份、精氨酸1.35份。

本发明疫苗保护剂还含有Vc和尿素，重量配比为：

海藻糖50份、人血白蛋白20份、明胶10份、脯氨酸0.25份、精氨酸1.25份、Vc2.5份、尿素5份。

本发明还提供了一种狂犬病疫苗，它是由狂犬病疫苗原液、疫苗保护剂制备而成。

其中，所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA法检测抗原含量≥3IU/mL。所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA法检测抗原含量≥4IU/mL。

所述的狂犬病疫选用的毒株为Pitman-Moore株。

本发明还提供了一种制备狂犬病疫苗的方法，它包括如下步骤：

a、制备的狂犬病病毒原液，采用ELISA法检测抗原含量≥3IU/mL；

b、制备明胶溶液：将明胶在热水浴助溶条件下溶于灭菌的PBS缓冲液中，搅拌，待完全溶解、清亮后定容使明胶浓度为5％～15％，灭菌，得明胶溶液；

c、制备糖氨基酸溶液：将二糖在热水浴助溶条件下溶于灭菌的PBS缓冲液中，搅拌，待完全溶解、清亮，加入氨基酸，定容，使溶液中糖浓度为30～50％，氨基酸浓度为0.5％～2％，得糖氨基酸溶液；

d、将a步骤制备的狂犬病病毒原液加入蛋白含量为20％的人血白蛋白，加入体积比为：纯化疫苗原液∶20％人血白蛋白＝10∶1至5∶1，即得疫苗蛋白混合液；再混合入b步骤制备的明胶溶液和c步骤制备的糖氨基酸液，混合体积比为：疫苗蛋白混合液∶明胶溶液∶糖氨基酸溶液＝5～10∶1～4∶1～2；混匀后得到狂犬病疫苗组合物溶液；

e、将步骤d得到的狂犬病疫苗组合物溶液分装、冷冻干燥，即得狂犬病疫苗。

其中，e步骤所述的冷冻干燥步骤为：

(1)预冻阶段：疫苗降温至-40℃以下，保温2-3小时后转入抽真空阶段；

(2)抽真空阶段：冷凝器温度降至-45℃以下时，启动真空泵抽真空，冻干箱压力控制在13Pa以内：

(3)第一阶段干燥：隔板温度控制在-50℃至-10℃，疫苗温度控制在-50℃至-25℃，干燥13-16小时；第一阶段干燥完毕后，待温度上升至20-30℃，升温时间约7-8小时，进入第二阶段干燥；

(4)第二阶段干燥：疫苗在20-30℃下保温10-13小时，即冻干完毕。

本发明提供的保护剂明显提高了狂犬病疫苗的稳定性，可大幅度延长疫苗的保质期，临床应用前景良好。

下面通过具体实施方式对本发明作进一步描述，但并非对本发明的限制。

附图说明

图1试制冻干狂犬病疫苗注射部位和注射周围组织病理切片(其中，图1A注射部位周围图；图1B注射部位图)

具体实施方式

实施例1本发明保护剂的制备

1、制备方法

称量、溶解和高压灭菌洁净度十万级车间内操作，过滤除菌在洁净度万级车间内百级层流下操作，包括如下步骤：

(1)配制1000ml浓度为11％明胶：称取明胶110g，在100℃热水浴助溶下溶于灭菌750ml 0.01M PBS(pH 7.6)溶液，实时搅拌，待完全清亮后，定容于1000ml，0.11MPa 30分钟灭菌，再用灭菌0.01M PBS(pH 7.6)溶液补足液体定容至1000ml，得11％明胶溶液，2-8℃保存，一周内使用。所用明胶为Fluka公司产品；

(2)配制1000ml保护剂糖液：称取药用级麦芽糖179.9g、乳糖179.9g在100℃热水浴助溶下溶于灭菌750ml 0.01M PBS(pH 7.6)溶液，实时搅拌，待完全清亮后，100℃ 30分钟。称取脯氨酸1.3g、盐酸精氨酸6.4g，溶于已冷却的保护剂糖液后用灭菌0.01M PBS(pH 7.6)溶液定容于1000ml，采用0.22μm滤芯过滤除菌得保护剂糖液。2-8℃保存，一周内使用；

(3)人血白蛋白：由成都蓉生药业股份有限公司生产的20％人血白蛋白。

实施例2本发明狂犬病疫苗的制备

1、疫苗制备

(1)、制备保护剂

依照表1所示配方，按照如下步骤制备保护剂：

a、配制1000ml浓度为11％明胶：称取明胶110g，在100℃热水浴助溶下溶于灭菌750ml 0.01M PBS(pH 7.6)溶液，实时搅拌，待完全清亮后，定容于1000ml，0.11MPa 30分钟灭菌，再用灭菌0.01M PBS(pH 7.6)溶液补足液体定容至1000ml，得11％明胶溶液，2-8℃保存，一周内使用。所用明胶为Fluka公司产品；

b、配制1000ml保护剂糖液：称取药用级多糖在100℃热水浴助溶下溶于灭菌750ml 0.01M PBS(pH 7.6)溶液，实时搅拌，待完全清亮后，100℃30分钟。称取脯氨酸1.3g、盐酸精氨酸6.4g，溶于已冷却的保护剂糖液后用灭菌0.01M PBS(pH 7.6)溶液定容于1000ml，采用0.22μm滤芯过滤除菌得保护剂糖液。2-8℃保存，一周内使用；

c、人血白蛋白：由成都蓉生药业股份有限公司生产的20％人血白蛋白。

(2)制备疫苗

本发明提供的狂犬病疫苗所选用的毒株为Pitman-Moore株(PM株)。PM株是来自美国Wistar研究所的狂犬病毒固定株，Wistar研究所从NIH获得PV-11株，经两代兔脑传代，在WI-38细胞传47～52代作为主种子毒，称为PM株，是现在所使用狂犬病疫苗中免疫保护效果最好的一种，也是世界卫生组织WHO在《人用狂犬病疫苗推荐毒种》推荐使用的毒株。取狂犬病疫苗(PM株)病毒原液，经过本领域常规的澄清、浓缩、灭活、层析纯化等技术处理后，获得病毒原液；

(3)制剂

在洁净度为百级的房间内的百级层流下操作。在于纯化疫苗原液加入蛋白含量为20％的人血白蛋白，加入比例为：纯化疫苗原液∶20％人血白蛋白＝10∶1至5∶1，即得疫苗蛋白混合液；再混合入糖液和明胶液，混合比例为：疫苗蛋白混合液∶明胶溶液∶糖氨基酸溶液＝5～10∶1～4∶1～2，即得狂犬病疫苗组合物溶液，再进行分装冷冻干燥。冷冻干燥方法：

1.1预冻

1.1.1温度：疫苗降温至-40℃以下，

1.1.2时间：达到上述温度后，保温2-3小时后转入抽真空阶段；

1.2抽真空阶段

冷凝器温度降至-45℃以下时，启动真空泵抽真空，冻干箱压力控制在13Pa以内：

1.3第一阶段干燥

1.3.1温度：隔板温度控制在-50℃至-10℃，疫苗温度控制在-50℃至-25℃，

1.3.2时间：13-16小时；

1.3.3第一阶段干燥完毕后，待温度上升至20-30℃，升温时间约7-8小时，进入第二阶段干燥；

1.4第二阶段干燥

疫苗在20-30℃下保温10-13小时，即冻干完毕。方可停机，压胶塞后出柜，至此，即制备冻干狂犬病疫苗。

(4)分装

在洁净度为百级的房间内的百级层流下操作。将狂犬病疫苗组合物分装，分装规格1.0ml/西林瓶，再冷冻干燥。

2、检测

对制备的疫苗成品按照《中华人民共和国药典》2005年版本中记载的指标进行检测。

3、检测结果

实验结果如表1所示：

表1冻干前狂犬病疫苗组合物溶液中不同配比的保护剂的保护作用比较

如表1所示，保护剂配方1和配方3制备的疫苗制剂的热稳定性大于2.5IU/剂，符合药典的规定，其他指标也符合药典规定，可用于制备狂犬病疫苗冻干剂。其中，配方1可以明显提高狂犬病疫苗的稳定性，用于制备狂犬病疫苗冻干剂具有明显优势，为本发明保护剂最佳选择。

实施例3本发明保护剂制备的疫苗的质量检测

取实施例2配方1制备的疫苗，进行如下检测：

1、疫苗安全性试验，疫苗脑内注射试验观察安全性

将筛选出保护剂试制的狂犬病疫苗，分别进行了疫苗安全性试验，疫苗脑内注射试验、过敏性试验、疫苗注射部位刺激性试验，结果表明疫苗安全性试验和脑内注射昆明小鼠后，小鼠未出现异常表现，观察14天，试验小鼠全部健存。

2、疫苗异常毒性试验

试制冻干狂犬病疫苗腹腔注射小鼠(18～22g)和豚鼠(250～350g)，结果显示小鼠观察7天后健存，并且体重增加。

3、疫苗过敏性试验

试制冻干狂犬病疫苗以豚鼠静脉注射3次，未发现豚鼠出现过敏现象。

4、疫苗注射部位刺激性试验

按照试制冻干狂犬病疫苗临床拟用注射途径时注射频率和使用剂量，以家兔为动物模型，腿部注射5次，观察21天，结果如图1所示，家兔腿部肌肉注射部位，未发现肿胀、溃疡等症状。

本发明人利用本发明实施例2配方1制备了5批疫苗，经各项检定，各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部2005年版本对狂犬病疫苗的要求，如表2所示：

表2本发明狂犬病疫苗检测结果

由表2所示，配方1制备的疫苗的各种检测结果均符合药典的规定。

同时，本发明人还对其进行了长期稳定性观察，结果如表3所示，根据ICH，WHO要求，放置不同时间后，以NIH法，测定狂犬疫苗效价：

表3本发明不同温度下狂犬病疫苗长期稳定性

如表3所示，配方1制备的疫苗的各种检测结果仍符合《中国药典》三部2005年版本对狂犬病疫苗效价的要求。

同时将狂犬病疫苗置2-8℃保存，采用留样观察法，每3个月取样一次，检测疫苗的水分和pH进行监控，结果如表4所示：

表4本发明2-8℃保存36个月水分和pH检测结果

如表4所示，该狂犬病疫苗在2-8℃保存24个月时，水分和pH均符合2005年版《中国人民共和国药典》三部中狂犬病疫苗质量标准。

综上，本发明提供的保护剂可显著提高狂犬病疫苗的稳定性，具有良好的市场应用前景。

Claims (2)

1.一种疫苗保护剂，其特征在于：它由以下重量配比的成分组成：

麦芽糖40份、乳糖40份、人血白蛋白25份、明胶10份、脯氨酸0.3份、精氨酸1.35份。

2.一种狂犬病疫苗，它是由狂犬病疫苗原液、权利要求1所述的疫苗保护剂制备而成。

3、根据权利要求2所述的狂犬病疫苗，其特征在于：所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA法检测抗原含量≥3IU/mL。

4、根据权利要求3所述的狂犬病疫苗，其特征在于：所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA法检测抗原含量≥4IU/mL。

5、根据权利要求2-4任意一项所述的狂犬病疫苗，其特征在于：所述的狂犬疫苗选用的毒株为Pitman-Moore株。

6、一种制备权利要求2-5任意一项所述的狂犬病疫苗的方法，它包括如下步骤：

a、制备的狂犬病病毒原液，采用ELISA法检测抗原含量≥3IU/mL；

b、制备明胶溶液：将明胶在热水浴助溶条件下溶于灭菌的PBS缓冲液中，搅拌，待完全溶解、清亮后定容使明胶浓度为5%w/w～15% w/w，灭菌，得明胶溶液；

c、制备糖氨基酸溶液：将二糖在热水浴助溶条件下溶于灭菌的PBS缓冲液中，搅拌，待完全溶解、清亮，加入氨基酸，定容，使溶液中糖浓度为30～50% w/w，氨基酸浓度为0.5% w/w～2% w/w，得糖氨基酸溶液；

d、将a步骤制备的狂犬病病毒原液加入蛋白含量为20%的人血白蛋白，加入体积比为：纯化疫苗原液：20%人血白蛋白=10:1至5:1，即得疫苗蛋白混合液；再混合入b步骤制备的明胶溶液和c步骤制备的糖氨基酸液，混合体积比为：疫苗蛋白混合液：明胶溶液：糖氨基酸溶液=5~10:1~4:1~2；混匀后得到狂犬病疫苗组合物溶液；

e、将步骤d得到的狂犬病疫苗组合物溶液分装、冷冻干燥，即得狂犬病疫苗。

7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：e步骤所述的冷冻干燥步骤为：

（1）预冻阶段：疫苗降温至-40℃以下，保温2-3小时后转入抽真空阶段；

（2）抽真空阶段：冷凝器温度降至-45℃以下时，启动真空泵抽真空，冻干箱压力控制在13Pa以内：

（3）第一阶段干燥：隔板温度控制在-50℃至-10℃，疫苗温度控制在-50℃至-25℃，干燥13-16小时；第一阶段干燥完毕后，待温度上升至20-30℃，升温时间约7-8小时，进入第二阶段干燥；

（4）第二阶段干燥：疫苗在20-30℃下保温10-13小时，冻干完毕。

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