CN104830807A - 一株可用于制造疫苗的高效价狂犬疫苗毒株ctn-1v-t - Google Patents

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李建强
葛君
周童
任苏林
黄红颖
孙莹
徐晓威
陈晓晓
孙洪林
顾月
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Abstract

本发明提供一株具有高效价的狂犬病毒CTN-1V-T vero等细胞适应株；本发明还提供所述狂犬病毒CTN-1V-T在制备vero等细胞纯化灭活狂犬疫苗中的用途。CTN-1V-T是在CTN-1V株基础上经过一系列克隆分离方法而得到的，相对CTN-1V株，CTN-1V-T株在vero等细胞上病变速度更快、滴度略高、效力更高、免疫原性更好，氨基酸序列显示其没有改变CTN-1V株的分子特征，可用于狂犬灭活疫苗的制备。本发明还提供了CTN-1V-T株的全基因组序列。本发明还提供了基于CTN-1V-T株的灭活疫苗的制备过程，结果显示基于CTN-1V-T毒株经过简单工艺就可制备出符合当前药典质量标准的狂犬灭活疫苗。

Description

一株可用于制造疫苗的高效价狂犬疫苗毒株CTN-1V-T
技术领域
本发明的目的是提供一株安全有效的狂犬疫苗毒株，此毒株来源于中国疫苗株CTN-1V株，本发明通过一系列病毒克隆方法在不改变病毒特征的基础上提高病毒滴度、效力及免疫原性。本发明中所指的细胞为vero细胞等能够培养狂犬病毒的实验室及生产中涉及的细胞，本发明中所指的病毒为狂犬病毒CTN-1V及克隆分离的CTN-1V-T株。
背景技术
狂犬病病毒(RV)是引起主要中枢神经系统为特征的狂犬病的病原。据报道，全世界每年死于狂犬病的人数高达55,000，其中绝大多数发生在发展中国家，中国为主要的狂犬病受害国。狂犬病病死率为100％，其防治主要依靠疫苗免疫。当前，WHO推荐的人用狂犬病疫苗有4种,即人二倍体细胞疫苗(HDCV),Vero细胞疫苗(PVRV)、鸡胚细胞纯化疫苗(PCECV)和鸭胚纯化疫苗(PDEV)，我国目前主要生产和使用地鼠肾原代细胞纯化疫苗和Vero细胞纯化疫苗。
目前使用的中国疫苗株有三株，适应地鼠肾原代细胞的4aG、适应vero细胞的CTN-1株及兽用疫苗Flury株，而国内疫苗批签发最多的则是巴斯德PV株。我国狂犬疫苗生产主要利用地鼠肾原代细胞和vero细胞做为基质，地鼠肾原代细胞制备受本身条件限制疫苗生产效率很低不能满足需求，vero细胞纯化狂犬疫苗生产规模容易放大，是目前狂犬疫苗生产的主流，但自药典提高宿主残余宿主DNA标准后国内多家企业疫都不达标，这不但影响企业效益，也严重影响了国家对狂犬病的防控。当前只有辽宁成大等少数企业能够生产出合格的vero细胞纯化疫苗，其他企业还在工艺改进和毒株研发当中。
通常病毒在细胞培养过程中其滴度和效力容易降低，因病毒在细胞上培养时因其培养条件的变化会引起病毒颗粒不能完整的装配，尤其是连续在细胞上传代培养更容易形成缺陷病毒。作为疫苗株的病毒滴度效力下降会导致疫苗生产过程中浓缩倍数的进一步提高，从而致使疫 苗制作过程中宿主残余物质的大量的产生，导致生产出高质量的病毒疫苗变的更加困难。
发明内容：
本发明目的之一是挑选出高滴度高效价的CTN-1V病毒克隆株；本发明的目的之二是对优选克隆株进行相关检定和测序。本发明目的之三是提供狂犬病毒CTN-1V-T株在简单工艺下制备出符合药典质量标准的灭活狂犬疫苗。
本发明针对背景技术中的，利用病毒空斑等克隆方法通过多次分离筛选，筛选出高效价的疫苗毒株，本克隆疫苗株细胞培养收获液效力高于普通CTN-1V株效力2倍以上，通过简单的纯化工艺即可达到药典对狂犬疫苗质量标准的要求，全序列测定显示其与CTN-1V株有98％的同源性，G蛋白同源性为99％，N蛋白氨基酸序列同源性为100％。
本发明有以下特点：
1、本发明提供了一株高效的狂犬疫苗毒株CTN-1V-T株，该毒株在vero等细胞上病变时间缩短、病毒滴度略高、特别的病毒制作成疫苗效力和免疫原性很高。
2、本发明提供的CTN-1V-T株在简单工艺下即可制备出符合药典质量标准的狂犬灭活疫苗。
3、本发明提供的CTN-1V-T株在全基因序列上与CTN-1V株有很高的同源性，没有改变CTN-1V毒株基因特征。
本发明利用琼脂糖空斑克隆法和稀释克隆法进行了多次筛选，筛选的病毒克隆株CTN-1V-T的纯度更高克隆更单一。
附图说明：
图1是CTN-1V在vero细胞上形成空斑的示意图。
图2是空斑克隆株在vero细胞上的病变程度的示意图。
具体实施方式：
以下是本发明的一个实施例，这一实施例所用的病毒为中检院保存的中国狂犬病毒疫苗 CTN-1V株，冻存于-70℃，本实施例中所用的细胞为实验室保存的vero细胞。本实施例用于说明本发明，但本发明并不局限于本实施例。
病毒滴度检测：本发明病毒滴度采用小鼠滴定法，具体参见《中国药典第三部》2010版第111-113页。
效力检测：本发明效力测定采用M-ABT法，测定方法参见《国际检验医学杂志》2011年第9期第923-924页。
免疫原性测定：本发明免疫原性测定参见参加《中国药典第三部》2010版第111页。
实施例1.CTN-1V传代扩增。 
取冻存的狂犬病毒CTN-1V株按0.1MOI接种于25CM2细胞瓶，37℃吸附1小时后转入34.5℃、5％CO2的培养箱培养，8-10天后病变达到80％以上后收获，记为CTN-1V-F1。将CTN-1V-F1在vero细胞上连续传3代，记为CTN-1V-F4(F4)，并用NIH法和M-ABT法检测毒力效力(毒力7.0，效力2.0)，分装1.5ML离心管备用。
实施例2.CTN-1V-F4琼脂糖空斑克隆及鉴定。
将狂犬病毒F4收获液稀释至10-3-10-6，每个稀释度以4ml细胞和0.4ml稀释病毒混种于6孔板，每个稀释度接种2孔，同时以4ml细胞接种6孔板作为对照，对照设2孔，37℃培养24小时。
吸取上清，每孔加2.5ml 1％的营养琼脂糖，34.5℃培养3天。
补加每孔含有0.07M hepes的1％的营养琼脂糖1ml，34.5℃培养3天，显微镜下观察空斑形成，依据空斑形成的程度和大小分别挑接种至24孔板，同时加入1ml细胞混种34.5℃培养。
对不同克隆依据病变程度进行分类并选取病变程度最大的克隆(图1，标记为TP1F0)在细胞上连续传3代(记为TP1F3)观察病变情况(图2)和时间并进行毒力和效力检测(表1)，结果显示TPIF3克隆株感染vero细胞时间缩短，病毒滴度和收获液效力有较大的提高。
表1.首次克隆后病变时间、病毒滴度及效力比较测定
  80％病变时间 病毒滴度 收获液效力
CTN-1V-F4 10d 7.0 1.6
TP1F3 8d 7.2 3.0
对TP1F3二次克隆，二次克隆优选病变程度最大的克隆连续在vero细胞上传代3代观察病变速度和病变程度并进行毒力效力的检测。
实施例3.TP2F3稀释克隆法及鉴定。
取优选的TP2F3克隆培养液1ml，病毒液依次稀释至10-9，分别取200ul稀释病毒液和200ul细胞混种于96孔细胞培养板中，每个稀释度接种10孔，同时设对照10孔，37℃培养2小时后至34.5℃培养。
培养7-9天后，观察每个稀释度的病变情况，取最低稀释度病变的克隆分别接种24孔板培养。优选连续传代滴度效力最高而且稳定的TP2F3-3为优选毒株，并将其命名为CTN-1V-T。
取CTN-1V-T并以CTN-1V及ag株为对照检测其病毒滴度及收获液效价，免疫小鼠检测其中和抗体水平，测定保护指数(表2)，结果显示CTN-1V-T株在病毒滴度、效力、免疫原性及保护指数方面都显著高于其来源株CTN-1V。
表2.CTN-1V-T株病毒滴度、效力及免疫原性等测定比较
实施例4.按照《中国药典第三部》“人用狂犬病疫苗”中要求对疫苗株无菌和支原体的检测，结果显示CTN-1V株无细菌和支原体污染。
实施例5.使用CTN-1V-T株制备疫苗及鉴定。
取克隆毒株CTN-1V-T按0.1MOI接种于225CM细胞瓶，37℃吸附1小时后转入34.5℃、5％CO2的培养箱培养，8-10天后病变达到80％以上后收获。收获液浓缩后加入β-丙内酯灭活，经层析纯化获得病毒原液，病毒原液浓缩后分裝成实验疫苗。对疫苗关键指标进行检测，结果显示在制备疫苗每剂效力达到6IU时，蛋白含量为25Ug，残余宿主蛋白为0.8Ug，残余牛血清为8ng,残余DNA为50pg,所有质量都符合药典要求。
实施例6.克隆株测序及稳定性测定。
取克隆毒株CTN-1V-T连续在vero细胞上传10代，测定每代毒力和效力，并观察病变达到80％以上的时间。取一代和十代毒株测定全序列并分析核苷酸氨基酸变异情况。结果显示病毒在vero细胞上感染病变80％以上的时间基本保持在7天左右，病毒滴度在7.5±0.2，而效力保持在4.0±0.2，序列测定显示一代和十代全序列无核苷酸变化，与CTN-1V株相比，全序列核苷酸同源性在98％，G蛋白同源性为99％，N蛋白氨基酸序列同源性为100％。以上结果显示CTN-1V-T株没有改变CTN-1V株的分子特性，而是通过克隆分离手段提高了病毒的滴度、效力、免疫原性和保护指数，而且在细胞上传代可保持稳定性。
序列表

Claims (6)

1.一种适应细胞的高效价狂犬病毒CTN-1V-T疫苗株。
2.基于权利要求1所述的狂犬病毒CTN-1V-T株感染细胞纯化狂犬灭活疫苗制备的用途。
3.如权利1所述的疫苗株，所述适应细胞为哺乳动物细胞系或鸭胚、鸡胚细胞系。
4.如权利1所述的疫苗株，CTN-1V-T来源于中国疫苗株CTN-1V-T株。
5.如权利4所述的疫苗株，CTN-1V-T株病毒滴度大于7.2LgFFU/ml,效力大于3IU/ml,而且其G蛋白和N蛋白氨基酸序列和本发明所述序列差异在3％以内。
6.如权利2所述的用途，纯化狂犬疫苗的制备包含了利用CTN-1V-T株适应所有可进行实验和生产的细胞的所有工艺。
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