CN110467671B - 一种用spf鸡制备tw1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用SPF鸡制备TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的方法。使用特定基因型(TW1型)的IBV毒种。方法为，使用IBV CK/CH/XNGD/140株毒种及其油乳剂灭活疫苗，对50日龄的SPF雏鸡进行基础免疫和加强免疫，采血并分离血清；对血清进行无菌、外源病毒检测、中和效价测定和特异性检验，获得了特异性好、效价高的TW1型IBV阳性血清。本发明所述TW1型IBV阳性血清制备的方法，填补了TW1型IBV毒种无标准阳性血清的空白。选定了SPF雏鸡作为制备血清的试验动物，优化了血清制备过程中的免疫程序，提升了血清抗体中和效价。降低了生产成本，有利于阳性血清的批量制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian infection bronchitis)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infection bronchitis virus)引起的一种急性、高度接触性传染病，其主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等。鸡传染性支气管炎病毒(简称IBV)的基因组核酸在复制过程中易发生突变和重组，不同型毒株之间生物学特性、致病性和组织嗜性复杂多变，根据其免疫原性的差异可将IBV分为众多的血清型，不同血清型IBV之间交叉保护性及血清中和效力相对较差，从而给疾病诊断和防治工作带来极大困难。因此，针对特定基因型的IBV毒种研制检测技术，对于快速有效诊断IBV的发生和流行具有重要意义。
根据现行《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2015，以下称《中国兽药典》)三部的规定，IBV活疫苗成品或制作疫苗的毒种须用抗IBV特异性血清进行中和试验，以检验外源病毒。本发明针对TW1型IBV毒种，研制其阳性血清的制备方法，为IBV毒种的鉴别分型、疫苗的效力及纯净性检验提供保障。
发明内容
本发明的目的在于通过SPF鸡对TW1型鸡传染性支气管炎病毒刺激所产生免疫反应获得免疫抗体——阳性血清。
本发明技术方案：
1.一种用SPF鸡制备TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清，其特征在于该阳性血清是采用TW1型鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/XNGD/140株免疫SPF雏鸡制备的；该株病毒已于2019年06月19日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17997。
2.本发明所述一种用SPF鸡制备TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清，其特征在于该血清的的制备包括以下步骤：
(1)种毒鉴定 对IBV CK/CH/XNGD/140株种毒的纯净性及基因型进行检测鉴定；
(2)制备灭活疫苗 使用IBV CK/CH/XNGD/140株毒种接种SPF鸡胚，进行毒种扩繁；将扩繁好的鸡胚尿囊液进行浓缩、灭活和乳化，制备出免疫用的TW1型IBV灭活疫苗；
(3)血清制备
1)免疫 使用IBV CK/CH/XNGD/140株毒种滴鼻点眼免疫50日龄的SPF鸡。首免后14天，使用CK/CH/XNGD/140株毒种滴鼻点眼接种及其灭活疫苗颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫；二免后21天，使用CK/CH/XNGD/140株灭活疫苗加强免疫；三免后21天，使用灭活疫苗加强免疫。阳性血清制备过程共进行四次疫苗免疫；
2)采血 四免后14天，无菌采血；
3)分离血清 采用孵育、离心的方法分离血清，将分离的血清用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存；
4)血清检验 对分离的血清进行无菌、支原体、外源病毒、血清中和效价测定和特异性检验，确定血清的纯净性、中和效力及特异性。
本发明有益效果
本发明涉及一种用SPF鸡制备TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的方法。使用特定基因型(TW1型)的IBV毒种。方法为，使用IBV CK/CH/XNGD/140株毒种及其油乳剂灭活疫苗，对50日龄的SPF雏鸡进行基础免疫和加强免疫，采血并分离血清；对血清进行无菌、外源病毒检测、中和效价测定和特异性检验，获得了特异性好、效价高的TW1型IBV阳性血清。本发明所述TW1型IBV阳性血清制备的方法，填补了TW1型IBV毒种无标准阳性血清的空白。选定了SPF雏鸡作为制备血清的试验动物，优化了血清制备过程中的免疫程序，提升了血清抗体中和效价。降低了生产成本，有利于阳性血清的批量制备。
本发明通过鸡传染性支气管炎病毒抗原和毒种免疫SPF鸡制备阳性血清，该阳性血清是鸡传染性支气管炎准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行准确评价的基本保障，提高鸡传染性支气管炎病的防控水平。为鸡传染性支气管炎病的监测和相关兽用生物制品的质量评价提供有力的技术支撑，具有很好的应用前景。
(1)本发明选用了TW1型的IBV国内流行毒株CK/CH/XNGD/140株，作为阳性血清制备的免疫原。国内尚无针对TW1型IBV毒种阳性血清制备方法的研究，本研究旨在解决TW1型毒株无标准阳性血清的现状，当属首创。
(2)本发明针对制备阳性血清的试验动物进行了严格筛选，选择了50日龄的SPF健康雏鸡为试验动物，其制备的阳性血清纯净性好，并且具有较好的中和效力，满足了研究及检验用血清的要求。SPF雏鸡质量可控、来源稳定，同时能够满足批量进行阳性血清制备的需求。
附图说明
图1 IBV CK/CH/XNGD/140株S1基因与GenBank中收录的其他疫苗株核苷酸序列比较。
图2 IBV CK/CH/XNGD/140株S1基因与GenBank中收录的其他毒株的核苷酸序列分子进化树。
本发明涉及的生物材料资源信息
鸡传染性支气管炎病毒(Avian infection bronchitis virus)CK/CH/XNGD/140株：由中崇信诺生物科技泰州有限公司分离和保存。已于2019年06月19日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No：17997。
具体实施方式
1.TW1型的鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/XNGD/140株由中崇信诺生物科技泰州有限公司提供；按《中华人民共和国兽药典》二○一五版三部要求，对CK/CH/XNGD/140株毒种病毒含量及纯净性进行检测，确定毒种的效价及纯净性。
2.毒株定型
根据GenBank中收录的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的序列，设计了一对引物(序列1和序列2)。并采用RT-PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/XNGD/140株S1基因，对扩增产物进行了克隆、测序，获得了S1基因片段，其大小均为1600bp左右(序列3)。将其与常见疫苗株、部分参考毒株及近期国内TW1型分离株的S1基因序列进行序列比对和分析，结果确定其为TW1型的IBV毒种。
3.IBV CK/CH/XNGD/140株灭活疫苗制备
(1)抗原制备：将CK/CH/XNGD/140株毒种用PBS稀释100倍，尿囊腔内接种10日龄的SPF鸡胚，每胚0.1m1。照胚，剔除24小时之前的死胚，收获接种后36～42小时的活胚胚液，选择经检验无菌、病毒含量不低于106.0EID50/0.1m1、且对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，冷冻保存，备用。
(2)疫苗制备：1)水相制备，将4份灭菌的吐温-80加入到96份灭活的抗原液中，混合均匀。2)油相制备，将94份白油加热至80℃后，再加入6份司本-80，混合均匀，加热至121℃时维持30min。3)疫苗乳化，量取油相体积1/3的水相，加至油相中，混匀。8000r/min乳化6min。乳化完成后，将疫苗分装至疫苗瓶中，轧盖4℃保存，同时取样进行疫苗合格检验。
4.制备阳性血清用SPF鸡的筛查
为确保试验用SPF鸡无外源病毒感染，按表1中列出的检验方法，对IBV、IBDV、APV、ILTV、NDV、Reo V、REV、CIAV、EDSV、MDV、AEV、AIV(H5、H9亚型)进行抗体检测和ALV(A、B、J亚群)抗原检测。
表1制备血清用鸡的筛查项目
5.雏鸡免疫、血清制备及鉴定
使用IBV CK/CH/XNGD/140株病毒液通过滴鼻点眼途径接种免疫50日龄的SPF鸡(首免)；首免后14天，进行二免，即使用CK/CH/XNGD/140株病毒液通过滴鼻点眼途径接种，同时用灭活疫苗进行颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫；二免后每隔21天，进行第三次和第四次使用CK/CH/XNGD/140株灭活疫苗加强免疫。四免后14天，无菌采血，分离血清。将采集后的血液37℃孵育45min，然后3000r/min离心10min，分离血清，再用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的血清于-20℃保存。
对分装保存的血清进行无菌、支原体、外源病毒、血清中和效价测定和特异性检验，确定血清的纯净性、中和效力及特异性。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不构成对本发明的限制。
实施例1——免疫用毒种的病毒含量及纯净性检测
按照以下方法对毒种进行病毒含量测定，将AH1103鸡胚尿囊液用无菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-5、10–6、10–7、10–8 4个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育。24h以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～144h内死亡的鸡胚随时取出，至144h，取出所有活胚。接种后鸡胚在24～144h死亡鸡胚及存活鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病痕者判为感染，计算EID50。结果CK/CH/XNGD/140株病毒含量为106.32EID50/0.1ml。
按《中华人民共和国兽药典》二○一五版三部，对CK/CH/XNGD/140株毒种纯净性进行检测，确定毒种的纯净性。(检验检测结果见表2)
表2 IBV CK/CH/XNGD/140株检测结果
*注：判定中Y-符合规定，N-不符合规定。
实施例2——鸡传染性支气管炎病毒IBV CK/CH/XNGD/140株基因分型
根据GenBank中收录的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的序列，比对后针对保守区设计引物(序列1和序列2)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下所示：
序列1上游引物S1–F：5′–atgttgggga agtcactgtt–3′20
序列2下游引物S1–R：5′–acgtctaaaa cgacggctt–3′19。
将IBV CK/CH/XNGD/140株毒种接种10日龄SPF鸡胚，收集36～42h鸡胚尿囊液。采用RT-PCR扩增CK/CH/XNGD/140株S1基因，对扩增产物进行了克隆、测序，及基因序列比较分析。按照天根生化科技(北京)有限公司RNA提取试剂盒产品说明书从尿囊液中提取病毒RNA。反转录(RT)体系：DEPC水9.5μl，dNTP 4μl，5×M-MLV Buffer 4μl，M-MLV反转录酶(购自大连宝生物工程有限公司)(200U/μl)1μl，6nt随机引物1μl，RNase抑制剂0.5μl。反转录程序：25℃10min；42℃60min；70℃10min。RT-PCR扩增体系：去离子H2O 13.75μl，dNTP 2μl，5×Buffer 5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，
超保真DNA聚合酶(购自美国NewEngland Biolabs公司)0.25μl，cDNA 2μl。RT-PCR扩增程序：98℃30s；25cycles：98℃7s，60℃25s，72℃100s；72℃7min；4℃。电泳:1％琼脂糖凝胶电泳，120V，45min。获得了IBV CK/CH/XNGD/140株S1基因片段，其大小为1600bp左右。
使用PCR产物凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行PCR产物回收。将回收的PCR产物4μl与克隆载体pEasy-Blunt1μl(购自北京全式金生物技术有限公司)进行连接，25℃连接15min，再将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，在含有X-Gal、IPTG和Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养12～16h，挑取白斑菌落接种于LB培养基，37℃振荡培养12～16h后，取菌液进行PCR鉴定。选择菌液PCR鉴定为S1基因重组阳性的菌液送公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行序列测定。序列用Lasergene 7.0软件包中的SeqMan程序进行序列拼接，获得了IBV CK/CH/XNGD/140株S1基因核苷酸序列(见序列3)。用ClustalX 1.81软件将CK/CH/XNGD/140株S1基因序列(序列3)与常见疫苗株、部分基因型参考毒株及近期国内TW1型分离株序列(参考毒株名称及GenBank登录号，见表3)进行比对和分析，最后应用Mega 5软件构建遗传进化树。结果确定其为TW1型的IBV毒种(见图1、图2)。
序列3：(IBV TW1株S1基因)
表3 IBV毒株名称及GenBank登录号
实施例3——鸡传染性支气管炎病毒IBV CK/CH/XNGD/140株灭活疫苗制备
将CK/CH/XNGD/140株毒种接种10日龄SPF鸡胚，收集36～42h鸡胚尿囊液。将收获的鸡胚病毒液8000rpm离心10min，收获上清液。将离心后的病毒液透析浓缩至原体积的1/5，使用终浓度为0.15％的甲醛，37℃灭活20h。油相制备：将白油(94份)加热至80℃后，再加入司本-80(6份)，混合均匀，加热至121℃时维持30min，冷却备用。水相制备：将灭菌的吐温-80(4份)加入到灭活的抗原液中(96份)，混合均匀。乳化：量取油相体积1/3的水相，加至油相中，1500r/min混匀2min。调整转速至8000r/min，乳化6min。
乳化完成后，将乳化好的疫苗分装至疫苗瓶中，轧盖4℃保存，同时取样进行疫苗合格检验。(检验结果见表4)。
表4 IBV CK/CH/XNGD/140株灭活疫苗检测结果
*注：判定中Y-符合规定，N-不符合规定
实施例4——制备用SPF鸡筛查
抗原抗体检测按照(表5)中列出的检验方法，对IBV、IBDV、APV、ILTV、NDV、Reo V、REV、CIAV、EDSV、MDV、AEV、AIV(H5、H9亚型)进行抗体检测和ALV(A、B、J亚群)抗原检测，确保试验用SPF鸡无外源病毒感染。检查结果表明，SPF鸡无外源病毒感染，符合制备IBV阳性血清要求。
表5抗原抗体检测方法
| 病原名称 | 检测方法 | 判定 |
| 鸡传染性支气管病毒(M41) | HI抗体检测 | Y |
| 鸡新城疫病毒 | HI抗体检测 | Y |
| 禽流感病毒(H5、H9亚型) | HI抗体检测 | Y |
| 鸡产蛋下降综合症病毒 | HI抗体检测 | Y |
| 鸡传染性法氏囊病病毒 | ELISA抗体检测 | Y |
| 鸡传染性喉气管炎病毒 | ELISA抗体检测 | Y |
| 禽脑脊髓炎病毒 | ELISA抗体检测 | Y |
| 禽白血病病毒(A、B、J亚群) | ELISA抗原检测 | Y |
| 禽呼肠孤病毒 | ELISA抗体检测 | Y |
| 鸡传染性贫血病毒 | ELISA抗体检测 | Y |
| 禽网状内皮组织增生症病毒 | ELISA抗体检测 | Y |
| 鸡马立克氏病病毒 | AGP抗体检测 | Y |
| 鸡痘病毒 | AGP抗体检测 | Y |
*注：判定中Y-符合规定，N-不符合规定，1-无结果，NT-未检验
实施例5——TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的制备及检测鉴定
1.阳性血清的制备
(1)首免：使用CK/CH/XNGD/140株毒种，滴鼻点眼免疫50日龄SPF雏鸡，10只，5×105.0EID50/只。
(2)首免后14天进行二免，使用CK/CH/XNGD/140株毒种滴鼻点眼加强免疫，5×105.0EID50/只；同时使用CK/CH/XNGD/140株灭活疫苗，进行颈部皮下及胸部肌肉注射加强免疫各1.0ml。
(3)二免后14天进行第三次免疫，使用CK/CH/XNGD/140株灭活疫苗，进行颈部皮下及胸部肌肉注射加强免疫各1.0ml。
(4)三免后21天进行第四次免疫，方法同第三次免疫。
(5)四免后14天，无菌采集SPF鸡血，37℃孵育45min，然后3000r/min离心10min，分离血清，再用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的血清于-20℃保存。(免疫程序见表6)
表6 TW1型IBV阳性血清制备雏鸡免疫程序
2.阳性血清的纯净性检测
(1)无菌、支原体、外源病毒检验按《中华人民共和国兽药典》二○一五版三部进行。
(检测结果见表7)
表7 TW1型IBV阳性血清的纯净性检验结果
*注：判定中Y-符合规定，N-不符合规定
3.阳性血清的中和效力测定
将抗IBV特异性血清用灭菌生理盐水进行200、400、800、1600倍稀释，分别与等体积的IBV CK/CH/XNGD/140株病毒液(200EID50/0.1mL)混合，室温(18～25℃)作用1h；经尿囊腔接种SPF鸡胚(10日龄)，每个稀释度接种鸡胚5枚(0.2mL/胚)；对照鸡胚5枚，病毒液接种0.2mL/胚；置36～37℃孵育。24h以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～144h内死亡的鸡胚随时取出，至144h，取出所有活胚。接种后鸡胚在24～144h死亡鸡胚及存活鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病痕者判为感染，按Reed-Muench法计算中和效价。(检测结果见表8)
表8 TW1型IBV阳性血清的中和效价测定结果
4.阳性血清特异交叉中和试验
将NDV LaSota株、IBV AH1103株毒种做10倍系列稀释，分装于2列试管中。一组取适宜稀释度加入等量的抗IBV TW1型特异性血清；另一组加入等量的阴性血清，室温作用1h后，经尿囊腔(绒毛尿囊膜)接种SPF鸡胚(10日龄)，置37℃孵育，计算中和指数。(试验结果见表9)
表9特异性血清交叉中和试验结果
序列表
<110> 中崇信诺生物科技泰州有限公司
<120> 一种用SPF鸡制备TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(S1-F)
<400> 1
atgttgggga agtcactgtt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(S1-R)
<400> 2
acgtctaaaa cgacggctt 19
<210> 3
<211> 1620
<212> DNA
<213> IBV TW1株S1基因(IBV )
<400> 3
atgttgggga agtcactgtt tttagcgact cttttgtttg cactatctag tgctactttg 60
tatgataatg atacgtacgt ttactactac cagagcgcct tcagaccgtt tgatggttgg 120
catttacatg gtggcgctta tgcagtagta aatgtttctt cacaaactaa caatgcaggt 180
acagcttcag aatgcactgt tggtattatt agtggtgata cagttgttaa tgcctcttct 240
atagctatga cagcacctgt aggtcaaggt atgcggtggt ctaagttaca attttgtact 300
gcacactgca atttttctga ttttacagtg tttgttacac attgctatgc ctcgggcagc 360
ggtaaatgtc ctttaacggg ccttattcca caaggtcata ttcgtatttc tgctatgcgg 420
aatcatactt tattctataa tttaacagtt agtgtatcta agtaccctac ttttaaatct 480
ttgcaatgcg ttgataattt cacatctgtt tacttaaatg gtgaccttgt cttcacttct 540
aatcagacga cagacgttat aagtgcaggt gtgtacttta aatcaggtgg gcctataacc 600
tataaagtta tgaaggaatt taaggttttg gcttattttg ttaatggtac tgcacaagat 660
gttattttgt gtgatgacac acctagaggt ttgctagcat gtcaatataa tactggcaat 720
ttctcagatg gtttttatcc ttttactaat agtagcttag ttaagcaaag gtttgttgtt 780
tatcgtgaga atagtgttaa tactactctt actttaacca attacacctt tcataatgag 840
actaatgccc agcctaattc aggtggtgtc catactatct caacttatca aacacaaact 900
gctcagagtg gttattataa ttttaattta tcatttctga gtagttttgt gtataaagat 960
tctgattata tgtatgggtc ctaccaccca cgatgtagtt ttagaccaga aactattaat 1020
aatggcttgt ggtttaattc actgtcagtc tcattagctt atggccccct tcaaggtggg 1080
tgtaagcaat cagtttttca aggcagagct acttgttgtt atgcgtattc ctataacgga 1140
ccacgtatgt gtaaaggtgt ttatagtggt cagttatcac aagattttga atgtggactg 1200
ttggtttatg ttactaagag tgatggctct cgtatacaaa cagccacaaa accactggtc 1260
ataactcaac acaattataa taatattact ttaaatactt gtgttgagta caatatatat 1320
ggcagagttg gccaaggctt tattactaat gtaactgact ccgcagctag ctataattac 1380
ttagcagatg ctggattggc aattttagat acttcaggtg ccatagacac tttcgttgta 1440
caaggtgaat atggtcccaa ttattataag gttaaccctt gtgaagatgt taatcagcag 1500
tttgtagtgt caggcggtaa gttagtaggc attctgactt ctcgtaatga aactggttct 1560
cagcctcttg aaaatcagtt ttatattaag ttaactaatg gaagccgtcg ttttagacgt 1620
Claims (2)
1.一种用SPF鸡制备的TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清，其特征在于该阳性血清是采用TW1型鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/XNGD/140株病毒及其灭活疫苗免疫SPF雏鸡制备的；所述CK/CH/XNGD/140株病毒已于2019年06月19日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17997。
2.如权利要求1所述一种用SPF鸡制备的TW1型鸡传染性支气管炎病毒阳性血清，其特征在于，该血清的制备包括以下步骤：
（1）种毒鉴定：对IBV CK/CH/XNGD/140株病毒种毒的纯净性及基因型进行检测鉴定；
（2）制备灭活疫苗：使用IBV CK/CH/XNGD/140株病毒种毒接种SPF鸡胚，进行种毒扩繁；将扩繁好的病毒鸡胚尿囊液进行浓缩、灭活和乳化，制备出免疫用的TW1型IBV灭活疫苗；
（3）血清制备：
1）免疫：使用IBV CK/CH/XNGD/140株病毒滴鼻点眼免疫50日龄的SPF鸡；首免后14天，使用CK/CH/XNGD/140株病毒滴鼻点眼接种及其灭活疫苗颈部皮下、胸部肌肉注射加强免疫；二免后21天，使用灭活疫苗加强免疫；三免后21天，使用灭活疫苗加强免疫，阳性血清制备过程共进行四次免疫；
2）采血：四免后14天，无菌采血；
3）分离血清：采用孵育、离心的方法分离血清，将分离的血清用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存；
4）血清检验：对分离的血清进行无菌、支原体、外源病毒、血清中和效价测定和特异性检验，确定血清的纯净性、中和效力及特异性。
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Citations (3)
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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