CN110438090B - 鳞片脱落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鳞片脱落疾病(SDD)致病病毒及其衍生物。本发明还涉及包含所述病毒的细胞培养物，涉及基于所述病毒的疫苗和这样的疫苗的制备方法，涉及与所述病毒反应的抗体，涉及用于检测该病毒的诊断试验试剂盒，和涉及所述病毒的用途。

Description

鳞片脱落疾病(SDD)致病病毒及其衍生物

本申请是申请日为2014年5月28日的中国专利申请201480031056.1 “鳞片脱落疾病(SDD)致病病毒及其衍生物”的分案申请。

技术领域

本发明涉及分离的造成鱼的鳞片脱落疾病的病毒，涉及包含所述病毒的细胞培养物，涉及基于所述病毒的疫苗和这样的疫苗的制备方法，涉及与所述病毒反应的抗体，涉及用于检测该病毒的诊断测试试剂盒，和涉及所述病毒的用途。

背景技术

在过去的数十年中，全世界范围可见鱼类消耗的剧烈增加。这同样关于冷水鱼（诸如鲑鱼、比目鱼、大比目鱼和鳕鱼）以及热带鱼（诸如亚洲海鲈(尖吻鲈)、罗非鱼、遮目鱼、黄尾鱼、琥珀鱼、石斑鱼和军曹鱼）的消耗。因此，见到养鱼场的数目和大小的增加，以便满足日益增加的市场需要。

如由例如畜牧业已知的，紧密生活在一起的大量动物易受各种各样的疾病影响，甚至是几乎不知道或没见过的疾病，或甚至是在大规模商业养殖期之前未知的疾病。这对于鱼类养殖同样适用。

近年来，在养殖的亚洲海鲈(鲈鱼（Lates calcarifer）)中发现了一种新疾病综合征。该疾病的最显著特征在于鳞片脱落，并因此经常被称作“鳞片脱落综合征”(SDS)。在马来西亚槟榔屿（Penang）养殖的亚洲海鲈中首次报道了该疾病。以后发现该新疾病的爆发也在2002年、2006年和2009年发生在新加坡。更近的病例于2010年报道自印度尼西亚Bantam的养鱼场和再次来自新加坡，以及在2011年也来自Straits of Malaka的养鱼场。该疾病的发病率当前正在增加。

Gibson-Kueh, S., 等人(Journal of Fish Diseases 35; 19-27(2012))最近描述了该疾病综合征。

该疾病最初见于成年笼养鱼中，且也见于苗圃的鱼苗中。死亡率被描述为慢性的、拖延的，且在最初的30%至总体的75%之间变化。

遭受该综合征的鱼的主要临床征象首先是如上所述的鳞片脱落、昏睡行为和有时肿大的眼睛。鱼有时也显示出神经学征象：一些受影响的鱼显示出螺旋游泳，可能是由于脑中的血管损伤，其导致多病灶脑软化。

主要组织学征象具体地是所有重要器官（包括皮肤）中的血管内皮变性(血管炎)。该血管炎导致组织坏死，其也影响胃腺、脾、肾和心脏。也如Gibson-Kueh所述，覆盖鳞片床的真皮经常是坏死的，且与鳞片脱落有关。

但是，没有发现该疾病的成因。Gibson-Kueh声称，病鱼中的组织病理学以及在组织中观察到的大六角形病毒粒子和小得多的六角形病毒粒子可能提示病毒病原学的可能性，但是她的结论是，总体上，在检查的组织中的病毒粒子数目较低。基于大小和形态学，一些观察的病毒粒子类似于虹彩病毒，但是使用抗-真鲷虹彩病毒(Red SeabreamIridovirus，RSIV)单克隆抗体M10(Nakajima, K.等人, Fish Pathology 30: 115-119(1995))的免疫组织化学给出了阴性结果。

使用已知靶向大范围的已知虹彩病毒的RSIV引物的PCR测试也给出了阴性结果。

通过使鱼组织与蓝仿石鲈（Haemulon sciurusShaw） (GF)细胞和亚洲海鲈细胞接触来分离病毒的尝试(Chong, S.等人, Singapore Vet.J.1; 78-89 (1987))也没有成功。

鉴于观察到的非常低数目的病毒样颗粒，Gibson-Kueh提示，该疾病可能是对病毒抗原的免疫超敏反应的结果，而不是由病毒造成。例如，提示这样的反应是鲑鱼（salmonid）的草莓病的成因。

除此以外，血管炎和有关的坏死（其为SDS的标志）对于虹膜疾病并不是通常的。

此外，在SDS中看到的病变在几个方面不同于在虹彩病毒疾病中看到的病变。

尽管有上述的尝试，没有发现病毒起源，且甚至没有发现病毒涉入的证据，该事实将Gibson-Kueh引导至低数目的不同病毒的存在的以下解释：“病毒样颗粒相对难以发现。此外，全身性虹彩病毒疾病现是L. calcarifer养鱼场中的地方流行病，所以它们的存在可以是共同病原体的偶然发现”。

因为这些原因，该疾病的病原体直到现在仍然完全不明。

发明内容

本发明的一个目的是，提供该疾病的病原体以及以防止该疾病为目标的疫苗。此外，本发明的一个目的是，提供检测和鉴别所述病原体的装置。

现在已经确定，该疾病的病原体是具有约140 nm直径的二十面体病毒。

发现该病毒属于双链DNA病毒，且现在已经确定该病毒的DNA序列的大部分。

该新病毒的序列与基因组数据库中的其它序列的对比意外地揭示，在核苷酸水平，该病毒与虹彩病毒科（Iridoviridae）的病毒具有特定尽管低的相似性水平，所述虹彩病毒科是具有二十面体形状、具有120-350 nm之间的大小且具有双链基因组的病毒科。

由于现在已经鉴别出该疾病的病原体，该疾病在描述中不再被称作鳞片脱落综合征，而是被称作鳞片脱落疾病(SDD) (参见下文)。

该病毒的代表已经在登录号CNCM I-4754下保藏在Collection Nationale deCultures de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, 25 Rue duDocteur Roux,F-75724 Paris Cedex 15, France。

基于序列对比，可以鉴别编码主要衣壳蛋白的基因和编码该病毒的ATP酶的基因，其与已知的虹彩病毒科具有某种相似性。

编码主要衣壳蛋白的基因和编码ATP酶的基因的DNA序列的例子分别描述在SEQID NO: 1和SEQ ID NO: 3中。SEQ ID NO: 2代表主要衣壳蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:4代表ATP酶的氨基酸序列。

虹彩病毒科目前包括5个属：蛙病毒属（Ranaviruses）、肿大细胞病毒（Megalocytiviruses）、淋巴囊肿病毒属（Lymphocystiviruses）、绿虹彩病毒属（Chloriridoviruses）和虹彩病毒属（Iridoviruses）(Jun Kurita和Kazuhiro Nakajima,Viruses 4; 521-538 (2012))。

Kurita和Nakajima的论文具体地显示了5个属的共计20个已知种的系统树中的5个属的概要(另外，添加了3个囊泡病毒同系物作为外群体)。该系统树给出了不同种的相互亲缘关系/距离的指示，并且使为什么将这些病毒中的每一种归类为5个属之一的成员形象化。

基于根据本发明新发现的SDD病原体的MCP和ATP酶编码DNA序列，可以做出新的系统树（基于邻接方法），且发现编码序列中的MCP和ATP显示与虹彩病毒科的系统树的某种匹配。

使用程序MEGA, 第5版，使用标准设置，制作这些树(MEGA5: MolecularEvolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, EvolutionaryDistance, and MaximumParsimony Methods.锦鲤chiro Tamura, Daniel Peterson,Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei和SudhirKumar.Mol.Biol.Evol.28(10): 2731-2739.2011 doi:10.1093/molbev/msr121 Advance Access publication，2011年5月4日) 。

基于该新病毒的二十面体形状、120-350 nm之间的基因组大小和双链基因组，且基于主要衣壳蛋白邻接树（使用MEGA5得到，其具有指示推论的分支模式的稳健性的统计支持，如使用自举测试评估的），发明人认为该病毒是虹彩病毒科的一个成员。

基于MCP序列的树描绘在图8中。基于ATP酶序列的树描绘在图9中。

非常令人惊奇的是，基于它与5个已知属的距离，新发现的SDD的病原体似乎没有匹配5个属中的任一个，如从图8可以容易地看出的。

因而，基于它的主要衣壳蛋白和它的ATP酶的编码DNA序列，可以特别地将该病毒与虹彩病毒科的已知成员区分开。

经证实，根据本发明的病毒的主要衣壳蛋白与甚至虹彩病毒科的其它种中的最接近的MCP具有仅65%的序列同一性水平。

ATP酶与虹彩病毒科的其它种的最接近的ATP酶具有仅68%的序列同一性水平。

使用主要衣壳蛋白和ATP酶编码DNA序列，开发了对根据本发明的病毒特异性的引物。

SEQ ID NO: 1显示了编码根据本发明的病毒的主要衣壳蛋白的基因的核苷酸序列的通常例子。

应该理解，对于本文中包括的具体蛋白而言，天然变异可以存在于所述病原体的各个代表之间。导致例如主要衣壳蛋白序列中的微小变化的遗传变异确实存在。这对于ATP酶而言同样适用。首先，存在所谓的“第二和第三碱基中的摇摆”，其解释了核苷酸变化可能发生，其在它们编码的氨基酸序列中不引人注意：例如三联体TTA、TTG、TCA、TCT、TCG和TCC都编码亮氨酸。另外，可以在氨基酸序列中看到根据本发明的SDD病毒的代表之间的微小变异。这些变异可以由整个序列中的一个或多个氨基酸差异反映，或由所述序列中的一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入、倒位或添加反映。已经描述了基本上不会改变生物活性和免疫学活性的氨基酸置换，例如Neurath等人在“The Proteins”Academic Press New York(1979)中。有关的氨基酸之间的氨基酸置换或在进化中已经频繁发生的替换尤其是Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val (参见Dayhof, M.D., Atlas of proteinsequence and structure,Nat.Biomed.Res.Found., Washington D.C., 1978, 第5卷,增刊3)。其它氨基酸置换包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于该信息，Lipman和Pearson开发了一种用于快速和灵敏的蛋白对比(Science 227, 1435-1441, 1985)以及确定同源蛋白之间的功能相似性的方法。本发明的示例性实施方案的这类氨基酸置换以及具有缺失和/或插入的变异是在本发明范围内。

这解释了为什么MCP和ATP酶（当分离自根据本发明的SDD病毒的不同代表时）可能具有显著低于100%的同源性水平，但是仍然代表SDD病毒（鳞片脱落疾病的病原体）的MCP或ATP酶。

这明显地反映在例如Kurita和Nakajima的论文的图4中，其中表明，即使在由高度相关的淋巴囊肿疾病病毒(LCDV)组成的淋巴细胞病毒属内，所有LCDV仍然具有显著不同的MCP氨基酸序列。

附图说明：

图1: 在SDD病毒疑似感染的鱼和对照鱼上的SDD病毒PCR的结果(实验1)

图2: 在SDD病毒疑似感染的鱼和对照鱼上的真鲷虹彩病毒PCR的结果(实验1)

图3: SDD病毒qPCR标准曲线(实验1)。

图4: 在感染后第5天在BF-2细胞单层中的CPE。注意到聚集的细胞。比例条100µm

图5: 在感染后第5天的BF-2单层(对照)。比例条100µm

图6: SDD病毒主要衣壳蛋白DNA (a)和蛋白(b)序列。

图7: SDD病毒ATP酶DNA (a)和蛋白(b)序列。

图8: 虹彩病毒主要衣壳蛋白ORF的系统树。对于每个序列，显示了种名称、属和登录号。在节点处指明了2000个副本的百分比自举支持。距离条指示每个位点的核苷酸置换的数目。

图9: 虹彩病毒ATP酶ORF的种系发生。对于每个序列，显示了种名称和登录号。在节点处指明了2000个副本的百分比自举支持。距离条指示每个位点的核苷酸置换的数目。

图10: 在不同组中观察到的SDD病毒攻击以后的累积死亡率(%)。每个罐含有15条鱼，所述鱼被注射(IP和/或IM)不同剂量的细胞培养物繁殖的SDD病毒。

图11: 攻击以后在海鲈血清中的SDD病毒DNA拷贝。在得自每组15条鱼的汇集血清（在第1、3、7、10和14天取样）中通过qPCR测量SDD病毒DNA拷贝/µl。

图12: 得自组织培养物中的SDDV传代3的浓缩细胞和培养基收获物的冷冻-TEM图像。

具体实施方式

因而，本发明的第一个实施方案涉及一种分离的病毒，其是包含MCP基因和ATP酶基因的虹彩病毒科的一个成员，其特征在于：

a) 所述病毒是鱼的鳞片脱落疾病的病原体，且

b) MCP基因的核苷酸序列与在SEQ ID NO: 1中描绘的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

就本发明的目的而言，同一性水平应理解为SEQ ID NO: 1的序列与必须要确定其同一性水平的病毒的主要衣壳蛋白的对应区域的同一性水平。

用于确定同一性水平的合适程序是NCBI’s Basic Local Alignment SearchTool的核苷酸blast程序(blastn)，其使用“比对2个或更多个序列”选项和标准设置(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

就本发明的目的而言，分离是指：脱离所述病毒在自然界中伴随的组织。分离的病毒的一个例子是存在于细胞培养物中的病毒。

该实施方案的一种优选形式涉及具有主要衣壳蛋白(MCP)基因的病毒，所述主要衣壳蛋白(MCP)基因与SEQ ID NO: 1所示的MCP的核苷酸序列具有至少82%的同一性水平，更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%，以该优先次序。

表征根据本发明的病毒的另一种可选方式涉及所述病毒的ATP酶的序列。

SEQ ID NO: 3显示了根据本发明的病毒的ATP酶基因的核苷酸序列的一个通常例子。但是，如上面所解释的，发现了导致ATP酶序列的微小变化的天然变异。

因而，本发明的该实施方案的另一种形式涉及一种分离的病毒，其是包含MCP基因和ATP酶基因的虹彩病毒科的一个成员，其特征在于：

a) 所述病毒是鱼的鳞片脱落疾病的病原体，且

b) ATP酶基因的核苷酸序列与在SEQ ID NO: 3中描绘的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

该实施方案的一种优选形式涉及一种具有ATP酶基因的病毒，所述ATP酶基因与在SEQ ID NO: 3中描绘的ATP酶基因的核苷酸序列具有至少82%的同一性水平，更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%，以该优先次序。

该实施方案的一种更优选形式涉及根据本发明的病毒，其中所述MCP基因的核苷酸序列与在SEQ ID NO: 1中描绘的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平，且所述ATP酶基因的核苷酸序列与在SEQ ID NO: 3中描绘的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

表征根据本发明的病毒的还另一种可选方式取决于PCR测试，其使用对根据本发明的病毒的主要衣壳蛋白基因序列或ATP酶基因序列特异性的引物集合。针对它们对所述病毒的特异性，选择了3个不同的引物集合，其序列描绘在SEQ ID NO: 5-6、SEQ ID NO: 7-8和SEQ ID NO: 9-10中。

使用与所述病毒的主要衣壳蛋白基因特异性地反应的第一引物集合(SEQ ID NO:5-6)的PCR测试利用两种引物SDD-50-FW:CAGTGCATTACAAGAAAG和SDD-213-REV:GCTGAAACAACAATTTAG。

使用也与所述病毒的主要衣壳蛋白基因特异性地反应的第二引物集合(SEQ IDNO: 7-8)的PCR测试利用两种引物SDD-MCP-277-FW: TCCTGTGCAGCTGTCTAAAC和SDD-MCP-1090-REV:ACTGGCAATGATGGGCGATG。

使用与所述病毒的ATP酶基因特异性地反应的第三引物集合(SEQ ID NO: 9-10)的PCR实验利用两种引物SDD-ATP酶-65-FW: TCGGAGGGATGAAATTGG和SDD-ATP酶-618-REV:AGCGTTGTCGATGTAGAG。

在实施例部分中更详细地描述的测试是标准PCR测试。

如果第一引物集合的PCR产物的分析揭示大约164个碱基对的PCR产物，或如果第二引物集合的PCR产物的分析揭示大约814个碱基对的PCR产物，或如果第三引物集合的PCR产物的分析揭示大约554个碱基对的PCR产物，且所述病毒是鳞片脱落疾病的病原体，那么这无疑证实，所分析的病毒属于根据本发明的病毒。

仅仅作为一个例子：大约164个碱基对的PCR产物是具有164 + 10和164 - 10个碱基对之间的长度的PCR产物。大约814个碱基对的PCR产物是具有814 + 10和814 - 10个碱基对之间的长度的PCR产物。

因此，本发明的该实施方案的另一种形式再次涉及一种分离的病毒，其是包含MCP基因和ATP酶基因的虹彩病毒科的一个成员，其特征在于：

a) 所述病毒是鱼的鳞片脱落疾病的病原体，且

b) 所述病毒DNA在PCR反应中与在SEQ ID NO: 5和6中描绘的引物集合反应以产生164±10个碱基对的PCR产物，或者在PCR反应中与在SEQ ID NO: 7和8中描绘的引物集合反应以产生814±10个碱基对的PCR产物，或者在PCR反应中与在SEQ ID NO: 9和10中描绘的引物集合反应以产生554±10个碱基对的PCR产物。

该实施方案的一种优选形式涉及根据本发明的病毒，其中所述病毒DNA在PCR反应中与在SEQ ID NO: 5和6中描绘的引物集合反应以产生164±10个碱基对的PCR产物，且在PCR反应中与在SEQ ID NO: 7和8中描绘的引物集合反应以产生814±10个碱基对的PCR产物，且在PCR反应中与在SEQ ID NO: 9和10中描绘的引物集合反应以产生554±10个碱基对的PCR产物。

该实施方案的一种更优选形式涉及根据本发明的病毒，其中所述MCP基因的核苷酸序列与在SEQ ID NO: 1中描绘的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平，且所述ATP酶基因的核苷酸序列与在SEQ ID NO: 3中描绘的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平，且其中所述病毒DNA在PCR反应中与在SEQ ID NO: 5和6中描绘的引物集合反应以产生164±10个碱基对的PCR产物，且在PCR反应中与在SEQ ID NO: 7和8中描绘的引物集合反应以产生814±10个碱基对的PCR产物，且在PCR反应中与在SEQ ID NO: 9和10中描绘的引物集合反应以产生554±10个碱基对的PCR产物。

根据本发明的病毒可以呈活的形式、活的减毒形式、或灭活的形式。

如上面指出的，现在已经表征了编码所述病毒的MCP和ATP酶的基因的DNA序列。

这些基因的鉴别是非常有用的，因为它们现在可以用在DNA-疫苗中，用于这些蛋白的表达，和用于诊断目的，如将在下面广泛地解释的。

因此，本发明的另一个实施方案涉及包含编码主要衣壳蛋白的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因与在SEQ ID NO: 1中描绘的MCP基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

该实施方案的一种优选形式涉及这样的包含基因的DNA片段，所述基因与在SEQID NO: 1中描绘的MCP的核苷酸序列具有至少82%的同一性水平，更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%，以该优先次序。

本发明的另一个实施方案涉及包含编码ATP酶的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因与在SEQ ID NO: 3中描绘的ATP酶基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

该实施方案的一种优选形式涉及这样的包含基因的DNA片段，所述基因与在SEQID NO: 3中描绘的ATP酶的核苷酸序列具有至少82%的同一性水平，更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%，以该优先次序。

本发明的另一个实施方案涉及一种主要衣壳蛋白，其特征在于，该MCP是由编码根据本发明的编码主要衣壳蛋白的DNA片段编码。

根据本发明的病毒的这类MCP是非常合适的，因为它们在疫苗中是合适的，并且它们使得诊断测试成为可能，如下面解释的。

该实施方案的一种优选形式涉及具有在SEQ ID NO: 2中描绘的氨基酸序列的MCP。

本发明的再另一个实施方案涉及ATP酶，其特征在于，所述ATP酶是由根据本发明的编码ATP酶的DNA片段编码。

根据本发明的病毒的这类ATP酶是非常合适的，具体地因为它们使得诊断测试成为可能，如下面解释的。

该实施方案的一种优选形式涉及具有在SEQ ID NO: 4中描绘的氨基酸序列的ATP酶。

该实施方案的一种优选形式涉及具有在SEQ ID NO: 4中描绘的氨基酸序列的ATP酶。

现在已经鉴别了几个能够支持根据本发明的病毒的复制的鱼细胞系。

可以用于培养根据本发明的病毒的细胞系的一个例子是得自亚洲海鲈的脑细胞的细胞系。Hasoon等人已经在In Vitro Cell.Dev.Biol.- Animal 47: 16-25 (2011)中具体描述了分离这样的细胞系的方法。

可以用于培养根据本发明的病毒的细胞系的另一个例子在登录号CNCM I-4755下保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM), InstitutPasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15,France。

因而，本发明的再另一个实施方案涉及包含病毒的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含根据本发明的病毒。

既然已经发现了该疾病的成因且可以证实具有病毒起源，可以有意地诱导该疾病并且可以实际上在健康鱼中诱导上述疾病的通常征象，如在实施例部分中详细展示的。

本发明的优点之一还是，所述病原体是现在已知的，疫苗的开发已经变得可行。

因而，本发明的另一个实施方案涉及用于防止鱼的鳞片脱落疾病的疫苗，其中这样的疫苗包含根据本发明的病毒和药物上可接受的载体。

防止在这方面应当在广义上解释：认为防止鳞片脱落疾病包括为了预防该疾病而接种疫苗，为了减少该疾病的征象而接种疫苗，和在诊断出该疾病以后接种治疗疫苗。

就疫苗目的而言，所述病毒优选地在血清学上与covalescent抗-SDD病毒抗血清反应或与针对保藏的病毒产生的抗血清反应。

血清学反应应当在广义上解释：认为血清学反应是在标准血清学测试（诸如ELISA测试）中的反应。

适合用在根据本发明使用的疫苗中的药物上可接受的载体的例子是无菌水、盐水、水性缓冲液诸如PBS等。另外，根据本发明的疫苗可以包含如下所述的其它添加剂，诸如佐剂、稳定剂、抗氧化剂和其它。

根据本发明的疫苗可以包含呈减毒活形式或灭活形式的根据本发明的病毒。

减毒的活病毒疫苗，即包含活减毒形式的根据本发明的病毒的疫苗，与灭活疫苗相比具有以下优点：它们最佳地模仿天然感染途径。另外，它们的复制能力允许接种小量病毒；它们的数目将自动地增加，直到它达到免疫系统的触发水平。从此刻开始，免疫系统将被触发并最后消除病毒。

但是，活减毒病毒的应用的一个微小缺点可能是，固有地剩余某一水平的毒力。这不一定是真实的缺点，只要毒力水平是可接受的即可，即只要疫苗至少阻止鱼死亡即可。当然，活减毒疫苗的剩余毒力越低，在疫苗接种过程中/以后疫苗接种对重量增加的影响越小。

活减毒病毒是与分离自野外的病毒相比具有降低的毒力水平的病毒。如上所述，分离自野外的病毒的毒力相对较高；死亡率通常超过所有被感染的鱼的30%。具有降低的毒力水平的病毒被视作仅诱导疾病达到不超过10%的死亡率的程度的病毒，且所有被感染的鱼中的90%或更多活过感染。

因此，本发明的该实施方案的一种优选形式涉及包含根据本发明的病毒的疫苗，其中所述病毒是呈活减毒形式。

减毒病毒可以例如通过如下得到：在有诱变剂存在下培养根据本发明的病毒，随后选择显示出后代水平的下降和/或复制速度的下降的病毒。许多这样的试剂是本领域已知的。

另一种非常经常使用的方法是连续体外传代。病毒随后适应了用于连续传代的细胞系，使得它们在再次作为疫苗转移至天然宿主时具有减毒的表现。

得到减毒病毒的还另一种方式是，在偏离它们的天然生境温度的温度下使它们生长。温度敏感突变体(Ts-突变体)的选择方法是本领域众所周知的。这样的方法包括在有诱变剂存在下培养病毒，随后在次优温度和在最佳温度培养，在细胞层上滴定后代病毒，和视觉选择在最佳温度较慢生长的那些噬斑。这样的小噬斑包含缓慢生长的和因而期望的活减毒病毒。

与它们的活减毒相应物相比，灭活疫苗是固有地安全的，因为其没有残留剩余毒力。尽管事实上它们经常包含与活减毒疫苗相比稍微更高剂量的病毒，它们可以例如是已经遭受其它疾病的鱼中的疫苗的优选形式。被维持在次优条件（诸如不完全营养物或次优温度）下的鱼也会受益于灭活疫苗。

因此，该实施方案的另一种优选形式涉及包含根据本发明的病毒的疫苗，其中所述病毒是呈灭活形式。

许多将病毒灭活的物理和化学方法现在是本领域已知的。物理灭活的例子是紫外辐射、X-射线辐射、γ-辐射和加热。灭活化学物质的例子是ß-丙内酯、戊二醛、乙烯亚胺和甲醛。技术人员知道如何应用这些方法。

优选地，用ß-丙内酯、戊二醛、乙烯亚胺或甲醛灭活病毒。显而易见，在本发明中也包括其它将病毒灭活的方式。

原则上，制备基于灭活的虹彩病毒的疫苗的标准方法同样适用于根据本发明的病毒。仅仅作为一个例子：Zhengliang Ou-yang等人在Developmental and ComparativeImmunology38: 254-261 (2012)中已经具体描述了制备基于灭活的完整新加坡石斑鱼虹彩病毒的疫苗的方法。

此外，在下面的实施例部分中，呈现了制备基于根据本发明的灭活病毒的疫苗的方法的实施例。

防止SDD的另一个方法是使用亚单位疫苗。这样的疫苗不包含全病毒，而是仅仅包含病毒的一个或多个抗原组分。

亚单位疫苗具有以下优点：对于它们的制备而言，不需要培养病毒。通过在表达系统中克隆编码该亚基的DNA，足以表达选择的亚基。

发现根据本发明的病毒的MCP是一种非常有关的免疫原性蛋白。

它显然与虹彩病毒科内的已知成员共有该特征。Qi Wei Qin (J.VirologicalMethods 106: 89-96 (2002))证实了来自石斑鱼的海洋虹彩病毒的MCP的免疫原性关联性。近年来，XiaozheFu等人证实了鳜鱼（mandarin fish）中针对虹彩病毒疾病的保护性免疫，其由传染性脾和肾坏死病毒的重组MCP诱导(Fish and Shellfish Immunology 33:880-885 (2012))。ZhengliangOu-yang等人(Veterinary Immunology andImmunopathology 149: 38-45 (2012))描述了基于在大肠杆菌（E.coli）中表达的MCP的疫苗接种。它们使用重组MCP蛋白(50微克蛋白)得到显著的保护。

Yutaka Tamaru等人(Biotechn. Prog. 22: 949-953 (2006))具体地描述了用于给鱼口服施用的基于MCP的疫苗。它们描述了真鲷（RedSea Bream）虹彩病毒的MCP在酵母细胞表面上的表达，作为鱼的针对虹彩病毒的口服疫苗接种的基础。

除此以外，在许多教科书中给出了蛋白表达领域中的更一般指导。给出关于在细菌表达系统中的表达的广泛信息的手册是例如：Richard H.Baltz (主编), ArnoldL.Demain (主编), Julian E.Davies (主编)，Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 第3版，ISBN: 978-1-55581-512-7, Peter E.Vaillancourt，E.coli gene expression protocols，见Methods in Molecular Biology 205 ISBN: 1-58829-008-5, S.J.Higgins和B.D.Hames，Protein expression: a practical approach，ISBN:0-19-963624-9,François Baneyx，Protein expression technologies: current status and future trends, 2004, O’Reilly, D等人,Baculovirus expression vectors; a laboratory manual, Oxford University Press 1994, ISBN 0-19-509131-0，和GerdGellissen，Production of recombinant proteins: novel microbial and eukaryotic expression systems, ISBN: 3-527-31036-3。

因而，本发明的该实施方案的第三种优选形式涉及用于防止鱼的鳞片脱落疾病的疫苗，其中所述疫苗包含根据本发明的主要衣壳蛋白和药物上可接受的载体。

最后，证实了包含本发明所述的MCP基因序列的DNA片段非常适合用在DNA疫苗中。

Zhengliang Ou-yang (Veterinary Immunology and Immunopathology 149:38-45 (2012))具体地描述了这样的DNA片段，其包含在真核表达载体中的新加坡石斑鱼虹彩病毒的MCP-基因的DNA。它们与用30微克DNA的疫苗接种的引发-强化方案一起实现针对新加坡石斑鱼虹彩病毒感染的保护。

Caipang, C.M.A.等人(Fish and Shellfish Immunology 21:130-138 (2006))证实了使用DNA疫苗针对真鲷虹彩病毒而对真鲷的稳健保护。他们使用DNA疫苗，其包含在巨细胞病毒立即/早期增强子启动子控制下的RSIV的MHC-基因。

因而，本发明的该实施方案的第四种优选形式涉及用于防止鱼的鳞片脱落疾病的疫苗，其中所述疫苗包含DNA片段和药物上可接受的载体，所述DNA片段包含编码根据本发明的主要衣壳蛋白的基因。

如果根据本发明的病毒用作用于口服施用(例如通过浸渍或浴疗)的疫苗组分，经常不需要施用佐剂。

但是，如果将疫苗制品直接注射进鱼中，佐剂的应用是任选的。

特别地，当注射疫苗中的病毒组分是呈灭活形式时，佐剂的添加可能是优选的。

一般而言，为了强化免疫应答，所述疫苗可以包括多种佐剂，特别在所述制剂意图用于注射的情况下。

佐剂是以非特异性的方式强化宿主的免疫应答的免疫刺激物质。所述佐剂可以是亲水佐剂，例如氢氧化铝或磷酸铝，或疏水佐剂，例如基于矿物油的佐剂。佐剂诸如胞壁酰基二肽、抗生物素蛋白、氢氧化铝、磷酸铝、油、油乳剂、皂苷、硫酸葡聚糖、葡聚糖、细胞因子、嵌段共聚物、免疫刺激性的寡核苷酸和本领域已知的其它佐剂可以与根据本发明的病毒一起混合。经常用在鱼疫苗中的佐剂的例子是胞壁酰基二肽、脂多糖、几种葡聚糖和聚糖以及Carbopol®(一种同聚物)。合适的佐剂是例如油包水(w/o)乳剂、o/w乳剂和w/o/w双乳剂。适合用在w/o乳剂中的油佐剂是例如矿物油或可代谢的油。矿物油是例如Bayol®、Marcol®和Drakeol®；可代谢的油是例如植物油，诸如花生油和大豆油，或动物油诸如鱼油、角鲨烷和角鲨烯。可选地，可以有利地使用在EP 382,271中描述的维生素E (生育酚)加溶物（solubilisate）。非常合适的o/w乳剂例如从5-50%w/w水相和95-50%w/w油佐剂开始得到，更优选地使用20-50%w/w水相和80-50%w/w油佐剂。加入的佐剂的量取决于佐剂本身的性质和将由生产商提供的关于这样的量的信息。

非矿物油佐剂的另一个例子是例如Montanide-ISA-763-A。

基于水的纳米颗粒佐剂的一个例子是例如Montanide-IMS-2212。

在Jan Raa (Reviews in Fisheries Science 4(3): 229-288 (1996))的综述论文中给出了适合用于鱼和贝疫苗的佐剂的广泛概述。

因而，根据本发明的疫苗的一种优选形式涉及包含佐剂的疫苗。

特别地，在它包含活减毒病毒的情况下，根据本发明的疫苗另外包含稳定剂。可以将稳定剂加入根据本发明的疫苗中，例如以保护它免于降解，以增加贮存期限，或以改善冷冻干燥效率。有用的稳定剂具体地是SPGA (Bovarnik等人, 1950, J. Bacteriology, 第59卷, 第509页)、脱脂奶、明胶、牛血清白蛋白、碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖、乳糖、蛋白诸如白蛋白或酪蛋白或其降解产物和缓冲剂，诸如碱金属磷酸盐。为了重构冷冻干燥的组合物，将它悬浮于生理上可接受的稀释剂中。这样的稀释剂可以例如象无菌水或生理盐溶液一样简单。在更复杂的形式中，可以将冷冻干燥的疫苗悬浮于乳剂中，例如如在EP1,140,152中所述。

可以加入抗生素诸如新霉素和链霉素以阻止细菌（germ）的潜在生长。

另外，所述疫苗可以包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂，例如Span®或吐温®。所述疫苗也可以包含所谓的“媒介物”。媒介物是根据本发明的病毒所附着的化合物，而没有共价地结合它。这样的媒介物具体地是生物微胶囊、微-海藻酸盐、脂质体和大分子物（macrosol），都是本领域已知的。这样的媒介物的一种特殊形式是ISCOM。不言而喻，将其它稳定剂、载体、稀释剂、乳剂等与根据本发明的疫苗混合也在本发明范围内。这样的添加剂例如描述在众所周知的手册中，诸如：“Remington: the science and practiceof pharmacy”(2000,Lippincot, USA, ISBN: 683306472), 和: “Veterinaryvaccinology”(P.Pastoret等人编, 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681)。

用于将根据本发明的疫苗施用给靶生物体的给药方案可以是单次或多次剂量的应用，其可以同时或依次施用，以与剂量和制剂相容的方式且以将免疫学上有效的这样的量。

构成根据本发明的疫苗的“免疫原性有效量”的量取决于期望的作用和靶生物体，所述疫苗基于根据本发明的病毒(或例如所述病毒的亚基，诸如MCP或编码MCP的DNA疫苗)。本文中使用的术语“免疫原性有效量”是指在鱼中诱导免疫应答所必需的根据本发明的免疫原性病毒(或例如所述病毒的亚基，诸如MCP或编码MCP的DNA疫苗)的量，所述免疫应答达到它减轻由野生型SDD病毒(SDDV)感染造成的病理学作用的程度，所述减轻是相对于未免疫的鱼中野生型SDDV感染造成的病理学作用。

确定治疗是否是“免疫学上有效的”完全属于技术人员的能力，例如，通过给接种疫苗的动物施用实验性攻击感染，接下来确定靶动物的疾病临床征象、血清学参数，或通过测量病原体的重新分离，随后将这些发现与在野外感染的鱼中观察到的那些发现进行对比。

施用的病毒的量将取决于施用途径、佐剂的存在和施用时机。

将包含根据本发明的病毒的活疫苗的优选量表达为例如组织培养物感染剂量(TCID50)。例如，对于活病毒，可以有利地使用在1-10¹⁰TCID50/动物剂量之间的剂量范围；优选地使用10²-10⁶TCID50之间的范围。

可以应用许多施用方式，都是本领域已知的。优选地通过注射(肌肉内或经由腹膜内途径)、浸渍（immersion）、浸入（dipping）或口服将根据本发明的疫苗施用给鱼。根据标准疫苗接种实践，可以优化施用方案。

如果疫苗包含根据本发明的灭活病毒，可以将剂量表达为要施用的病毒颗粒的数目。与活病毒颗粒的施用相比，所述剂量经常稍高，因为活病毒颗粒在被免疫系统除去之前在靶动物中复制达到某种程度。对于基于灭活病毒的疫苗，在约10⁴-10⁹个颗粒范围内的病毒颗粒的量经常是合适的，取决于使用的佐剂。

如果疫苗包含亚基，例如根据本发明的MCP，将以微克蛋白来表达剂量。对于基于亚基的疫苗，合适的剂量经常是在5-500微克蛋白之间的范围内，取决于使用的佐剂。

如果疫苗包含含有编码主要衣壳蛋白的基因的DNA片段，将以微克DNA来表达剂量。对于基于亚基的疫苗，合适的剂量经常是在5-500微克DNA之间的范围内，具体地取决于使用的表达质粒的效率。在许多情况下，每条鱼20-50微克质粒之间的量对于有效的疫苗接种而言是足够的。

根据本发明的疫苗可以呈满足以下条件的任何形式：适合于在水产养殖的背景下施用，并且匹配期望的施用途径和预期效应。通过技术人员常用的方式制备根据本发明的疫苗。

优选地，以适合于注射或浸渍疫苗接种的形式（诸如混悬液、溶液、分散体、乳剂等）配制根据本发明的疫苗。

在使用灭活病毒疫苗或亚单位疫苗的情况下，腹膜内施用是一种有吸引力的施用方式。特别是在腹膜内施用的情况下，佐剂的存在将是优选的。但是，该疫苗接种途径比诸如浸渍等施用途径更人工密集。

为了容易施用疫苗，口服和浸渍疫苗接种途径是优选的。

对于口服施用，优选地将疫苗与用于口服施用的合适载体混合，所述载体即纤维素、食物或可代谢的物质诸如α-纤维素或植物或动物起源的不同油。还有一种有吸引力的方法是将疫苗施用给高浓度的活饲料生物，随后将活饲料生物喂给鱼。用于口服递送根据本发明的疫苗的特别优选的食物载体是能够包封疫苗的活饲料生物。合适的活饲料生物包括浮游生物样非选择性的滤食动物（filter feeder），优选轮虫、卤虫（Artemia）、桡足幼体、藻类等的成员。

要接种疫苗的鱼的年龄不是至关重要的，但是显然，人们希望在尽可能早的阶段（即在可能暴露于病原体之前）给鱼接种疫苗以防SDD病毒感染。

浸渍疫苗接种是候选的疫苗接种，特别是在鱼仍然较小时，例如低于5克。如果必要或期望的话，也可以借助于注射给5克和以上的鱼接种疫苗。

另外，本领域的技术人员会在上面提及的参考文献中和在下面给出的信息中（特别是在实施例中）找到足够的指导。

关于鱼疫苗和它们的制备的综述文章具体地公开在：Sommerset, I., Krossøy,B., Biering, E.和Frost, P. Expert Review of Vaccines4: 89-101 (2005)，Buchmann, K., Lindenstrøm, T.和Bresciani,J. Acta Parasitologica46: 71-81(2001), Vinitnantharat, S., Gravningen, K.和Greger,E.Advances in veterinary medicine41: 539-550 (1999)，和Anderson, D.P. Developments in Biological Standardization90: 257-265 (1997)。

此外，熟练的从业人员会在下面的实施例中找到充足的指导。

显然，SDD病毒远远不是唯一鱼病原体：商业上重要的温水鱼病原性微生物和病毒的例子是鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、美人鱼发光杆菌（Photobacterium damsela）杀鱼亚种、Tenacibaculum maritimum、黄杆菌属物种（Flavobacterium sp.）、屈挠杆菌属物种（Flexibacter sp.）、链球菌属物种（Streptococcus sp.）、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、鲶鱼爱德华氏菌（E. ictaluri）、病毒性神经坏死病毒、除了根据本发明的病毒以外与虹彩病毒科共有许多特征的虹彩病毒、和锦鲤疱疹病毒。

因而，有益的是，将根据本发明的疫苗与至少一种其它鱼病原性微生物或病毒和/或至少一种免疫原性组分和/或编码该其它鱼病原性微生物或病毒的所述其它免疫原性组分的遗传物质组合：一次单独疫苗接种然后可以保护免于SDD病毒感染以及该其它鱼病原性微生物或病毒的感染。

因此，该实施方案的一种优选形式涉及根据本发明的疫苗，其中该疫苗包含至少一种其它的免疫原性组分和/或抗原或编码鱼病原性微生物或病毒的所述其它免疫原性组分的遗传物质。

优选地，所述鱼病原性微生物或鱼病原性病毒选自鳗弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、Tenacibaculum maritimum、黄杆菌属物种、屈挠杆菌属物种、链球菌属物种、格氏乳球菌、迟钝爱德华氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、病毒性神经坏死病毒、除了根据本发明的病毒以外与虹彩病毒科共有许多特征的虹彩病毒、和锦鲤疱疹病毒。

还另一个实施方案涉及一种用于制备根据本发明的疫苗的方法，其中所述方法包括，将根据本发明的病毒和/或根据本发明的MCP和/或编码根据本发明的MCP的DNA片段与药物上可接受的载体混合。

本发明的再另一个实施方案涉及用于疫苗中使用的根据本发明的病毒和/或根据本发明的MCP和/或编码根据本发明的MCP的DNA片段。

如上所述，SDD病毒感染以后的致死率可以容易地高达30%，且可以容易地达到75%。除此以外，疾病以相对较高的速度袭击（strike）。因而，为了有效地保护免于疾病，SDD的快速且正确诊断是重要的。

因此，本发明的另一个目的是，提供适合用于检测SDD和SDD病毒的诊断工具。

这些工具部分地依赖于针对病毒的抗体的可用性。这样的抗体可以例如用在SDD和SDD病毒的诊断测试中。

针对根据本发明的病毒的抗体的一个非常合适的来源是例如已经被根据本发明的病毒感染的海鲈的血液或血清。

通过用根据本发明的病毒（在例如油包水混悬液中）给例如猪、家禽或例如兔接种疫苗，也可以快速地和容易地得到针对根据本发明的病毒的抗体或抗血清，随后在约4周以后，抽血，离心凝固的血液，并倾析血清。这样的方法是本领域众所周知的。

用于制备抗体的其它方法是本领域众所周知的，所述抗体可以是多克隆抗体、单特异性抗体或单克隆抗体(或其衍生物)。如果多克隆抗体是期望的，用于生产和加工多克隆血清的技术是数十年来本领域众所周知(例如Mayer和Walter, 编. ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987)。

通过也是本领域长期已知的技术(Kohler和Milstein, Nature, 256, 495-497,1975)，通过免疫近亲交配的小鼠，可以制备可与根据本发明的病毒反应的单克隆抗体。

因而，本发明的另一个实施方案涉及与根据本发明的病毒反应的抗体或抗血清。

诊断测试试剂盒（其基于检测根据本发明的病毒或该病毒的抗原性材料，且因此适合用于检测SDD病毒感染）可以例如包含标准的ELISA测试。在这样的实验的一个例子中，用针对该病毒的抗体包被ELISA板的孔的壁。与要测试的材料一起温育以后，将可与该病毒反应的标记的抗体加入孔中。如果要测试的材料确实包含SDD病毒，该病毒将结合包被至ELISA的孔的抗体。随后加入孔中的可与该病毒反应的标记的抗体又会结合该病毒，然后显色反应揭示该病毒的抗原性材料的存在。

因此，本发明的还另一个实施方案涉及用于检测根据本发明的病毒或该病毒的抗原性材料的诊断测试试剂盒，其包含可与根据本发明的病毒或可与其抗原性材料反应的抗体。应当在广义上解释所述病毒的抗原性材料。它可以是例如分解形式的病毒，或包含病毒外膜蛋白的病毒包膜材料。只要所述病毒的材料与针对该病毒产生的抗血清反应，那么所述材料被视作抗原性材料。

诊断测试试剂盒（其基于检测血清中可与根据本发明的病毒或该病毒的抗原性材料反应的抗体，且因此适合用于检测SDD病毒感染）也可以例如包含标准的ELISA测试。在这样的测试中，可以例如用根据本发明的病毒或其抗原性材料包被ELISA板的孔的壁。与要测试的材料（例如疑似被SDD病毒感染的鱼的血清）一起温育以后，将可与根据本发明的病毒反应的标记的抗体加入孔中。如果抗-SDD病毒抗体存在于测试的血清中，这些抗体将结合包被至ELISA的孔的病毒。结果，以后加入的可与该病毒反应的标记的抗体不会结合，且不会发现显色反应。显色反应的缺乏因而揭示可与根据本发明的病毒反应的抗体的存在。

因此，本发明的还另一个实施方案涉及用于检测抗体的诊断测试试剂盒，所述抗体可与根据本发明的病毒反应或可与所述病毒的抗原性材料反应，所述病毒的抗原性材料包括根据本发明的病毒或其抗原性材料。

免疫测定的设计可以变化。例如，所述免疫测定可以基于竞争反应或直接反应。此外，方案可以使用固体支持物，或可以使用细胞材料。抗体-抗原复合物的检测可以包括使用标记的抗体；所述标记可以是，例如，酶、荧光分子、化学发光分子、放射性分子或染料分子。

除了上述的ELISA以外，用于检测可与样品中的根据本发明的病毒反应的抗体的合适方法包括免疫荧光测试(IFT)和蛋白质印迹分析。

用于诊断根据本发明的病毒的存在或不存在的一种可选的、但是快速的和容易的诊断测试是如上所述的PCR测试，其包含可与例如SDD病毒的MCP或ATP酶基因的特定区域反应的PCR引物集合。在该背景下，特定是指例如SDD病毒的MCP或ATP酶基因所特有的，即不存在于虹彩病毒科的其它成员中。

优选地，这样的测试将使用：使用两种引物SDD-50-FW:CAGTGCATTACAAGAAAG和SDD-213-REV:GCTGAAACAACAATTTAG的引物集合(SEQ ID NO: 5-6)，其与所述病毒的主要衣壳蛋白特异性地反应；或使用两种引物SDD-MCP-277-FW: TCCTGTGCAGCTGTCTAAAC和SDD-MCP-1090-REV:ACTGGCAATGATGGGCGATG的引物集合(SEQ ID NO: 7-8)，其也与所述病毒的主要衣壳蛋白特异性地反应；或使用两种引物SDD-ATP酶-65-FW: TCGGAGGGATGAAATTGG和SDD-ATP酶-618-REV: AGCGTTGTCGATGTAGAG的引物集合(SEQ ID NO: 9-10)，其与所述病毒的ATP酶特异性地反应。

不言而喻，可以使用比上述鉴定的引物更多的引物。本发明首次提供了SDD病毒的MCP和ATP酶基因的独特序列。这允许技术人员无需任何另外努力就会选择其它选择性的引物。通过本发明提供的MCP或ATP酶基因序列与虹彩病毒科的其它成员的已知MCP或ATP酶基因序列的简单计算机分析，技术人员能够为诊断测试开发其它特定的PCR-引物，所述诊断测试用于检测SDD病毒和/或将SDD病毒与其它病毒性(鱼)病原体区分开。

与SDD病毒的MCP或ATP酶基因特异性地反应的PCR-引物被理解为这样的引物：其仅与SDD病毒的MCP或ATP酶基因反应，且不与另一种(鱼)病原性病毒或一组(鱼)病原性病毒的MCP基因反应。

因而，另一个实施方案涉及用于检测根据本发明的病毒的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试试剂盒包含可与SDD病毒的MCP或ATP酶基因的特定区域反应的PCR引物集合。

该实施方案的一种优选形式涉及用于检测根据本发明的病毒的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试包含在SEQ ID NO: 5-6中描绘的引物集合或在SEQ ID NO: 7-8中描绘的引物集合或在SEQ ID NO: 9-10中描绘的引物集合。

实施例：

实施例1：SDD病毒的分离和体外培养

用于分离病毒的血清、心脏、脾和肾样品的收集，PCR分析和体外病毒培养

实验1：

在新加坡养鱼场从具有通常鳞片脱落疾病征象的鱼和没有鳞片脱落疾病征状的鱼收集样品。所述样品由得自患病动物的一个心脏、两个脾。三个肾和四个血清样品组成。另外，从健康海鲈收集两个脾、四个肾和两个血清样品。

实验2：

在该实验中，从得自印度尼西亚养鱼场的三组鱼收集血清、肾和脾样品。组1由来自没有鱼呈现鳞片脱落疾病(SDD)的征状的笼的3条对照鱼组成。组2由来自具有SDD早期阶段的笼的5条鱼组成，其中死亡刚刚开始。组3由来自具有严重SDD征象的笼的5条鱼组成，其中死亡率达到高峰。

实验3：

在该实验中，从得自印度尼西亚养鱼场的两组鱼收集血清样品。组1由来自没有鱼呈现SDD征状的笼的3条对照鱼组成。组2由来自SDD爆发处于初始阶段的笼的20条鱼组成。所述鱼没有显示征状或显示微小征状。

样品制备/组织匀浆化和DNA分离

使用玻璃珠在0,01M PBS中将组织样品(脾、肾和心脏)匀浆化至10%(w/v)匀浆物。

如下得到血清：通过尾部静脉穿刺术收集血液，使其凝结（cloth），并在通过标准离心使血细胞沉淀以后收集血清。

使用生产商的说明书，使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue试剂盒，从鱼血清和均质化的鱼组织样品分离DNA。

如下处理样品：

对于血清：将50µl血清加入在1.5 mL Eppendorf试管中的20µl蛋白水解酶K(Qiagen DNeasy Blood&Tissue试剂盒蛋白水解酶K“600 mAU/ml溶液(或40 mAU/mg蛋白)”)，并混合均匀。向该混合物中，加入150µl磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)并混合均匀。向该混合物中，加入20µl RNA酶A (20 mg/mL)，混合均匀，并在室温温育2分钟。此后，遵循生产商的说明书。

对于匀浆化的组织样品：将50µl组织匀浆物加入在1.5 mL Eppendorf试管中的20µl蛋白水解酶K，并混合均匀。向该混合物中，加入130µl的ATL溶液(Qiagen)，混合均匀，并在室温温育60分钟。向该混合物中，加入20µl RNA酶A (20 mg/mL)，混合均匀，并在室温温育2分钟。此后，遵循生产商的说明书。

使用VIDISCA-454和PCR检测病毒以及使用qPCR定量病毒负载

使用VIDISCA-454病毒发现技术(De Vries等人(2011) PLoS ONE 6(1):e16118)，分析实验1的血清样品，其衍生自具有和没有鳞片脱落疾病征状的亚洲海鲈。得到疑似源自新鱼病原体的多个序列。使用这些序列衍生出用于常规PCR和qPCR的PCR引物(参见表1)。所述新序列的测序（Blasting）揭示，在遭受鳞片脱落疾病的鱼中检测到的病原体与虹彩病毒科的病毒具有某种程度的相似性。

使用对SDD病毒特异性的引物在提取自心脏、脾、肾和血清样品的DNA上进行PCR，所述样品收集自具有和没有鳞片脱落疾病征状的鱼(实验1)。另外，使用对虹彩病毒科的另一个成员真鲷虹彩病毒特异性的引物集合(表1和SEQ ID NO: 12和13)进行PCR。使用标准方法进行PCR，退火温度对于SDD病毒引物集合而言为50℃，对于真鲷虹彩病毒引物集合而言为57℃。在琼脂糖凝胶上泳动PCR样品。将PCR产物从琼脂糖切离，使用QIAquick GelExtraction Kit (Qiagen)纯化，并测序。

如在图1中所见，排它地在得自具有鳞片脱落疾病的鱼的、含有DNA的样品中产生了SDD病毒PCR产物。在仅一个得自患病动物的血清样品(鳞片脱落血清3)中，不可扩增SDD病毒DNA。衍生自健康动物的样品都没有产生PCR产物。这些PCR产物的测序证实，它们源自SDD病毒。使用针对SDD病毒的引物集合，没有产生真鲷虹彩病毒的PCR产物(图1)。此外，真鲷虹彩病毒引物集合没有显示与SDD病毒的交叉反应性(图2)。

另外，为SDD病毒qPCR设计了探针(表1和SEQ ID NO: 11)。应用标准方法和与SDD病毒引物集合联合地使用探针，在50℃的退火温度进行qPCR。使用Bio-Rad CFX Manager2.0软件分析数据。在pCR4-TOPO (Invitrogen)中克隆的SDD病毒PCR产物的稀释系列的一式两份测量充当标准曲线。样品的阳性或阴性分类以及每个样品中SDD病毒基因组材料的原始量的确定是基于相对于标准曲线的阈值循环。该qPCR的检测下限是大约10²个拷贝/µl(图3)。如在表2中所示，qPCR结果与PCR结果完全对应(参见列“结果PCR”和列“结果Q-PCR”)。

类似地，使用qPCR确定血清样品中的SDD病毒基因组拷贝的起始量，所述血清样品衍生自没有鳞片脱落征状、具有早期和晚期阶段鳞片脱落征状的鱼(实验2) (表3)。除了鱼8以外，所有得自具有早期和晚期阶段疾病的鱼的血清样品是阳性的，而所有得自具有健康外观的鱼的样品是阴性的。

另外，通过qPCR分析了得自实验3的血清样品。在20个从遭受鳞片脱落疾病的鱼衍生出的血清样品中的17个中，检测到病毒基因组序列。从健康鱼收集的血清样品都不是SDD病毒阳性的。

总之，分析了40个从具有鳞片脱落疾病的轻度至重度征状的鱼收集的血清和组织样品。在这些样品中的35个中检测到SDD病毒基因组序列。形成鲜明对比的是，在14个得自健康动物的样品中没有检测到病毒。

在MSD AH建立的Bluegill fry (BF-2)细胞系的细胞培养

细胞系BF-2最初衍生自胰蛋白酶处理的1岁小鱼的躯干的合并尾部区域的混悬液(Bluegill fry,Lepomis macrochirus, 参见Science 1966; 151:1004, J Virol 1968;2:393, J Infect Dis 1968; 11:253, In Vitro Cell Dev.Biol 1992; 28A:385。该细胞系通过ATCC和ECACC商购得到，但是将用于下述实验的系在MSD AH培养+70代。

BF-2细胞培养基由899 ml补充了2 mM L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠、100 mlFCS (10%)和1 mL新霉素多粘菌素抗生素溶液1000倍原液的E-MEM组成。在保湿培养箱中在28℃和5%CO₂下常规地培养细胞。

在培养开始之前，将培养基保持在4℃。使用1安瓿的冷冻原液BF-2开始培养。将来自液氮的细胞在20-28℃水中快速融化。将细胞混悬液移入15 mL试管中，并用7 mL培养基缓慢地稀释。随后，计数细胞。将混悬液用培养基进一步稀释，直到DMSO被稀释至少50倍。随后，将混悬液分配至适当的培养瓶或滚瓶，并在28℃和5%CO₂中温育。6-24小时或细胞完全附着以后，将培养基更新以除去剩余的DMSO (冷冻培养基由80%培养基和20%DMSO组成)。将细胞进一步温育3-7天或直到达到汇合。对于滚瓶，需要0.2-0.5 rpm的滚子速度。定期在倒置显微镜下检查细胞。

一旦达到汇合，将细胞传代。可以每3-4天进行传代，最初接种密度为2.0 x 10⁴个细胞/cm²。可选地，通过在达到4.0 x 10⁴个细胞/cm²的较高密度接种细胞，可以得到更短的传代间隔。将用于细胞传代的试剂(培养基, PBS, 胰蛋白酶/EDTA)预温热至28℃。抛弃培养基，并将汇合的单层用适当体积(对于T25，3 mL)的PBS洗涤1次。随后抛弃PBS，并将细胞在相同体积的补充了1%(vol/vol)的2.5%胰蛋白酶溶液和1%(vol/vol)的2%EDTA溶液的PBS中在28℃温育15分钟。加入相同体积的新鲜培养基，并将细胞再悬浮和计数。在期望的细胞密度以对于培养瓶或滚瓶而言适当的培养体积装配新烧瓶。

为了冷冻细胞，在操作之前将培养基和冷冻培养基(80%(vol/vol)培养基+ 20%(vol/vol) DMSO)保持在4℃。如上所述处理汇合的细胞培养物，直到且包括胰蛋白酶消化。将细胞再悬浮，计数，进一步再悬浮于合适量的培养基中，并在搅拌混悬液的同时逐滴加入相等体积的2倍冷冻培养基。将用于液氮贮存的安瓿用5 x 10⁶个细胞/安瓿（以开始T175）或用7.5 x 10⁵个细胞/安瓿（以开始T25）填充。

给BF-2细胞接种SDD病毒

在建立接种实验之前，将从液氮贮存物培养的细胞传代至少1次。将细胞传代并培养24小时，然后在T25培养瓶中以5.0 x 10⁴个细胞/cm²接种。接种物由得自被SDD影响的动物的血清在培养基中的1:10稀释物组成(将实验2的鱼4-7的合并血清样品用于建立病毒培养物)。从烧瓶除去培养基。随后在28℃/5%CO₂给烧瓶接种0.5 ml接种物/T25保持最小30min。

同样可能给细胞接种SDD病毒的先前传代物（在培养基中稀释的细胞中）的冻融收获物。

随后，除去接种物(尽管这不是绝对必要条件)，加入新鲜培养基，并将细胞培养多达10天或直到使用倒置光学显微镜观察到完全CPE。通过1-3个冻融循环(-70℃至4℃)收获病毒，并随后通过在4℃在1000 x g离心5分钟从细胞碎片澄清收获物。可以用qPCR分析和/或收获物的滴定证实病毒的复制。使用DNA测序技术来证实病毒的身份。

使用生产商的说明书，使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue试剂盒，从组织培养基和冻融的细胞收获物分离用于qPCR的DNA。

对于培养基收获物：将200µl培养基收获物加入在1.5 mL Eppendorf试管中的20µl蛋白水解酶K，并混合均匀。向该混合物中，加入20µl RNA酶A (20 mg/mL)，混合均匀，并在室温温育2分钟。此后，遵循生产商的说明书。

对于细胞裂解物：将50µl细胞裂解物加入在1.5 mL Eppendorf试管中的20µl蛋白水解酶K，并混合均匀。向该混合物中，加入130µl的ATL溶液(Qiagen)，混合均匀，并在室温温育60分钟。向该混合物中，加入20µl RNA酶A (20 mg/mL)，混合均匀，并在室温温育2分钟。此后，遵循生产商的说明书。

没有病毒能够从不具有鳞片脱落疾病征状的鱼衍生出的血清样品培养。

SDD病毒的灭活

通过加入10倍预稀释的福尔马林(将1份福尔马林加入9份H₂O中)，将病毒收获物灭活。福尔马林的1000倍最终体积稀释对于SDD病毒灭活而言是有效的，所以将1体积的10倍预稀释的福尔马林加入99体积的收获物(最终甲醛含量0.037%)中。将容器的内容物在4℃轻轻搅拌。加入福尔马林和搅拌以后，直接将整个混合物转移至新容器以确保所有病毒已经与福尔马林接触。将容器的内容物连续地、但是轻轻地搅拌3天，随后在没有搅拌下温育11天。在14天的整个灭活阶段中，将混合物保持在4℃。

灭活病毒的浓缩

应用横向流过滤以得到浓缩的灭活病毒。使用GE Healthcare Filter 56-4100-92, UFP-100-E-H22LA, 38cm2, 100.000 NMWC，浓缩灭活的病毒。将过滤器用超纯水洗涤，并用2%(vol/vol)的福尔马林水溶液灭菌。随后，将过滤器用PBS冲洗，并用EMEM培养基冲洗。将灭活病毒批料加入过滤器并浓缩至原始体积的1/10。

在BF-2细胞上滴定SDD病毒

如上所述培养BF-2细胞。在测试前1天，制备BF-2细胞混悬液，其含有在冷的(2-8℃)培养基中的3 x 10⁴个细胞/ml。给微孔滴定板的96个孔接种100µl/孔的该细胞混悬液。将板在湿气氛中在28℃/5%CO₂温育24小时。该温育时段以后，单层应当是大约30-50%汇合的。

在测试当天，如下制备每个病毒样品的10倍系列稀释物直到10^-8：将0.5 ml样品转移至含有4.5 ml冷的(0-20℃)滴定培养基(不含FBS的培养基)的试管，混合，并将0.5 ml转移至下一个含有4.5 ml滴定培养基的试管中，随后进行小心的混合、转移等。第1和12列以及第A和H行充当阴性对照，并接种100µl/孔的新鲜滴定培养基。给微孔滴定板接种100µl/孔的病毒稀释液，将10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10⁷、10^-8接种在第B至G行(10孔/稀释度)。在操作过程中，将病毒稀释液的温度保持在0℃至20℃之间。将板在28℃/5%CO₂温育7天。7天病毒温育时段以后，用倒置光学显微镜针对SDD病毒特异性的CPE筛选板。SDD病毒特异性的CPE的特征在于单层中的细胞的聚集，继之以细胞脱离。在图4中可以清楚地看到这种细胞聚集之后脱离的现象。图5显示了未感染的对照细胞的单层。BF-2单层中的孔被圆形细胞包围。将显示SDD病毒特异性的CPE的每个孔评分为阳性的。根据Reed和Muench, Am. J.Epidemiol. (1938) 27(3): 493-497描述的方法和计算，确定TCID₅₀。分离自滴定测定中的阳性孔的DNA样品的qPCR分析证实了病毒的存在。

SDD病毒主要衣壳蛋白和ATP酶的序列和系统发生分析

图6和7分别显示了SDD病毒主要衣壳蛋白(MCP)和ATP酶的全长DNA和蛋白序列。

使用SDD病毒MCP和ATP酶DNA序列建立系统树(图8和9)。使用邻接法和应用标准设置，用MEGA5软件建立树。在比对中仅包括编码连续ORF的DNA序列。进行自举分析(2000个副本)，并在节点处指定自举支持百分比。距离条指示每个位点的核苷酸置换的数目。

将SDD病毒MCP DNA序列与在Kurita和Nakajima (Viruses 2012, 4:521-538)所述的系统发生分析中包括的虹彩病毒MCP DNA序列比对。如在图8中所示，可以将SDD病毒视作虹彩病毒科内的单个属的单个成员。SDD病毒MCP序列与Megalocytivirus属的成员的MCP序列最密切相关。但是，与最密切相关的MCP序列(真鲷虹彩病毒MCP ORF)相比，配对距离(已经被置换的位点的比例)仍然是49%(blast对比揭示与RSIV MCP的65%同源性，与49%“配对距离”的差异主要是由于修复置换诸如从例如核苷酸A至G的突变以及回复至A的第二个突变)。

图9描绘了编码SDD病毒ATP酶的DNA序列的系统发生分析。证实了与在该分析中包括的其它虹彩病毒ATP酶序列相比，SDD病毒ATP酶序列是一个遥远的离群值。

表1: 用于SDD病毒和RSIV PCR的引物序列

引物:	序列(5’-3’):
		SDD-50-FW	CAG TGC ATT ACA AGA AAG
SDD-143-探针	6FAM-ATG CCG TCA TTG TAA CAC TG-BHQ1
		SDD-213-REV	GCT GAA ACA ACA ATT TAG
IRIDO-FW-5	CGT GAG ACC GTG CGT AGT
		IDIDO-REV-5	AGG GTG ACG GTC GAT ATG
SDD-ATP酶-65-FW	TCGGAGGGATGAAATTGG
		SDD-ATP酶-618-REV	AGCGTTGTCGATGTAGAG
SDD-MCP-277-FW	TCC TGT GCA GCT GTC TAA AC
		SDD-MCP-1090-REV	ACT GGC AAT GAT GGG CGA TG

表2: SDD病毒qPCR和PCR结果(实验1).

样品	阈值循环(Cq)	起始量(拷贝/ μl)	结果Q-PCR	结果PCR
					鳞片脱落脾1	25.55	3.06E+04	POS	POS
鳞片脱落脾2	22.50	2.91E+05	POS	POS
					健康脾1	N/A	N/A	NEG	NEG
健康脾2	N/A	N/A	NEG	NEG
					鳞片脱落血清1	23.97	9.81E+04	POS	POS
鳞片脱落血清2	22.95	2.09E+05	POS	POS
					鳞片脱落血清3	N/A	N/A	NEG	NEG
鳞片脱落血清4	27.12	9.57E+03	POS	POS
					健康的血清1	N/A	N/A	NEG	NEG
健康的血清2	N/A	N/A	NEG	NEG
					鳞片脱落心脏	23.42	1.47E+05	POS	POS
鳞片脱落肾1	23.26	1.65E+05	POS	POS
					鳞片脱落肾2	23.81	1.11E+05	POS	POS
鳞片脱落肾3	21.60	5.65E+05	POS	POS
					健康肾1	N/A	N/A	NEG	NEG
健康肾2	N/A	N/A	NEG	NEG
					健康肾3	N/A	N/A	NEG	NEG
健康肾4	N/A	N/A	NEG	NEG

N/A: 不可检测

POS: 阳性的

NEG: 阴性的

^。

表6: 在疑似受SDD病毒影响的鱼和对照鱼中的SDD病毒qPCR和PCR结果(实验2)

鱼	NC/早期/晚期	起始量(拷贝/ μl)	结果q-PCR
				鱼1	NC	N/A	NEG
鱼2	NC	N/A	NEG
				鱼3	NC	N/A	NEG
鱼4	早期	1,50E+04	POS
				鱼5	早期	5,13E+04	POS
鱼6	早期	7,53E+04	POS
				鱼7	早期	1,23E+05	POS
鱼8	早期	N/A	NEG
				鱼9	晚期	9,08E+04	POS
鱼10	晚期	6,45E+02	POS
				鱼11	晚期	2,01E+04	POS
鱼12	晚期	1,27E+04	POS
				鱼13	晚期	4,83E+04	POS

NC: 阴性对照

N/A: 不可检测

POS: 阳性的

NEG: 阴性的。

实施例2：在鱼中的SDD病毒攻击实验

实验性方案简要：

(使用的缩写：IM：肌肉内，IP：腹膜内，ppt：每千份)

用细胞培养物繁殖的SDD病毒进行该实验。在该研究中使用四百六十(460)只亚洲海鲈(20 g)。

如下攻击九十五(95)条鱼：1)高剂量腹膜内(IP)注射，2)低剂量IP注射，3)低剂量肌肉内(IM)注射，和4)高剂量IP和低剂量IM注射的组合。为了样品对比目的，将另外80条未攻击的鱼保持为阴性对照。

在时间点攻击后第1、3、7、10和14天，收获十五(15)条鱼，每条来自5个组。观察剩余的15条鱼直到第28天，以评价来自每种攻击方法的死亡率。

在每个取样时间点，将收获的鱼的肾单个地取样，并按组将血清合并。检查样品用于病毒定量，以限定鱼血清或肾中的最高病毒滴度的时间段。

攻击材料

使用细胞培养物繁殖的SDD病毒作为攻击材料。所述病毒最初分离自印度尼西亚的亚洲海鲈并在体外繁殖。使用在实施例1中描述的滴定方法确定病毒滴度。

攻击材料稀释剂

标准疫苗稀释缓冲液：PBS + 1.5%NaCl用作攻击材料稀释剂。

动物

物种 : 亚洲海鲈(Lates calcarifer)

到达时的平均重量 : 大约2克/鱼(平均)

在实验开始时的平均重量 : 20 g

鱼的数目 : 共460条鱼。

养殖

水: 攻击后28℃±2℃的海水(30 ppt)

饲料: 从攻击后当天开始随意饲喂鱼。

罐: 将鱼圈养在4个250L罐中。在每个罐中安装垂直网，以建立在罐的1/3处的分隔。罐的该1/3分隔保持15条用于死亡率观察的鱼。其它2/3罐保持80条用于时程收获的鱼(参见表3)。将未攻击的对照鱼圈养在500L罐的一半中。将对照鱼的罐的水温度与攻击鱼的罐对齐。

分组和给药：

动物的分配

该实验需要共计460条海鲈。在它们到手时，随机地挑选在期望大小(20 g)内的鱼。

攻击：

鱼准备和鱼体重测量

在攻击之前将鱼饥饿至少36小时。在攻击之前，将20条来自每组的鱼一起称重以得到每组的平均体重。

表3. 观察罐

*¹高剂量= 0.1ml/鱼的未稀释的SDD病毒。

*²低剂量= 0.1ml/鱼的10倍稀释的SDD病毒。

*³在每个时间段从隔离罐取鱼。

IP攻击(高剂量和低剂量)

在攻击操作之前，使用AQUI-S将所有鱼麻醉。给鱼在腹侧IP注射0.1 ml攻击材料。应用两种不同的攻击条件：1)未稀释的攻击材料(高剂量：5.5 x 10⁶TCID50/鱼)，和2)SVDB材料的10倍稀释的攻击物(低剂量: 5.5 x 10⁵TCID50/鱼)。在攻击以后，立即将鱼转移回它们的分配罐进行恢复。每次处理的细节如下(也参见表3)。

IM攻击(低剂量)

用于IM攻击的材料是SVDB的10倍稀释物(低剂量: 5.5 x 10⁵TCID50/鱼)，并将0.1ml攻击材料肌肉内地注射进每条鱼中。在IM攻击之前，使用AQUI-S将所有鱼麻醉。

IP攻击(高剂量) + IM攻击(低剂量)

通过首先的IP (高剂量)攻击和随后的IM (低剂量)攻击，进行组合攻击。两次注射以后，将鱼圈养在它们的分配罐从麻醉恢复。

取样

在攻击后第1、3、7、10和14天，从5个鱼组收集至多15条鱼(表4、5)。首先将所有收获的鱼放血。此后，将得自每条鱼的肾组织个别地取样进无菌试管中。

表4. 取样时间计划

表5. 取样计划和样品试管ID

用AQUI-S将所有鱼麻醉，并通过尾静脉穿刺收集血液。将得自相同鱼组的血液汇集在1个试管中并允许在室温凝结。在同一天或次日加工血液以分离血清。通过将血液在3,700 rpm离心20分钟，分离血清。将得到的血清转移至无菌试管并在<-50℃储存。

观察和死后检查

在攻击后5天的过程中或之内，没有发生死亡。

在攻击后每天记录在观察罐3F01B、3F02A、3F03B和3F04A (15条鱼/每半罐)中的鱼死亡率。观察死亡率28天。

在攻击的鱼中观察到鳞片脱落疾病的特征性征状，包括鳍腐蚀和鳞片脱落。此外，在接受高攻击剂量的鱼组(IP (高)或IP (高) + IM (低))中，从攻击后5天观察到死亡。接受IP低剂量或IM低剂量攻击的动物表现出死亡发生的稍微延迟。在不同的组中，死亡率累计为60%(IP (高))、47%(IP(高) + IM (低))、20%(IP (低))和13%(IM (低))。在未攻击的对照鱼中没有观察到死亡(图10)。

关于SDD病毒DNA序列的存在，通过qPCR分析汇集的血清样品（在攻击后1、3、7、10和14天从每组的15条动物收集）。如在图11中所示，除了未攻击的对照组以外，在所有组中检测到SDD病毒DNA。从攻击后10天开始，病毒DNA拷贝的量增加、达到峰值和下降。在第10天在从接受高攻击剂量(IP (高)或IP (高) + IM (低))的组收集的血清中检测到最高病毒DNA水平。在这些组中也观察到最高死亡率水平(分别是60%和47%)。

最后，使用阳性鱼的血清接种BF2细胞。观察到CPE，并且qPCR证实SDD病毒DNA的存在，其证实SDD病毒是造成鳞片脱落疾病的病原体。

因而可以得出以下结论：

Koch的第一个假定声称，所述微生物必须在受该疾病影响的动物中检测到，但是不应当在健康动物中发现。该假定对于SDDV而言是实现的，因为VIDISCA-454和qPCR仅在SDS影响的鱼中检测到SDDV DNA。此外，没有在PCR中检测到肿大细胞病毒 RSIV的DNA。

还实现了第二个假定，其声称微生物/病毒必须从患病的生物体分离并在细胞系上培养(优选地)。在给BF-2细胞系接种SDDV-阳性的血清以后，观察到细胞致病效应。病毒滴度随时间增加，表明病毒在这些细胞上复制。随后的VIDISCA-454和qPCR分析证实，复制的病毒确实是SDDV。当滴定、差速离心和冷冻-透射电子显微术证实传染性病毒颗粒的存在时，完成分离。SDDV-阴性的血清在BF-2细胞上的3次传代保持没有CPE，这证实，所述病毒确实不存在于健康动物中。所述病毒可以从细胞培养物收获和纯化。

当发明人证实在尖吻鲈感染以后培养的SDDV病毒诱导死亡以及SDD的主要征状（鳞片脱落）时，实现了Koch的第三个假定。应当指出，在5个不同天从15条鱼收集的样品可以产生这样的测量的DNA量：其为整体群体的DNA含量的低估值。这可能是因为死鱼没有被包括在该取样中，而这些可争辩地是最受影响的鱼且因而可能具有最高病毒滴度。

最后，在BF-2细胞上重新分离得自血清样品的SDDV，实现了Koch的最后一个假定，所述血清样品得自其中该病毒已经诱导SDD的鱼。

发明人认为，SDDV的检测和分离特别成功，因为用于培养病原体的细胞的非常特异性选择、血清替代患病组织作为病原体来源的选择(相对应于现有技术)、在从病鱼血清分离病毒的步骤中避免使用0.22微米过滤器的选择(相对应于现有技术)和在疾病的非常早期阶段的鱼作为病原体来源的选择。

序列表

<110> Intervet International B.V.

<120> 鳞片脱落疾病(SDD)致病病毒及其衍生物

<130> 23503

<160> 13

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1359)

<400> 1

atg tca tct att gca gga gct aat gtt acc agt ggg ttt atc gac ttg 48

Met Ser Ser Ile Ala Gly Ala Asn Val Thr Ser Gly Phe Ile Asp Leu

1 5 10 15

gct gcc tac gat gcc atg gag act cat ctc tac ggt ggc gat aat tca 96

Ala Ala Tyr Asp Ala Met Glu Thr His Leu Tyr Gly Gly Asp Asn Ser

20 25 30

atc acc tac ttc ttg cgt gaa act aca cga tct tct tgg ttc agt aaa 144

Ile Thr Tyr Phe Leu Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ser Trp Phe Ser Lys

35 40 45

ctt cct gtg cag ctg tct aaa caa aca gga act gca aat ttc gga caa 192

Leu Pro Val Gln Leu Ser Lys Gln Thr Gly Thr Ala Asn Phe Gly Gln

50 55 60

gaa ttt agc gtg gtt gtg gcc aga gga ggt gac tat ctt atg aat gtt 240

Glu Phe Ser Val Val Val Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Leu Met Asn Val

65 70 75 80

tgg ctt cgc gtt aaa gtt cca gcc ctc aaa aat act aaa gca aat tca 288

Trp Leu Arg Val Lys Val Pro Ala Leu Lys Asn Thr Lys Ala Asn Ser

85 90 95

agc ata aga tgg acc gac aat ttt atg cac aat ctc gtt caa gaa gtt 336

Ser Ile Arg Trp Thr Asp Asn Phe Met His Asn Leu Val Gln Glu Val

100 105 110

aca atc tca ttt aac gat ctc act gca cag act att act agt gag ttt 384

Thr Ile Ser Phe Asn Asp Leu Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ser Glu Phe

115 120 125

ctt gat ttt tgg tca aca tgt aac gtt ccc ggt gga aag tcg tca gga 432

Leu Asp Phe Trp Ser Thr Cys Asn Val Pro Gly Gly Lys Ser Ser Gly

130 135 140

tat gct aat atg ata gga tac act cat gac ttg gtt gga ggt act gtg 480

Tyr Ala Asn Met Ile Gly Tyr Thr His Asp Leu Val Gly Gly Thr Val

145 150 155 160

caa aat gca act atg cca tct aag tat ctc aat ctg cca att ccg ttc 528

Gln Asn Ala Thr Met Pro Ser Lys Tyr Leu Asn Leu Pro Ile Pro Phe

165 170 175

ttc ttt act cgt gat act gga ctt gct ctt cct act gca gca cta cct 576

Phe Phe Thr Arg Asp Thr Gly Leu Ala Leu Pro Thr Ala Ala Leu Pro

180 185 190

tac aat gaa att aaa att cat ttt aaa ttg aga gat tgg aag gat ttg 624

Tyr Asn Glu Ile Lys Ile His Phe Lys Leu Arg Asp Trp Lys Asp Leu

195 200 205

ctc att tct caa agc act aat gat aat gca att tct gta cct tta aca 672

Leu Ile Ser Gln Ser Thr Asn Asp Asn Ala Ile Ser Val Pro Leu Thr

210 215 220

agt gac atg gaa aac gtg aca ccc gct ctg act gaa gtt agt gtt atg 720

Ser Asp Met Glu Asn Val Thr Pro Ala Leu Thr Glu Val Ser Val Met

225 230 235 240

ggt act tat gct atc ctg acc aac gaa gag cgt gaa gca atg tct ctt 768

Gly Thr Tyr Ala Ile Leu Thr Asn Glu Glu Arg Glu Ala Met Ser Leu

245 250 255

gtc agt aga gat atg att att gaa cag tgt cag atg gca cct aga att 816

Val Ser Arg Asp Met Ile Ile Glu Gln Cys Gln Met Ala Pro Arg Ile

260 265 270

cct atc aga ccc ttg gaa aat gag atg ccc cat att gat ctg cga ttt 864

Pro Ile Arg Pro Leu Glu Asn Glu Met Pro His Ile Asp Leu Arg Phe

275 280 285

agt cat ccc att aaa gag ctc ttc ttt gct gtt aaa aat gta act cat 912

Ser His Pro Ile Lys Glu Leu Phe Phe Ala Val Lys Asn Val Thr His

290 295 300

cca aat att cac agt aat tat aca gct gca tcg ccc atc att gcc agt 960

Pro Asn Ile His Ser Asn Tyr Thr Ala Ala Ser Pro Ile Ile Ala Ser

305 310 315 320

ggt aca aac aaa gtt aca atg cct cca aaa gct caa aac cca ttg tca 1008

Gly Thr Asn Lys Val Thr Met Pro Pro Lys Ala Gln Asn Pro Leu Ser

325 330 335

cac gtg tca ctc att tat gaa aac aca gca cga ttg aac aat atg ggt 1056

His Val Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Thr Ala Arg Leu Asn Asn Met Gly

340 345 350

gtt gac tac ttt tcg tat gtt gat cca tac ttc ttt gca cca tgc att 1104

Val Asp Tyr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Tyr Phe Phe Ala Pro Cys Ile

355 360 365

cct aaa atc gat ggg gtc atg gct tat tgt tat acc atg aac atg ggt 1152

Pro Lys Ile Asp Gly Val Met Ala Tyr Cys Tyr Thr Met Asn Met Gly

370 375 380

cat gtc gat cct atg ggt tct aca aat ttc ggc cgg ttg tca aat att 1200

His Val Asp Pro Met Gly Ser Thr Asn Phe Gly Arg Leu Ser Asn Ile

385 390 395 400

acg ctg tct gca aag gtt acc gca aat tca aaa aca acc tca gct gct 1248

Thr Leu Ser Ala Lys Val Thr Ala Asn Ser Lys Thr Thr Ser Ala Ala

405 410 415

agc ggt aac aca gat gga cat aaa gtt gct caa aag ttt gaa ctg gtt 1296

Ser Gly Asn Thr Asp Gly His Lys Val Ala Gln Lys Phe Glu Leu Val

420 425 430

gta att ggt gtt aat cat aat gtt gca cgt atc agc aat ggt tca ttt 1344

Val Ile Gly Val Asn His Asn Val Ala Arg Ile Ser Asn Gly Ser Phe

435 440 445

gga ttt ccg atc ttg taa 1362

Gly Phe Pro Ile Leu

450

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 2

Met Ser Ser Ile Ala Gly Ala Asn Val Thr Ser Gly Phe Ile Asp Leu

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Asp Ala Met Glu Thr His Leu Tyr Gly Gly Asp Asn Ser

20 25 30

Ile Thr Tyr Phe Leu Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ser Trp Phe Ser Lys

35 40 45

Leu Pro Val Gln Leu Ser Lys Gln Thr Gly Thr Ala Asn Phe Gly Gln

50 55 60

Glu Phe Ser Val Val Val Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Leu Met Asn Val

65 70 75 80

Trp Leu Arg Val Lys Val Pro Ala Leu Lys Asn Thr Lys Ala Asn Ser

85 90 95

Ser Ile Arg Trp Thr Asp Asn Phe Met His Asn Leu Val Gln Glu Val

100 105 110

Thr Ile Ser Phe Asn Asp Leu Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ser Glu Phe

115 120 125

Leu Asp Phe Trp Ser Thr Cys Asn Val Pro Gly Gly Lys Ser Ser Gly

130 135 140

Tyr Ala Asn Met Ile Gly Tyr Thr His Asp Leu Val Gly Gly Thr Val

145 150 155 160

Gln Asn Ala Thr Met Pro Ser Lys Tyr Leu Asn Leu Pro Ile Pro Phe

165 170 175

Phe Phe Thr Arg Asp Thr Gly Leu Ala Leu Pro Thr Ala Ala Leu Pro

180 185 190

Tyr Asn Glu Ile Lys Ile His Phe Lys Leu Arg Asp Trp Lys Asp Leu

195 200 205

Leu Ile Ser Gln Ser Thr Asn Asp Asn Ala Ile Ser Val Pro Leu Thr

210 215 220

Ser Asp Met Glu Asn Val Thr Pro Ala Leu Thr Glu Val Ser Val Met

225 230 235 240

Gly Thr Tyr Ala Ile Leu Thr Asn Glu Glu Arg Glu Ala Met Ser Leu

245 250 255

Val Ser Arg Asp Met Ile Ile Glu Gln Cys Gln Met Ala Pro Arg Ile

260 265 270

Pro Ile Arg Pro Leu Glu Asn Glu Met Pro His Ile Asp Leu Arg Phe

275 280 285

Ser His Pro Ile Lys Glu Leu Phe Phe Ala Val Lys Asn Val Thr His

290 295 300

Pro Asn Ile His Ser Asn Tyr Thr Ala Ala Ser Pro Ile Ile Ala Ser

305 310 315 320

Gly Thr Asn Lys Val Thr Met Pro Pro Lys Ala Gln Asn Pro Leu Ser

325 330 335

His Val Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Thr Ala Arg Leu Asn Asn Met Gly

340 345 350

Val Asp Tyr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Tyr Phe Phe Ala Pro Cys Ile

355 360 365

Pro Lys Ile Asp Gly Val Met Ala Tyr Cys Tyr Thr Met Asn Met Gly

370 375 380

His Val Asp Pro Met Gly Ser Thr Asn Phe Gly Arg Leu Ser Asn Ile

385 390 395 400

Thr Leu Ser Ala Lys Val Thr Ala Asn Ser Lys Thr Thr Ser Ala Ala

405 410 415

Ser Gly Asn Thr Asp Gly His Lys Val Ala Gln Lys Phe Glu Leu Val

420 425 430

Val Ile Gly Val Asn His Asn Val Ala Arg Ile Ser Asn Gly Ser Phe

435 440 445

Gly Phe Pro Ile Leu

450

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(735)

<400> 3

atg tct gtt cct gtg aag gaa ttg tca atg acc gaa ata cga ccg aga 48

Met Ser Val Pro Val Lys Glu Leu Ser Met Thr Glu Ile Arg Pro Arg

1 5 10 15

aca cac gac gat gaa atc gga ggg atg aaa ttg gtt gtt ttg ggc aaa 96

Thr His Asp Asp Glu Ile Gly Gly Met Lys Leu Val Val Leu Gly Lys

20 25 30

ccg ggc cgt gga aaa tcg gtc ttg ata aaa tcg ata ata gca tca aaa 144

Pro Gly Arg Gly Lys Ser Val Leu Ile Lys Ser Ile Ile Ala Ser Lys

35 40 45

cga cat ttg atc ccc gca gcg gtt gtc att tct ggt tca gaa gaa gcc 192

Arg His Leu Ile Pro Ala Ala Val Val Ile Ser Gly Ser Glu Glu Ala

50 55 60

aat cat ttc tat tct ggg tta gtt cca gaa tgt tac att tat tcc aaa 240

Asn His Phe Tyr Ser Gly Leu Val Pro Glu Cys Tyr Ile Tyr Ser Lys

65 70 75 80

ttt gac ccc gat att att acc aga gtc aag aaa cga caa cta gaa tta 288

Phe Asp Pro Asp Ile Ile Thr Arg Val Lys Lys Arg Gln Leu Glu Leu

85 90 95

aaa cat cta gat cct aaa cat tct tgg ctc tta ttg gtc atc gat gat 336

Lys His Leu Asp Pro Lys His Ser Trp Leu Leu Leu Val Ile Asp Asp

100 105 110

tgc atg gac aac acc aaa ttg ttt aat aat gaa gta gtt gct gat ttg 384

Cys Met Asp Asn Thr Lys Leu Phe Asn Asn Glu Val Val Ala Asp Leu

115 120 125

ttt aaa aac ggt aga cat tgg aac ttg ttg gtc att att gct agt cag 432

Phe Lys Asn Gly Arg His Trp Asn Leu Leu Val Ile Ile Ala Ser Gln

130 135 140

tac att atg gat tta aaa gcc gat tta aga tgt tca ata gat ggt gta 480

Tyr Ile Met Asp Leu Lys Ala Asp Leu Arg Cys Ser Ile Asp Gly Val

145 150 155 160

ttt ctc ttt agc gaa tct aat ttg act agt caa gag aaa ata tac aaa 528

Phe Leu Phe Ser Glu Ser Asn Leu Thr Ser Gln Glu Lys Ile Tyr Lys

165 170 175

cag ttt gga ggt aaa att cca aag cct caa ttt atg cta ctt atg gag 576

Gln Phe Gly Gly Lys Ile Pro Lys Pro Gln Phe Met Leu Leu Met Glu

180 185 190

aaa gtg aca ttg gat tac act tgt ctc tac atc gac aac gct agc caa 624

Lys Val Thr Leu Asp Tyr Thr Cys Leu Tyr Ile Asp Asn Ala Ser Gln

195 200 205

acg cag cac tgg acc gaa tgc gtt cga tat tac aag gca cct atg tta 672

Thr Gln His Trp Thr Glu Cys Val Arg Tyr Tyr Lys Ala Pro Met Leu

210 215 220

aca aac gag gat gtc aat ttt ggt ttt gca gat tat aaa aac agc gca 720

Thr Asn Glu Asp Val Asn Phe Gly Phe Ala Asp Tyr Lys Asn Ser Ala

225 230 235 240

att gct gtt gtt gaa taa 738

Ile Ala Val Val Glu

245

<210> 4

<211> 245

<212> PRT

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 4

Met Ser Val Pro Val Lys Glu Leu Ser Met Thr Glu Ile Arg Pro Arg

1 5 10 15

Thr His Asp Asp Glu Ile Gly Gly Met Lys Leu Val Val Leu Gly Lys

20 25 30

Pro Gly Arg Gly Lys Ser Val Leu Ile Lys Ser Ile Ile Ala Ser Lys

35 40 45

Arg His Leu Ile Pro Ala Ala Val Val Ile Ser Gly Ser Glu Glu Ala

50 55 60

Asn His Phe Tyr Ser Gly Leu Val Pro Glu Cys Tyr Ile Tyr Ser Lys

65 70 75 80

Phe Asp Pro Asp Ile Ile Thr Arg Val Lys Lys Arg Gln Leu Glu Leu

85 90 95

Lys His Leu Asp Pro Lys His Ser Trp Leu Leu Leu Val Ile Asp Asp

100 105 110

Cys Met Asp Asn Thr Lys Leu Phe Asn Asn Glu Val Val Ala Asp Leu

115 120 125

Phe Lys Asn Gly Arg His Trp Asn Leu Leu Val Ile Ile Ala Ser Gln

130 135 140

Tyr Ile Met Asp Leu Lys Ala Asp Leu Arg Cys Ser Ile Asp Gly Val

145 150 155 160

Phe Leu Phe Ser Glu Ser Asn Leu Thr Ser Gln Glu Lys Ile Tyr Lys

165 170 175

Gln Phe Gly Gly Lys Ile Pro Lys Pro Gln Phe Met Leu Leu Met Glu

180 185 190

Lys Val Thr Leu Asp Tyr Thr Cys Leu Tyr Ile Asp Asn Ala Ser Gln

195 200 205

Thr Gln His Trp Thr Glu Cys Val Arg Tyr Tyr Lys Ala Pro Met Leu

210 215 220

Thr Asn Glu Asp Val Asn Phe Gly Phe Ala Asp Tyr Lys Asn Ser Ala

225 230 235 240

Ile Ala Val Val Glu

245

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 5

cagtgcatta caagaaag 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 6

gctgaaacaa caatttag 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 7

tcctgtgcag ctgtctaaac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 8

actggcaatg atgggcgatg 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 9

tcggagggat gaaattgg 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 10

agcgttgtcg atgtagag 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 鳞片脱落疾病病毒

<400> 11

atgccgtcat tgtaacac 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 虹彩病毒

<400> 12

cgtgagaccg tgcgtagt 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 虹彩病毒

<400> 13

agggtgacgg tcgatatg 18

Claims (9)

1.一种分离的造成鱼的鳞片脱落疾病的病毒(viruscausingscaledropdiseaseinfish)，其以保藏号CNCMI-4754保藏在CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganisms(CNCM),Institut Pasteur，巴黎，法国。

2.一种包含病毒的细胞培养物，其特征在于，所述培养物包含根据权利要求1所述的病毒。

3.一种DNA片段，其包含编码主要衣壳蛋白的基因，其特征在于，所述主要衣壳蛋白如在SEQ ID NO:2中描绘的氨基酸序列所示。

4.根据权利要求3所述的DNA片段，其中所述基因如在SEQ ID NO:1中描绘的核苷酸序列所示。

5.一种主要衣壳蛋白，其如在SEQ ID NO:2中描绘的氨基酸序列所示。

6.一种DNA片段，其包含编码ATP酶的基因，其特征在于，所述ATP酶如在SEQ ID NO:4中描绘的氨基酸序列所示。

7.根据权利要求6所述的DNA片段，其中所述基因如在SEQ ID NO:3中描绘的核苷酸序列所示。

8.一种ATP酶，其如在SEQ ID NO:4中描绘的氨基酸序列所示。

9.一种诊断测试试剂盒，其用于检测根据权利要求1所述的病毒，其特征在于，所述测试试剂盒包含可与SDD病毒的MCP或ATP酶基因的特定区域反应的PCR引物集合，所述MCP或ATP酶基因分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3中描绘。