CN116121197B - 抗黄鳍鲷虹彩病毒sddv分离株的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗黄鳍鲷虹彩病毒sddv分离株的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株的单克隆抗体及其应用。所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株SDDV(ZH‑04/2020)‑MCP‑3H4 1E1产生，该杂交瘤细胞株SDDV(ZH‑04/2020)‑MCP‑3H4 1E1的保藏编号为：GDMCC No：62648。本发明中SDDV分离株(ZH‑04/2020)MCP的单抗的成功制备为SDDV分离株(ZH‑04/2020)免疫学检测方法的建立及病毒感染致病机理的研究奠定了基础，也可用于对SDDV分离株(ZH‑04/2020)MCP在体内外的定量和定位分析。

Description

抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫学和病毒学交叉技术领域，具体涉及一种能特异识别病毒主要衣壳蛋白的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体及其应用。
背景技术
黄鳍鲷又名黄墙、黄脚立、赤翅等，属鲈形目鲷科鱼类，广泛分布于印度-西太平洋和中国近海，不仅是华南沿海重要的经济鱼类之一，也是一种重要生态物种。黄鳍鲷营养丰富，肉质佳美，经济价值高，在海水及咸淡水养殖业中占有一定的地位。但随着养殖密度增加、养殖环境水体的污染及恶劣的天气，造成黄鳍鲷在养殖过程中暴发各种疾病，包括细菌性、病毒性和寄生虫性疾病等。近年来，广东省珠海市养殖的黄鳍鲷频繁出现严重的腹水性疾病(YFSBAD)，临床症状表现为鱼体腹部膨大，体腔充满黄色的腹水。2021年国内学者从患病鱼腹水中通过宏病毒组测序、体外细胞分离纯化、病毒粒子蛋白质组及回接感染致病性等方法，确定引起黄鳍鲷腹水病的病原为鳞片脱落综合征病毒(Scale drop syndromevirus,SDDV)的分离株。SDDV是一种胞质型双链DNA病毒，属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属。SDDV感染鲈鱼引起的典型症状为：鳞片脱落、黑体、尾鳍糜烂、鳃丝苍白以及肝、脾和肾脏的多灶性坏死。SDDV可以感染亚洲鲈鱼幼鱼和成鱼，导致死亡率约40-50％。近年来的研究结果显示，黄鳍鲷是SDDV虹彩病毒的第三种自然宿主鱼类。
目前对于黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株尚缺乏有效的治疗方法和防控措施，早期检测和诊断是预防该病疾病爆发的关键环节。利用特异性强的单克隆抗体开发针对黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株的检测技术，具有快速、灵敏的优点，也适合现场大规模检测应用。另外，制备的单克隆抗体还可应用于病毒感染致病的研究中，包括病毒基因在宿主体内或体外培养细胞中的表达、定位、及病毒感染致病机理等。主要衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)作为虹彩病毒的主要结构蛋白，可作为病毒分类和检测技术的候选基因。尽管国内已经制备了多种鱼类病毒或病毒蛋白的单克隆抗体，但是尚未有SDDV MCP单克隆抗体制备及应用的相关文献与专利。因此，抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP单克隆抗体的制备将为该病毒检测技术的开发及感染致病机理等研究奠定基础。
发明内容
本发明的第一个目的是提供能产生抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1，其于2022年7月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62648。
本发明的第二个目的是提供抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体，其是由杂交瘤细胞株SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1产生。
本发明的第三个目的是提供杂交瘤细胞株SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1在生产抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体中的应用。
本发明的第四个目的是提供抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体在制备检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)产品中的应用。
优选的，是提供抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体在制备检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白抗原产品中的应用。
优选的，所述的产品选自试剂、试纸条或试剂盒中的任意一种。
优选的，所述的试剂盒选自胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒中的任意一种。
本发明的第五个目的是提供一种检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的产品，其包含所述的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体。
本发明的第六个目的是提供一种检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的方法，使用所述的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体，或所述的检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的产品，对待测样本进行检测。
本发明的第七个目的是提供所述的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的单克隆抗体、检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的产品或检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)的方法在检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020中的应用。
本发明以纯化的SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP原核表达产物为抗原，免疫BALB/c小鼠，经细胞融合，产生融合的杂交瘤细胞，经间接酶联免疫反应(ELISA)筛选，获得稳定分泌抗SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP单克隆抗体3H4 1E1的杂交瘤细胞株。免疫印迹法结果显示，本发明的单抗具有很好的特异性，能特异性识别SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP原核表达产物和感染细胞中的病毒MCP。本发明中SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP的单抗的成功制备为SDDV免疫学检测方法的建立、抗病毒免疫制剂、病毒感染致病机理的研究奠定了基础。
杂交瘤细胞株SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1，其于2022年7月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62648。
附图说明
图1为纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白的SDS-PAGE电泳图。(a)表达的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白在上清和沉淀中的分布，1.蛋白质分子量标准；2.菌体上清中蛋白的分布；3.菌体沉淀中蛋白的分布。(b)纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白，1.纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白；2.蛋白质分子量标准。
图2为杂交瘤阳性细胞的免疫印迹法筛选。M.蛋白分子量标准；1.杂交瘤细胞3H41E1培养上清；2.杂交瘤细胞3G9 3B5培养上清；3.杂交瘤细胞6F10 3E11培养上清。
图3为纯化的单克隆抗体SDS-PAGE鉴定。M.蛋白质分子量标准；2.杂交瘤细胞3H41E1制备腹水纯化的单克隆抗体。
图4为纯化的单克隆抗体对病毒感染细胞MCP蛋白的免疫印迹分析图。M.蛋白质分子量标准；2.SDDV分离株(ZH-04/2020)感染细胞作为检测抗原，杂交瘤细胞3H4 1E1制备的抗体作为一抗。
图5图为SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP单克隆抗体3H4 1E1对病毒的特异性识别检测。SPIV：sea perch iridovirus，海鲈虹彩病毒；SGIV：Singapore grouper iridovirus，石斑鱼虹彩病毒；LMBV：大口黑鲈虹彩病毒；SDDV：黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株(ZH-04/2020)；Mock：模拟感染。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP原核表达重组质粒的构建与蛋白表达
(1)根据实验室测序的SDDV分离株(ZH-04/2020)的全基因组中的MCP序列的信息，在金开瑞生物公司合成该基因的开放阅读框的序列(其核苷酸序列如下所示，具体为：ATGAGTAGCATTGCCGGCGCCAATGTTACCAGCGGTTTTATTGATCTGGCAGCCTATGATGCCATGGAAACCCATCTGTATGGCGGTGATAATAGTATTACCTATTTTCTGCGTGAAACCACCCGCAGCAGCTGGTTTAGCAAACTGCCGGTTCAGCTGAGCAAACAGACCGGCACCGCAAATTTTGGCCAGGAATTTAGTGTGGTTGTTGCACGTGGCGGTGATTATCTGATGAATGTGTGGCTGCGCGTGAAAGTGCCGGCCCTGAAAAATACCAAAGCAAATAGTAGCATTCGCTGGACCGATAATTTTATGCATAATCTGGTTCAGGAAGTGACCATTAGTTTTAATGATCTGACCGCCCAGACCATTACCAGCGAATTTCTGGATTTTTGGAGTACCTGCAATGTTCCGGGCGGCAAAAGTAGCGGCTATGCCAATATGATTGGTTATACCCATGATCTGGTGGGTGGCACCGTGCAGAATGCCACCATGCCGAGCAAATATCTGAATCTGCCGATTCCGTTTTTTTTTACCCGTGATACCGGCCTGGCACTGCCGACCGCAGCCTTACCGTATAATGAAATTAAAATTCACTTCAAGCTGCGCGATTGGAAAGATCTGCTGATTAGCCAGAGCACCAATGATAATGCCATTAGTGTTCCGCTGACCAGCGATATGGAAAATGTGACCCCGGCCCTGACCGAAGTGAGTGTTATGGGTACCTATGCCATTCTGACCAATGAAGAACGTGAAGCCATGAGTCTGGTGAGCCGCGATATGATTATTGAACAGTGTCAGATGGCCCCGCGTATTCCGATTCGCCCGCTGGAAAATGAAATGCCGCATATTGATCTGCGCTTTAGTCATCCGATTAAAGAACTGTTTTTCGCCGTGAAAAATGTTACCCATCCGAATATTCATAGCAATTATACCGCCGCCAGTCCGATTATTGCCAGCGGCACCAATAAAGTTACCATGCCGCCGAAAGCACAGAATCCGCTGAGTCATGTGAGCCTGATTTATGAAAATACCGCCCGCCTGAATAATATGGGCGTTGATTATTTTAGCTACGTGGACCCTTATTTTTTTGCCCCGTGTATTCCGAAAATTGATGGTGTGATGGCATATTGTTATACCATGAATATGGGCCATGTTGATCCGATGGGTAGTACCAATTTTGGTCGTCTGAGCAATATTACCCTGAGTGCAAAAGTGACCGCAAATAGCAAAACCACCAGCGCCGCAAGCGGTAATACCGATGGTCATAAAGTGGCACAGAAATTTGAACTGGTGGTTATTGGTGTGAATCATAATGTGGCCCGCATTAGTAATGGCAGTTTTGGTTTTCCGATTCTGTAA)，两头分别添加限制性内切酶Bam H I和Xho I位点，提取含MCP基因的质粒。用限制性内切酶Bam H I和Xho I对含MCP基因的质粒和pET28a(+)分别进行双酶切，使用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接，连接后构建重组质粒pET28a-SDDV(ZH-04/2020)MCP(即将MCP基因插入到质粒pET28a的Bam H I和Xho I酶切位点之间)。将重组质粒pET28a-SDDV(ZH-04/2020)MCP转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，采用菌落PCR法筛选阳性菌，并进行测序验证。
(2)将测序正确的阳性菌和pET28a空载体的菌放入含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日按体积比1:100稀释培养过夜的菌液，继续培养至菌液OD600约0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达，未加IPTG诱导的菌液为对照。诱导培养3h后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。
(3)结果表明，诱导后的重组菌液蛋白在分子质量Mr＝54kDa处有明显的条带，而未诱导的菌液蛋白无相应条带。SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白理论分子量为50kDa，标签蛋白分子量为4kDa，故预测的重组蛋白的大小与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝集电泳(SDS-PAGE)凝胶显示的目的蛋白分子量一致。超声破碎菌体，16000rpm/min、4℃离心，收集上清及沉淀。分别取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测蛋白分布。结果表明：诱导的蛋白主要表达在沉淀中，上清中仅有极少量的表达产物(图1a)。
(4)包涵体蛋白纯化。按照包涵体蛋白纯化方法进行蛋白的纯化，具体程序如下：①收集菌液，将菌体细胞用预冷NTA-0缓冲液重悬，冰浴30min进行超声破碎25-30min(参数设置为功率200W，工作3s，暂停4s)，16000rpm/min、4℃离心50min，去上清。②沉淀用STET缓冲液(DTT浓度1mM)重悬，超声破碎10min，参数设置为功率200W，工作3s，暂停3s；10000rpm/min、4℃离心10min，去上清；③重复②三次至上清透明；④沉淀以PBS重悬，超声，参数设置为功率200W，工作3s，暂停3s，时间5min；16000rpm/min、4℃离心10min，去上清；⑤以4mLSKL(十二烷基肌氨酸钠)重悬包涵体，加5mM浓度的DTT，37℃震荡至包涵体全部溶解。10000rpm/min、4℃离心10min，取上清蛋白溶液。
(5)包涵体蛋白复性。①以2倍体积的3M盐酸胍稀释蛋白溶液，在4℃以注射器逐滴加入到200mL复性液(称取0.077g氧化型谷胱甘肽、0.385g还原型谷胱甘肽、0.186gEDTA·2Na、17.42g精氨酸、3.03g Tris base，加去离子水溶解，加入浓盐酸调节pH＝8.0，定容至250mL)中，转速调节至最大，搅拌24h；降低转速，继续搅拌24h；②取蛋白溶液于透析袋中，以PEG20000浓缩体积至50～100mL，4℃TE缓冲液中透析过夜；③取蛋白溶液，以PEG20000浓缩体积至2～4mL；4℃在TE缓冲液中透析过夜，取蛋白溶液进行SDS-PAGE检测。
(6)复性蛋白亲和纯化。①上述(5)中复性的蛋白溶液用0.22μm过滤器过滤后，进行Ni-NTA柱纯化；②以1mL/min的流速上样蛋白溶液；以NTA-0缓冲液(pH 8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)；③分别以含20mM、60mM、200mM和500mM咪唑的洗脱液洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；④以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20％乙醇封柱，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。⑤将纯度达到要求的组分于4℃以TE透析；4℃超滤浓缩透析产物，SDS-PAGE检测蛋白的纯化情况。结果显示，经包涵体纯化、蛋白复性及Ni-NTA柱纯化后的MCP重组蛋白有一条分子量为54kDa的目的条带，蛋白浓度约1.0mg/mL，纯度约85％(图1b)。由此得到纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白，满足后续免疫要求。
实施例2：小鼠抗SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白单克隆抗体的制备
(1)免疫
用纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白作为抗原免疫SPF级雌性BALB/c小鼠，本发明中共免疫8只小鼠。免疫共分4次进行，均为皮下注射：①一免：每只小鼠皮下注射50μg纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白与等量弗氏完全佐剂(V/V)，免疫时间2-3周；②二免：每只小鼠皮下注射50μg纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白与等量弗氏不完全佐剂(V/V)，免疫时间2周；③三免：每只小鼠皮下注射50μg纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白与等量弗氏不完全佐剂(V/V)，免疫时间1周，三免后通过ELISA进行效价检测；④四免：每只小鼠皮下注射50μg纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白与等量弗氏不完全佐剂(V/V)，免疫时间2周，四免后通过ELISA进行效价检测。⑤腹腔冲击：每只小鼠腹腔注射50μg纯化的重组SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白，免疫时间3天。
(2)细胞融合
①免疫脾细胞的制备：取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。通过断颈处死小鼠后，浸泡于75％酒精中5min，无菌取出脾脏后放入3.5cm培养皿中，去除脾脏上的脂肪和结缔组织。用研磨棒研磨，使脾脏内淋巴细胞透过绢网制成单细胞悬液，收集单细胞悬液于15mL离心管中。1000rpm/min离心5min，弃去上清液，沉淀用RPMI-1640溶液重悬备用。
②SP2/0骨髓瘤细胞的制备：复苏-80℃冻存的SP2/0骨髓瘤细胞，37℃水浴速溶；1000rpm/min离心5min，吸出上清，加入1mL GIT培养基(Hyclone DMEM，Thermo)，转移到24孔板中。第二天进行扩大传代培养。约两天后观察细胞状态，选择生长和形态良好处于对数生长期的细胞进行后续融合。融合前12h更换培养基。
③饲养层细胞准备：将健康的BALB/c小鼠在无菌条件下取出其脾脏，并用含20％胎牛血清的HAT培养基制成单个脾细胞悬液，然后根据铺板数量，预先将其铺入到96孔板中。
④SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞以一定比例混合(数量比1：5)，50％PEG1450作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀。
⑤融合细胞按照2×107个细胞/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO2，37℃下培养。融合后每天检查细胞生长情况及是否有污染。当融合细胞形成细胞团后，取培养上清进行筛选。
(3)杂交瘤细胞的筛选、克隆与亚型鉴定
1)融合板检测：待融合板换液细胞长至中等大小约1×104个细胞以上开始检测。采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞，具体步骤如下：①抗原包被：以纯化的SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP重组蛋白以1μg/mL的浓度包被酶标板，4℃包被过夜；②封闭：37℃下5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次；③加入待检杂交瘤细胞培养上清的不同稀释度的稀释液到96孔板中，100μL/孔，37℃孵育1h，PBS作为空白对照；④一抗孵育后TBST漂洗3遍，加入1:10000的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG二抗，100μL/孔，37℃温育40min；二抗孵育后TBST漂洗5遍；⑤显色：每孔加100μL底物显色剂(TMB显色液)室温避光孵育15min；⑥终止反应、比色：每孔加50μL的H2SO4终止反应，用酶标仪测定450nm的吸光值。在ELISA质控合格(即阴性对照＜0.2，阳性对照＞1.0)后挑选阳性孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。
2)亚克隆方法及检测：挑出融合板中效价和亲和力较高的细胞株进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆4-5天即可进行ELISA检测。经过二次亚克隆的筛选后，最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行定株扩大培养。每轮亚克隆细胞培养上清均用上述的ELISA的方法检测。本发明共筛选出20株细胞，经ELISA检测后共定5株分泌阳性抗体的细胞株。
3)细胞株建立和扩大培养：将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清，采用免疫印迹方法检测上清中抗体对抗原的识别。收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价。免疫印迹方法具体步骤如下：以SDDV感染细胞为样品，经SDS-PAGE分离蛋白，通过电转仪将凝胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含1％的酪蛋白PBS溶液封闭30min，加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清及免疫小鼠血清，室温孵育2h，PBST溶液(含0.05％Tween-20的PBST溶液)漂洗3次后，加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1:5000稀释)中，室温继续孵育2h，PBST溶液漂洗3次。加入底物混合液显示观察。免疫印迹(westernblot)的结果表明：融合阶段共筛选出杂交瘤30株左右，经样本ELISA检测后共筛出6株，亚克隆后定株杂交瘤细胞株5株。检测的三株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞3H4 1E1,3G9 3B5和6F10 3E11的上清均能识别到病毒感染细胞中内源性的MCP(图2)，后续选择杂交瘤细胞3H4 1E1细胞株制备腹水。亚型细胞定株后扩大培养选用RPIM-1640培养基(含10％胎牛血清)，5％CO2，37℃下培养，当细胞密度达到以1×106～2×106/mL时，800rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬备用。同时将杂交瘤细胞进行冻存。
上述杂交瘤细胞3H4 1E1命名为：SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1，其于2022年7月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62648。
4)细胞株冻存鉴定：细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：：①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能存在其它微生物的污染；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA检测，以确定是否分泌阳性抗体。
5)腹水制备和纯化
先用液体石蜡注射小鼠腹腔，一周后将杂交瘤细胞3H4 1E1接种到小鼠腹腔中。7-10天后，收集腹水准备纯化。收集后的腹水经过预处理后选用Protein G-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：①配制缓冲液：起始缓冲液为pH 7.0，20mmol/L磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH 2.7，0.1mmol/L甘氨酸盐酸；②准备收集管：取1.5mL离心管，每支离心管加70μLpH 9.0，0.1mmol/L Tris-HCL；③样品准备：经50％SAS沉淀得到的样品，置于起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm微孔滤膜滤过滤；④纯化过程：层析柱预处理，10倍柱体积的去离子水冲洗3-5遍，流速1mL/min,用10柱体积的起始缓冲液(含0.3M NaCl)平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein G 1ml，Pharmacia Biotech)，冲洗3-5遍，流速1mL/min。样品上样：取15～25mL待纯化的样品(腹水用起始缓冲液稀释后)上柱，流速为0.6mL/min。洗杂：起始缓冲液冲洗至检测(G250不变蓝)无蛋白流出为止，流速1.5mL/min。抗体洗脱：洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱物并用G250检测洗脱产物至不变蓝。pH值调节：饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性。样品浓缩：10kDa超滤管超滤浓缩至1-5mL。透析：5mL 0.01M pH 7.4PBS透析过夜，第二天换液一次。⑤纯度及活性鉴定：纯化的单克隆抗体用SDS-PAGE鉴定其纯度。
本实施方案中各取腹水5mL，共纯化抗体1株，纯化的单抗经SDS-PAGE检测纯度的结果表明，有两条蛋白条带，其分子量分别约为54kDa和25kDa(图3)，抗体纯度在90％以上，表明纯化后的抗体纯度较高。
实施例3：抗SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白单克隆抗体3H4 1E1的性质鉴定
1)单克隆抗体腹水纯化抗体浓度测定
采用间接ELISA方法对单克隆抗体腹水纯化抗体浓度进行测定。以纯化的SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP重组蛋白为包被抗原，测定纯化抗体浓度。ELISA测定结果表明，3H41E1制备的抗体浓度为3.6mg/mL。
2)单克隆抗体的亚型鉴定
利用Thermo Scientific单抗分型试剂盒，通过间接ELISA法对定株的单克隆细胞上清进行亚型鉴定。结果表明，5株细胞株抗体均为单一亚型，其中3H4 1E1为IgG1亚型。
3)单克隆抗体的特异性识别鉴定
采用上述免疫印迹的方法检测腹水纯化后获得抗体3H4 1E1对内源性MCP的识别。结果表明，在SDDV分离株(ZH-04/2020)病毒感染细胞的样品中能够检测到MCP的阳性条带，大小约50kDa(图4)，说明本发明所述的单克隆抗体3H4 1E1能识别SDDV分离株(ZH-04/2020)的主要衣壳蛋白MCP。
4)杂交瘤细胞的冻存与复苏
将扩大培养的杂交瘤细胞3H4 1E1培养于细胞瓶中，进行冻存。①取对数期生长旺盛，状态良好的细胞，1000rpm/min离心6min，去上清；②缓慢地加入1mL预先配置的冷冻存液(按体积分数计，20％胎牛血清+70％RPIM-1640+10％二甲基亚砜)重悬细胞，细胞密度约为6×106个/mL，将细胞悬液转移到冻存管中，置于冻存盒中于-80℃超低温冰箱中缓慢降温。③16h后，将冻存细胞放入液氮中长期保存。④从液氮中取出冻存1.5个月的细胞，在37℃水浴快速解冻，细胞悬液经1000rpm/min离心5min去除冻存液，加入新鲜RPIM-1640培养基(含10％胎牛血清)继续培养，观察细胞的生长情况。本发明获得的杂交瘤细胞3H4 1E1冻存复苏后，形态正常，生长状态好，细胞活力均在80％以上。免疫印迹检测细胞上清中仍具有较高的抗体，说明细胞经冻存后仍能稳定分泌抗体。
实施例4：抗SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白单克隆抗体的应用
抗SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白单克隆抗体用于特异性检测病毒感染：
间接免疫印迹法测定本发明中抗SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP蛋白单克隆抗体3H41E1用于特异性检测病毒感染。分别用SGIV、LMBV、SDDV(ZH-04/2020)和SPIV等病毒感染细胞的裂解物作为待检样品。3H4 1E1纯化的腹水抗体作为一抗，同时设立模拟感染组细胞作为阴性对照。按上述免疫印迹法方法检测待检样品中是否有特异性条带。检测结果表明，3H4 1E1纯化的腹水抗体与SDDV(ZH-04/2020)呈明显的阳性反应，SDDV(ZH-04/2020)感染细胞中出现特异性条带。而与其它三种病毒感染细胞及模拟感染阴性对照细胞样品没有检测到特有的条带(图5)，说明制备的抗SDDV分离株(ZH-04/2020)MCP的单抗能特异性地应用于SDDV分离株(ZH-04/2020)的检测。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.杂交瘤细胞株SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1，其保藏编号为：GDMCC No：62648。
2.抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020的单克隆抗体，其特征在于，是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1产生。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株SDDV(ZH-04/2020)-MCP-3H4 1E1在生产抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020的单克隆抗体中的应用。
4.权利要求2所述的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020的单克隆抗体在制备检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是在制备检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020 MCP蛋白抗原产品中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的产品选自试剂或试剂盒中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒选自胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒中的任意一种。
8.一种检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020 的产品，其特征在于，包含权利要求2所述的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020的单克隆抗体。
9.一种非疾病诊断和治疗目的的检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020的方法，其特征在于，使用权利要求2所述的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020的单克隆抗体，或权利要求8所述的检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020 的产品，对待测样本进行检测。
10.权利要求2所述的抗黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020的单克隆抗体或权利要求8所述的检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020 的产品在非疾病诊断和治疗目的的检测黄鳍鲷虹彩病毒SDDV分离株ZH-04/2020中的应用。
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