CN114891926A - 脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法 - Google Patents

脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述脱鳞病毒检测体系包括所述引物和/或探针。所述脱鳞病毒检测方法采用微滴式数字PCR检测方法，即采集待测鱼类的组织样本后，提取样本的DNA，然后以DNA为模板采用微滴式数字PCR，可准确检测出待测鱼类是否感染或携带SDDV，本发明的微滴式数字PCR检测方法灵敏度高，在养殖鱼类优质亲本选择中具有较好的应用前景。

Description

脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法
技术领域
本发明涉及水生动物病毒检测技术领域，特别涉及脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法。
背景技术
脱鳞病毒(Scale drop disease Virus,SDDV)是一种新生鱼虹彩病毒。早在2002年，马来西亚养殖金目鲈出现脱鳞症(Scale drop syndrome,SDS)病害。2012年，新加坡研究人员首次自SDS金目鲈观察虹彩病毒样病毒颗粒，但抗RSIV的单克隆抗体不能识别该病毒，提出该病毒可能是一种有别于RSIV的新型鱼虹彩病毒。2015年，MSD Animal Health的研究人员自新加坡的SDS金目鲈通过细胞培养途径培养出该病毒，命名为脱鳞病病毒(SDDV)。
黄鳍鲷具有极高的养殖价值，但近年来黄鳍鲷主养区在夏季高温季频繁出现黄鳍鲷腹水症状，发病鱼规格10～140g不等，临床症状主要表现为腹部肿胀，有时也伴有眼球脱落，解剖可见大量黄色腹水。当地养殖户将该病称为“黄鳍鲷腹水病”。
国内多个研究团队对该病害进行了跟踪研究，但一直没有可信结论。2020年6月初，珠海市现代农业发展中心与中山大学团队合作，最终通过细胞培养方法分离到SDDV样病毒。对该病毒系统的全基因组、全蛋白质组、细胞感染病理、透射电镜观察、回归感染、临床病例、组织病理及与ISKNV的抗原交叉反应研究，大量充分的研究证据显示SDDV是黄鳍鲷腹水病的病毒性病原。
目前对SDDV病毒的检测技术较少，基本存在于对国外地区的套式PCR和荧光定量PCR。但这些检测方法的灵敏度有限，在拷贝数较少的情况下很难被检测到，较容易出现假阴性。因此，有必要开发一种灵敏度高的SDDV检测方法。
发明内容
本发明目的在于提供脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
本发明的第一方面在于提供一对引物的核苷酸序列。所述引物为用于特异性扩增脱鳞病毒的上游引物57-F和下游引物57-R，
上游引物57-F：5’-GCACTAATGATAATGCAATTTCTGTAC-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物57-R：5’-TCACGCTCTTCGTTGGTCAG-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明的第二方面在于提供一段探针的核苷酸序列。所述探针为用于特异性检测脱鳞病毒的探针57-P，
探针57-P：5’-CACCCGCTCTGACTGAAGTTAGTGTTATG-3’(SEQ ID NO.3)。探针的5’端带有荧光报告基团，如FAM、VIC、HEX、ROX、JOE、Cy3、Cy5等；3’端带有荧光猝灭基团，如TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3等。
所述引物及所述探针均以SDDV的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列为靶标。
本发明的第三方面在于提供一种脱鳞病毒检测体系。所述脱鳞病毒检测体系包括ddPCR探针法预混液，所述ddPCR探针法预混液包括前述的引物和/或前述的探针。建立的检测体系基于微滴式数字PCR检测方法。该检测体系灵敏度较高，且未存在以该检测体系检测SDDV的现有技术。
进一步，所述ddPCR探针法预混液还包括DNA聚合酶和/或无RNA酶蒸馏水。当所述ddPCR探针法预混液同时包括DNA聚合酶和无RNA酶蒸馏水时，所述ddPCR探针法预混液的总体积为29μL，包括：15μL 2倍浓度的Probe dPCR SuperMix、2.4μL浓度为10μM的上游引物57-F、2.4μL浓度为10μM的下游引物57-R、0.75μL浓度为10μM的探针57-P、8.45μL无RNA酶蒸馏水。
进一步，脱鳞病毒检测体系还包括探针法ddPCR微滴生成油、ddPCR微滴检测油、阴性对照阳性对照或无RNA酶蒸馏水中的至少一种。当所述脱鳞病毒检测体系包括阳性对照时，所述阳性对照为含有脱鳞病毒基因序列的质粒。所述质粒可以是SDDV MCP蛋白基因序列。
本发明的第四方面在于提供一种脱鳞病毒的检测方法。所述脱鳞病毒的检测方法包括步骤：
制备PCR反应模板：提取待测样品的核苷酸，作为PCR反应模板；
配制ddPCR反应液：ddPCR探针法预混液29μL，PCR反应模板1μL；PCR反应模板的浓度小于50ng/μL；
制备微滴：将8联排管放入微滴制备仪相对应位置，将微液滴生成芯片放入配套的生成芯片卡具中，压下卡具固定芯片，在水孔中加入ddPCR反应液30μL，在油孔中加入180μL微液滴生成油，然后将芯片的水孔和油孔盖上微液滴生成芯片密封垫，将装有微液滴生成芯片的卡具放入仪器，压下把手固定，操作仪器运行，生成微液滴；
扩增：取出卡具，将含有微液滴的8联排管盖上密封盖，转入PCR仪中进行扩增；
检测：将完成PCR扩增的微液滴8联管和微液滴检测芯片分别放入检测芯片机械卡具相对应位置，压下卡具上盖固定芯片，在油孔1和油孔2中分别加入430μL和500μL微液滴检测油，盖上微滴检测芯片密封垫，然后将卡具放入生物芯片分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中脱鳞病毒检测结果。
本发明通过实验发现，微滴式数字PCR检测在SDDV检测中较PT-PCR具有更高的灵敏度，通过数字PCR和RT-PCR在低浓度SDDV检测中发现，当SDDV拷贝数较低时，RT-PCR便不能有效检测样品中的SDDV。同时，微滴式数字PCR可直接确定病毒拷贝数，有效检测黄鳍鲷是否携带病毒。
进一步，所述扩增步骤中，所述扩增的程序为95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，63℃退火60秒，共40个循环；4℃恒温，结束反应，每步都设置1.5℃/秒的变温速度。
本发明的第五方面在于提供前述引物、探针或检测体系在非诊疗为目的检测鱼类脱鳞病毒中的应用。所述鱼类包括但不限于进出口冷冻鱼类。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
开发了一种灵敏度较高的SDDV检测方法，用于检测鱼类是否携带该病毒，为鱼类优质养殖选择提供参考。本发明建立了一种用于检测SDDV的微滴式数字PCR方法，即采集待测鱼类的组织样本后，提取样本的DNA，然后以DNA为模板采用微滴式数字PCR，可准确检测出待测鱼类是否感染或携带SDDV，本发明的微滴式数字PCR检测方法灵敏度高，在养殖鱼类优质亲本选择中具有较好的应用前景。
附图说明
图1是实施例4中的灵敏度结果试验图；图中区间(1)至(6)依次为1.37×100、1.37×101copies/μL、1.37×102copies/μL、1.37×103copies/μL、1.37×104copies/μL、1.37×105copies/μL浓度的SDDV阳性质粒样品；区间(7)为阴性样品。
图2是实施例5中的特异性试验图；图中区间(A)为SDDV阳性质粒样品，区间(B)为阴性对照样品，区间(C为)传染性脾肾坏死病毒样品，区间(D)为蛙虹彩病毒样品，区间(E)为鱼类神经坏死病毒样品，区间(F)为罗非鱼湖病毒样品。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1，基于微滴式数字PCR检测脱鳞病毒方法的建立
实验过程中所用的引物经试验优化，探针5’和3’端分别携带发光基团和淬灭基团。通过BLAST分析所设计的SDDV引物序列在黄鳍鲷基因组中不存在互补序列。
(1)设计检测所用的特异性引物和探针序列如下：
上游引物57-F：5’-GCACTAATGATAATGCAATTTCTGTAC-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物57-R：5’-TCACGCTCTTCGTTGGTCAG-3’(SEQ ID NO.2)；
探针57-P：5’-FAM-CACCCGCTCTGACTGAAGTTAGTGTTATG-TAMRA-3’
(SEQ ID NO.3)；其中，FAM(羧基基荧光素)为荧光报告基团，TAMRA(6羧基四甲基若丹明)为荧光猝灭基团。
(2)配制ddPCR反应液，体积30μL，其配方为：ddPCR探针法预混液29μL，待测样品提取的PCR反应模板1μL，引物浓度(10μM)等条件进行优化，探针浓度为10μM。反应体系如下：15μL Mix(2×)、2.4μL上游引物57-F(10μM)、2.4μL下游引物57-R(10μM)、0.75μL探针57-P、1μL PCR反应模板(浓度<50ng/μL)，加8.45μL水补足至30μL。
(3)制备微滴，将8联排管放入微滴制备仪相对应位置，将微液滴生成芯片放入配套的生成芯片卡具中，压下卡具固定芯片，在水孔中加入ddPCR反应液30μL，在油孔中加入180μL微液滴生成油，然后将芯片的水孔和油孔盖上微液滴生成芯片密封垫。将装有微液滴生成芯片的卡具放入仪器，压下把手固定，操作仪器运行，生成微液滴。样品制备通用试剂盒购自于新弈制造科技(北京)有限公司，产品目录号(10001)。
(4)微液滴生成完毕后，取出卡具，将含有微液滴的8联排管盖上密封盖，转入PCR仪中进行扩增。
(5)扩增反应条件为：95℃预变性10min；39个循环：95℃变性30s，63℃退火1min，变温速度为1.5℃/s。微液滴检测通用试剂盒购自于新弈制造科技(北京)有限公司，产品目录号(10002)。
(6)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数。将完成PCR扩增的微液滴8联管和微液滴检测芯片分别放入检测芯片机械卡具相对应位置，压下卡具上盖固定芯片，在油孔1和油孔2中分别加入430μL和500μL微滴液检测油，盖上微滴检测芯片密封垫，然后将卡具放入生物芯片分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中脱鳞病毒检测结果。
结果显示：所用引物及探针能检测出SDDV病毒拷贝数，并且阴阳性微滴界限清晰分明。
实施例2，微滴式数字PCR检测SDDV阈值线确定
对检测SDDV病毒的微滴式数字PCR检测方法的阈值线进行确定。具体操作如下：
利用实施例1所述的方法，以无RNA酶蒸馏水替代PCR反应模板制作空白样本反应液，形成微滴，上PCR仪进行扩增，并使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数。
实验结果显示：通过对10份空白样本进行微滴式数字PCR检测，确定阈值线为2650。
实施例3，微滴式数字PCR检测SDDV退火温度优化
对检测SDDV病毒的数字PCR检测方法的退火温度进行了优化，具体操作如下：
利用实施例1所述方法，形成微滴，上PCR仪进行扩增，PCR的扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性3秒，56～65℃退火60秒(分别为65℃、63.0℃、62.0℃、60.0℃、58.0℃、56.0℃)，共40个循环。使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数。
实验结果显示，退火温度65.0℃、63.0℃、62.0℃、60.0℃、58.0℃、56.0℃相对应的拷贝数分别为980copies，1018copies，1080copies，1228copies，1088copies，1582copies(杂带)，1338copies(杂带)。因此，根据结果显示选择60℃为该检测方法最佳退火温度。
实施例4，微滴式数字PCR检测方法灵敏度的测定
本实施例验证了本发明中引物特异性探针以及检测方法的灵敏度，具体操作如下：
本实验采用SDDV病毒阳性质粒进行10倍梯度连续稀释，共设置6个梯度(1.37×105copies/μL、1.37×104copies/μL、1.37×103copies/μL、1.37×102copies/μL、1.37×101copies/μL、1.37×100copies/μL)，按照前述的检测方法进行检测。
实验结果如图1所示，通过泊松分布直接计算得出区间(1)为1.2拷贝数，区间(2)为30.5拷贝数，区间(3)为386.7拷贝数，区间(4)为3619.3拷贝数，区间(5)为34894.2拷贝数，区间(6)为296717.3拷贝数；区间(7)无荧光信号。即，本发明建立的数字PCR检测方法最低检出限为1.2copies/μL拷贝数。
实施例5，微滴式数字PCR检测方法验证引物和探针的特异性
利用前述提供的检测方法，对待测病毒DNA进行检测，同时设置阳性对照组(SDDV阳性质粒)和阴性对照组(无RNA酶蒸馏水)，使用的待测病毒包括传染性脾肾坏死病毒(Infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)、蛙属虹彩病毒(MRV)、鱼类神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)、罗非鱼湖病毒(Tilapia Lake virus，TiLV)。
实验结果如图2所示，仅阳性对照组(SDDV阳性质粒)可检测到信号(A)，B为阴性对照，传染性脾肾坏死病毒(C),蛙虹彩病毒(D)鱼类神经坏死病毒(E)，罗非鱼湖病毒(F)各组均无信号为阴性，说明本发明的引物和探针具有良好的特异性。
实施例6，微滴式数字PCR与RT-PCR在SDDV检测中灵敏度和准确性比较
将SDDV基因组片段的质粒10、100、1000、10000、100000倍稀释后，通过数字PCR和RT-PCR检测其拷贝数或扩增曲线。当稀释10倍时，发现数字PCR检测结果为全阳性，说明质粒浓度太高，己超过其检测的最大阈值。当质粒稀释100倍时，微滴式数字PCR和荧光定量PCR均能准确检测SDDV模板。但当质粒稀释至100000倍，RT-PCR扩增循环数己超过35，RT-PCR不能有效检测样品中的SDDV，而数字PCR仍可准确检测到样本中SDDV的拷贝数。结果如表1所示。
表1：数字PCR和RT PCR检测其拷贝数或扩增曲线比较
Figure BDA0003659393460000051
注：“/”表示未检出
可见，通过微滴式数字PCR和RT-PCR对低浓度SDDV进行检测，当SDDV拷贝数较低时，RT-PCR便不能有效检测样品中的SDDV，说明微滴式数字PCR在SDDV检测中较RT-PCR具有较高的灵敏度。
实施例7，微滴式数字PCR对SDDV检测攻毒黄鳍鲷组织样本检测
(1)实验室黄鳍鲷攻毒
SDDV攻毒液来自于中山大学生命科学董传甫实验组。实验室鱼购于珠海市金湾区池塘养殖黄鳍鲷20尾，体长12～14cm，首先检测其不携带SDDV病毒。在实验室饲养两周，期间正常喂养。两周后用丁香酚麻醉，将准备好的SDDV病毒液于黄鳍鲷胸鳍处注入浓度3×108攻毒液100μL，对照组注射PBS。注射后正常养殖。
(2)黄鳍鲷组织提取
将出现腹部肿大，濒死的鱼进行解剖，取其鱼体各个组织部位，包括：肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肠道、脑、血、肌肉、皮、腹水等样本。
(3)DNA提取
采用试剂盒说明书方法提取DNA。试剂盒为鼎国动物组织提取试剂盒。
(4)按照前述实施例优化后的微滴式数字PCR检测方法，检测各个组织病毒含量。
结果显示，通过微滴数字PCR检测，SDDV攻毒后黄鳍鲷各个组织含量，其中肾脏、脾脏和肝脏组织病毒拷贝数较多，血、腹水和肠道组织病毒含量较少。
本发明采用微滴数字PCR技术检测SDDV病毒病病毒，其检测的灵敏度高，不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接判读样品中SDDV的核酸拷贝数，极大的简化了操作步骤。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海市现代农业发展中心,珠海市金湾区台湾农民创业园管理委员会
,珠海市农渔业科研与推广中心
<120> 脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法
<130> 2022
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcactaatga taatgcaatt tctgtac 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcacgctctt cgttggtcag 20
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacccgctct gactgaagtt agtgttatg 29

Claims (10)

1.引物，其特征在于，包括用于特异性扩增脱鳞病毒的上游引物57-F和下游引物57-R，所述上游引物57-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物57-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.探针，其特征在于，包括用于特异性检测脱鳞病毒的探针57-P，所述探针57-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.脱鳞病毒检测体系，其特征在于，包括ddPCR探针法预混液，所述ddPCR探针法预混液包括如权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针。
4.根据权利要求3所述脱鳞病毒检测体系，其特征在于，所述ddPCR探针法预混液还包括DNA聚合酶和/或无RNA酶蒸馏水。
5.根据权利要求4所述脱鳞病毒检测体系，其特征在于，所述ddPCR探针法预混液还包括DNA聚合酶和无RNA酶蒸馏水，所述ddPCR探针法预混液的总体积为29μL，包括：15μL 2倍浓度的Probe dPCR SuperMix、2.4μL浓度为10μM的上游引物57-F、2.4μL浓度为10μM的下游引物57-R、0.75μL浓度为10μM的探针57-P、8.45μL无RNA酶蒸馏水。
6.根据权利要求3所述脱鳞病毒检测体系，其特征在于，还包括探针法ddPCR微滴生成油、ddPCR微滴检测油、阴性对照、阳性对照或无RNA酶蒸馏水中的至少一种。
7.根据权利要求6所述脱鳞病毒检测体系，其特征在于，所述脱鳞病毒检测体系包括阳性对照，所述阳性对照为含有脱鳞病毒基因序列的质粒。
8.权利要求1所述引物、权利要求2所述探针或权利要求3至7任一项所述脱鳞病毒检测体系在非诊疗为目的检测脱鳞病毒中的应用。
9.脱鳞病毒的检测方法，其特征在于，包括步骤：
制备PCR反应模板：提取待测样品的DNA，作为PCR反应模板；
配制ddPCR反应液：ddPCR探针法预混液29μL，PCR反应模板1μL；
制备微滴：将8联排管放入微滴制备仪相对应位置，将微液滴生成芯片放入配套的生成芯片卡具中，压下卡具固定芯片，在水孔中加入ddPCR反应液30μL，在油孔中加入180μL微液滴生成油，然后将芯片的水孔和油孔盖上微液滴生成芯片密封垫，将装有微液滴生成芯片的卡具放入仪器，压下把手固定，操作仪器运行，生成微液滴；
扩增：取出卡具，将含有微液滴的8联排管盖上密封盖，转入PCR仪中进行扩增；
检测：将完成PCR扩增的微液滴8联管和微液滴检测芯片分别放入检测芯片机械卡具相对应位置，压下卡具上盖固定芯片，在油孔1和油孔2中分别加入430μL和500μL微液滴检测油，盖上微滴检测芯片密封垫，然后将卡具放入生物芯片分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中脱鳞病毒检测结果。
10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于，所述扩增步骤中，所述扩增的程序为95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，63℃退火60秒，共40个循环；4℃恒温，结束反应，每步都设置1.5℃/秒的变温速度。
CN202210568828.1A 2022-05-24 2022-05-24 脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法 Pending CN114891926A (zh)

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