CN112575118B - 一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法 - Google Patents

一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法，按照如下步骤进行：根据病毒的基因保守片段设计八组特异性引物探针；根据人源核糖核苷酸酶P基因设计一对内参基因引物探针EF、ER、EP；将所有引物探针和PCR所需的物料组合成反应液；在反应液中加入样本核酸后利用PCR扩增技术结合熔解曲线分析在荧光PCR仪上进行扩增；根据不同通道的荧光扩增信号来判读样本是否为阳性，并对阳性的核酸在对应的荧光通道采用熔解曲线分析结果进行分型。

Description

一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法
技术领域：
本发明属于核酸检测技术领域，特别涉及一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法。
背景技术：
腹泻是一种常见的胃肠道症状，一年四季均可发生，我国引起腹泻的病原体大多是轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和札如病毒。诺如病毒是世界范围内引起病毒性腹泻的主要病原体之一，它包含5个基因型，其中感染人的主要包括I型和II型；札如病毒是导致病毒性急性肠胃炎的最常见病毒之一，在婴幼儿当中通常导致轻微的肠胃炎；星状病毒已被证实是引起婴幼儿、老年人、免疫低下者腹泻的重要病原之一；肠道腺病毒属腺病毒亚属的40型和41型，是引起儿童病毒性腹泻的主要病原体之一，病程一般持续7-10天；轮状病毒感染患者表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。根据基因组差异可将轮状病毒分为A-G七组，轮状病毒A组是婴幼儿急性腹泻的主要病原体，也是成人肠胃炎的主要致病因子之一；B组引起的腹泻主要在成年人中流行；C组虽然在腹泻患者中总检出率不高，但其在全球范围仍可引起儿童和成人腹泻散发和暴发。上述这些病原体主要是通过粪-口途径经过消化道进入人体。
目前针对腹泻病毒的检测，实验室常见的检测方法有核酸检测和免疫层析等。其中免疫层析检测是最为常见的一种方法，但其检测准确度却远远不及核酸检测，而核酸检测又因为受到检测荧光数量的影响而无法做到高通量检测。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容：
本发明的目的在于利用PCR扩增结合熔解曲线分析的技术原理，设计特异性引物探针，对疑似腹泻病毒感染的患者做出精准的临床辅助诊断，从而克服上述现有技术中的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法，用于同时检测诺如病毒I型和II型、轮状病毒A型rovA和B型rovB以及C型rovC、星状病毒asv、札如病毒sav、肠道腺病毒eadv，其特征在于：按照如下步骤进行：
S1，根据上述8种病毒的基因保守片段设计八组特异性引物探针；
S2，根据人源核糖核苷酸酶P基因设计一对内参基因引物探针
EF、ER、EP；
S3，将所有引物探针和PCR所需的物料组合成反应液；
S4，在反应液中加入样本核酸后利用PCR扩增技术结合熔解曲线
分析在荧光PCR仪上进行扩增；
S5，根据不同通道的荧光扩增信号来判读样本是否为阳性，并对阳性的核酸在对应的荧光通道采用熔解曲线分析结果进行分型。
优选地，上述技术方案中，步骤S1中针对每一个靶基因设计一条引物1和一条探针以及一条引物2，引物2的设计至少需要包含两部分内容，其一，引物2的3’端即引物2-a段为与模板另一条链完全互补；其二，引物2的5’端即引物2-b段为一段游离寡核苷酸链，引物2-a段与引物1能够与模板正负两条链结合，保证PCR扩增过程能够顺利进行；引物2-b段要能与探针处于半结合状态，该处半结合状态只需保证引物2-b段不能与模板竞争探针即可。当体系中不存在靶基因时，体系中引物探针均处于游离状态，因此扩增阶段探针完整，在后期熔解曲线过程中，探针与引物2-b段结合形成双链结构，熔解曲线升温过程中，双链结构逐渐被打开，随着温度升高，该双链解开，在此过程中探针由双链拉直状态转换为单链卷曲状态，探针上的荧光基团与猝灭集团距离缩短，探针荧光本底信号也会越低，若在该过程进行采光时，则会得到荧光信号逐渐降低的曲线，再将该曲线做负一阶求导，会得到荧光信号变化速率曲线，该曲线最高点则表示该组引物探针检测的靶基因。设计引物2时，可通过调节引物2-b段的碱基或者与探针结合的位置来控制引物2-b段和探针的TM值，通过不同的TM值可实现单通道检测多个靶基因。
当体系中存在靶基因时，因探针跟靶基因结合能力大于与引物2-b段结合的能力，因此探针优先与靶基因结合，扩增过程中探针被水解掉，荧光能量共振转移被破坏，因此在扩增阶段体系中会检测到扩增信号，在后期熔解曲线过程时，因探针被水解消耗掉，因此引物2-b段无法形成双链结构，所以不会做出荧光信号变化速率曲线图(与阴性比较时，对应的峰消失)。
综上所述检测结果，当扩增阶段有信号，并且熔解曲线分析对应的靶基因峰消失时，可对该样本判读为对应的靶基因阳性。
优选地，上述技术方案中，FAM通道熔解曲线分析对应的靶基因依次为：rovC、asv、rovB、GI。VIC通道熔解曲线分析对应的靶基因依次为rovA、sav、GII、eadv。
8组用于快速检测腹泻病毒的特异性引物和探针，包括：
(1)rovA序列如下：
引物1：5’-TTGGACCWTCTGATTCTGC-3’，
引物2：5’-GGTTAAGATAAATGCGAATCCATAGACAC-3’，
探针，5’端带VIC荧光素标记:
5’-VIC-TCTGCATTTGTCTTAACCGCAT-BHQ1-3’；
(2)rovB序列如下：
引物2：5’-ACTGTGATATTCAACTTGCCTCGTGGAGAAG-3’，
引物1：5’-CGCCAGTGGATATTTC-3’，
探针，5’端带FAM荧光素标记:5’-FAM-AAAGTTGAGTATCACAGTACATT-MGB-3’；
(3)rovC序列如下：
引物1：5’-ATAAATTCAGTAGAAATGAC-3’，
引物2：5’-CAGATATCAGAATGGATGTCATCACATCTCCAAA-3’，探针，5’端带FAM荧光素标记：5’-FAM-CCATTCTGCTATCTGTTCAA-BHQ1-3’；
(4)GI序列如下：
引物1：5’-CCGCTGGATGCGCTTC-3’，
引物2：5’-CGATCTCCCCTTAGACGCCATCATC-3’，
探针，5’端带FAM荧光素标记：5’-FAM-TGGACAGGAGATCG-BHQ1-3’；
(5)GII序列如下：
引物2：5’-GGCTATCGCAATGACGCCATCTTCATTC-3’，
引物1：5’-GGCATGGACTTTTACGTG-3’，
探针，5’端带VIC荧光素标记：5’-VIC-ATTGCGATCGCCCTCC-BHQ1-3’；
(6)asv序列如下：
引物1：5’-GGCTCTCGCCACCTAC-3’，
引物2：5’-TTGAAATGGTGGCCTCCATCTCAAACACT-3’，
探针，5’端带FAM荧光素标记：5’-FAM-CCTCCATTTCAAACACT-BHQ1-3’；
(7)sav序列如下：
引物1：5’-ATCGTGAGACATTCCTTGAT-3’，
引物2：5’-AAGATGATTATGGCTGCAAATTCTACATCATCACC-3’，
探针，5’端带VIC荧光素标记：5’-VIC-CCCAGCCATCATCATCTTCATC-BHQ1-3’；
(8)eadv序列如下：
引物2：5’-CCCATGTTTCCTACCCTTTCCAGCATAATAACTC-3’，
引物1：5’-TTCTGAGTCAGGCTTGG-3’，
探针，5’端带VIC荧光素标记：5’-VIC-TTGTAGGATACATGGGACC-MGB-3’；
引物2中，画底线部分为引物2的2-b段，其余部分为引物2的2-a段。
一种用于快速检测八种腹泻病毒的试剂盒，包括如上所述的引物探针组合物的检测液。
优选地，上述技术方案中，还包括核酸扩增反应液反应液、酶混合液、空白对照、阳性对照。
优选地，上述技术方案中，核酸扩增反应液反应液包括缓冲液、Mg2+、dNTPs。
优选地，上述技术方案中，酶混合液包括RNA逆转录酶、DNA聚合酶。
优选地，上述技术方案中，阳性对照为人工合成的基因。
优选地，上述技术方案中，空白对照为灭菌的去RNA酶水。
一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法，具体包括如下步骤：
1)模板核酸提取：采用试剂盒提取待检样本中的核酸；
2)实时荧光PCR扩增反应：在100μl或200μl PCR管配制反应体系：引物探针组合物10μl，核酸扩增反应液10μl，酶混合液5μl，模板DNA 5μl，将上述反应管于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
步骤①50℃×30min，95℃×20min，1cycles；
步骤②95℃×10sec，60℃×40sec，8cycles；
步骤③95℃×10sec，55℃×30sec,58℃×15sec，35cycles；
在步骤③55℃×30sec时对FAM、VIC、CY5通道进行荧光信号采集；
3)结果分析：
每个样本孔的分析都需与阴性对照孔进行熔解曲线图谱对比确定结果。
4)结果判读：
4.1)阳性判断值：
通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数Youden index确定阳性判断值。
阳性：检测结果Ct≤30且熔解曲线图谱与空白对照有显著差异；
阴性：Ct＞30或者未检出；
4.2)对结果进行判读：
a)检测结果需同时满足一下两个条件：需要满足扩增曲线信号为阳性；同时对应检测通道的熔解曲线分析可确定病原体型别，则样本可判读为阳性，且根据熔解曲线分析确定具体型别；
b)检测结果扩增阶段为阴性，则样本判读为阴性；
检测结果仅满足扩增曲线信号为阴性，但对应检测通道的熔解曲线分析为阴性时，建议样本复检，若仍为该结果，则该样本判读为阴性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
a)方便快捷，能在一个荧光通道内实现多靶标基因检测，大大提高了核酸检测的通量，适用于筛查。
b)根据扩增结果判读阴阳性，然后根据熔解曲线结果对阳性样本分型，结果判读简单便捷，判读结果更为准确。
c)可提供本方法所配套的结果判读软件，有助于检测大批样本时的结果判读。
d)具有较高的特异性，与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其他病原体(沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠杆菌、小肠结肠耶尔森菌、空肠弯曲菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌)以及人的总核酸无交叉反应。
e)检测灵敏度高，最低可检测出1000copies/ml的腹泻病毒核酸。
f)本发明对疑似病毒感染的腹泻患者的诊断与治疗具有较高的辅助诊断作用，适用于推广。
附图说明：
图1为半结合状态参考图；
图2为本发明检测原理图；
图3为阳性对照、阴性对照检测的荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图4为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的rovA样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图5为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的rovB样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图6为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的rovC样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图7为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的GI样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图8为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的GII样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图9为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的asv样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图10为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的sav样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图11为粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的eadv样本荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图；
图12为特异性分析。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明所有引物探针设计原理如下所示：
本发明针对每一个靶基因都需要设计一条常规引物(以下简称引物1)和一条常规的荧光探针(以下简称探针)以及一条熔解曲线引物(以下简称引物2)，引物1和探针正常设计即可，并没有其他特殊要求；而引物2的设计至少需要包含两部分内容，其一，引物2的3’端为与模板另一条链完全互补(以下简称引物2-a段)；其二，引物2的5’端为一段游离寡核苷酸链(以下简称引物2-b段)，引物2-a段与引物1能够与模板正负两条链结合，保证PCR扩增过程能够顺利进行；引物2-b段要能与探针处于半结合状态，该处半结合状态只需保证引物2-b段不能与模板竞争探针即可。上述半结合状态可参考如下图1所示的三种情况。
本发明原理如下所示：当体系中不存在靶基因时，体系中引物探针均处于游离状态，因此扩增阶段探针完整，在后期熔解曲线过程中，探针与引物2-b段结合形成双链结构，熔解曲线升温过程中，双链结构逐渐被打开，随着温度升高，该双链解开，在此过程中探针由双链拉直状态转换为单链卷曲状态，探针上的荧光基团与猝灭基团距离缩短，探针荧光本底信号也会越低，若在该过程进行采光时，则会得到荧光信号逐渐降低的曲线，再将该曲线做负一阶求导，会得到荧光信号变化速率曲线，该曲线最高点则表示该组引物探针检测的靶基因。设计引物2时，可通过调节引物2-b段的碱基或者与探针结合的位置来控制引物2-b段和探针的TM值，通过不同的TM值可实现单通道检测多个靶基因。
当体系中存在靶基因时，因探针跟靶基因结合能力大于与引物2-b段结合的能力，因此探针优先与靶基因结合，扩增过程中探针被水解掉，荧光能量共振转移被破坏，因此在扩增阶段体系中会检测到扩增信号，在后期熔解曲线过程时，因探针被水解消耗掉，因此引物2-b段无法形成双链结构，所以不会做出荧光信号变化速率曲线图(与阴性比较时，对应的峰消失)。
综上所述检测结果，当扩增阶段有信号，并且熔解曲线分析对应的靶基因峰消失时，可对该样本判读为对应的靶基因阳性。
本发明检测原理如下图2所示：
图2：体系中不存在靶基因时的熔解曲线图(左)和体系中存在靶基因时的扩增曲线过程图(中)、熔解曲线模式图(右)。
一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法，具体包括如下步骤：
(1)模板核酸提取：提取待检样本中的核酸，可使用以下提取试剂，硕世生物公司的病毒核酸提取试剂盒(货号：SDK60104、SDK60105)，按照试剂盒说明书操作。
(2)实时荧光PCR扩增反应：在100μl或200μl PCR管配制反应体系：引物探针组合物10μl，核酸扩增反应液10μl，酶混合液5μl，模板DNA 5μl，将上述反应管于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
步骤①50℃×30min，95℃×20min(1cycles)
步骤②95℃×10sec，60℃×40sec(8cycles)
步骤③95℃×10sec，55℃×30sec,58℃×15sec(35cycles)
在步骤③55℃×30sec时对FAM、VIC、CY5通道进行荧光信号采集；ABI7500实时荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。)
核酸扩增反应液、酶混合液均为上海硕颖生物公司所购买，其中核酸扩增反应液的货号为CSBF-004，酶混合液的货号为：CSEN-003。
实时荧光PCR仪可选择ABI7500/7500fast、QuantStudioTM5、Bio-Rad CFX96TM、上海宏石SLAN-96P/S、Roche LightCycler480Ⅱ等荧光定量PCR仪。
(3)结果分析：
AB17500结果分析:
选择主界面左侧菜单栏Setup中的"Plate Setup",在“AssignTargets andSamples"中选择分析的荧光通道，依次选择FAM、VIC通道，点击"Reanalyse",然后选择主界面左侧菜单栏Analysis中的"Melt curve"(每次仅对1个通道分析)，即可进行熔解曲线分析，每个样本孔的分析都需与阴性对照孔进行熔解曲线图谱对比确定结果。
SLAN96-P/S结果分析:
选择“熔解峰值曲线”,依次选择FAM、VIC通道即可进行相应通道熔解曲线分析，每个样本孔的分析都需与阴性对照孔进行熔解曲线图谱对比确定结果。在该界面中点击鼠标右键选择坐标缩放”选项，可对Y轴的最大值和最小值根据熔解曲线峰值进行相应调整，获得更合适的熔解曲线特征峰形图。
Roche LightCycler480Ⅱ结果分析:
选择“Melt Curve Genotyping”",然后依次选择FAM、VIC通道即可进行相应通道熔解曲线分析，每个样本孔的分析都需与阴性对照孔进行熔解曲线图谱对比确定结果。
(4)结果判读：
(4.1)阳性判断值：
本发明通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数(Youden index)确定阳性判断值。
阳性：检测结果Ct≤30且熔解曲线图谱与空白对照有显著差异。
阴性：Ct＞30或者未检出。
(4.2)对结果进行判读：
a.检测结果需同时满足一下两个条件：需要满足扩增曲线信号为阳性；同时对应检测通道的熔解曲线分析可确定病原体型别，则样本可判读为阳性，且根据熔解曲线分析确定具体型别。
b.检测结果扩增阶段为阴性，则样本判读为阴性。
c.检测结果仅满足扩增曲线信号为阴性，但对应检测通道的熔解曲线分析为阴性时，建议样本复检，若仍为该结果，则该样本判读为阴性。
本发明FAM通道熔解曲线分析对应的靶基因依次为：rovC、asv、rovB、GI。VIC通道熔解曲线分析对应的靶基因依次为rovA、sav、GII、eadv。
实施例1：引物、探针设计：
通过NCBI查找rovA、rovB、rovC、GI、GII、asv、sav、eadv、人源核糖核苷酸酶P基因序列，通过BioEdit进行序列比较，根据3.2.1所述的技术原理，采用Primer Express 3.0.1设计引物和探针，BLAST确认引物探针特异性，得到内参基因引物探针和八种病原体分别对应的引物1、引物2、探针。
本发明所需特异性引物、探针包括：
(1)扩增rovA的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
RovA-F：5’-TTGGACCWTCTGATTCTGC-3’，
RovA-R：5’-GGTTAAGATAAATGCGAATCCATAGACAC-3’，
RovA-P:(VIC荧光素标记)：5’-VIC-TCTGCATTTGTCTTAACCGCAT-BHQ1-3’，
(2)扩增rovB的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
RovB-F：5’-ACTGTGATATTCAACTTGCCTCGTGGAGAAG-3’，
RovB-R：5’-CGCCAGTGGATATTTC-3’，
RovB-P:(FAM荧光素标记)：5’-FAM-AAAGTTGAGTATCACAGTACATT-MGB-3’，
(3)扩增rovC的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
rovC-F：5’-ATAAATTCAGTAGAAATGAC-3’，
rovC-R：5’-CAGATATCAGAATGGATGTCATCACATCTCCAAA-3’，
rovC-P:(FAM荧光素标记)：5’-FAM-CCATTCTGCTATCTGTTCAA-BHQ1-3’，
(4)扩增GI的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
GI-F：5’-CCGCTGGATGCGCTTC-3’，
GI-R：5’-CGATCTCCCCTTAGACGCCATCATC-3’，
GI-P:(FAM荧光素标记)：5’-FAM-TGGACAGGAGATCG-BHQ1-3’，
(5)扩增GII的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
GII-F：5’-GGCTATCGCAATGACGCCATCTTCATTC-3’，
GII-R：5’-GGCATGGACTTTTACGTG-3’，
GII-P:(VIC荧光素标记)：5’-VIC-ATTGCGATCGCCCTCC-BHQ1-3’，
(6)扩增asv的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
asv-F：5’-GGCTCTCGCCACCTAC-3’，
asv-R：5’-TTGAAATGGTGGCCTCCATCTCAAACACT-3’，
asv-P:(FAM荧光素标记)：5’-FAM-CCTCCATTTCAAACACT-BHQ1-3’，
(7)扩增sav的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
sav-F：5’-ATCGTGAGACATTCCTTGAT-3’，
sav-R：5’-AAGATGATTATGGCTGCAAATTCTACATCATCACC-3’，
sav-P:(VIC荧光素标记)：5’-VIC-CCCAGCCATCATCATCTTCATC-BHQ1-3’，
(8)扩增eadv的引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为300nM、300nM、100nM，序列如下：
eadv-F：5’-CCCATGTTTCCTACCCTTTCCAGCATAATAACTC-3’，
eadv-R：5’-TTCTGAGTCAGGCTTGG-3’，
eadv-P:(VIC荧光素标记)：5’-VIC-TTGTAGGATACATGGGACC-MGB-3’，
(9)扩增内参基因引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为200nM、200nM、100nM，序列如下：
EF：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’，
ER：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’，
EP:(VIC荧光素标记)：5’-VIC-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3’。
实施例2：模板核酸的提取：
(1)样本的采集，包括粪便样本的采集，具体采集方法可参考临床检验中心对粪便样本的采集方法
(2)将上述采集好的样本按照核酸提取试剂盒说明书进行提取核酸，可使用以下提取试剂盒：硕世生物公司的病毒核酸提取试剂盒(货号：SDK60104、SDK60105)提取。
实施例3：引物探针检测液和反应液的配制：
(1)引物探针检测液的配制：
(3)反应液的配制：
名称 体积(μl/test)
核酸扩增反应液反应液 10
酶混合液 5
引物探针检测液 10
模板 5
总体积 30
实施例4：扩增程序：
步骤①50℃×30min，95℃×20min(1cycles)
步骤②95℃×10sec，60℃×40sec(8cycles)
步骤③95℃×10sec，55℃×30sec,58℃×15sec(35cycles)
在步骤③55℃×30sec时对FAM、VIC、CY5通道进行荧光信号采集；ABI7500实时荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。)
实施例5：结果判读：
a.检测结果需同时满足一下两个条件：需要满足扩增曲线信号为阳性；同时对应检测通道的熔解曲线分析可确定病原体型别，则样本可判读为阳性，且根据熔解曲线分析确定具体型别。
b.检测结果扩增阶段为阴性，则样本判读为阴性。
c.检测结果仅满足扩增曲线信号为阴性，但对应检测通道的熔解曲线分析为阳性时，建议样本复检，若仍为该结果，则该样本判读为阴性。
本发明FAM通道熔解曲线分析对应的靶基因温度从低到高依次为：rovC、asv、rovB、GI；VIC通道熔解曲线分析对应的靶基因温度从低到高依次为rovA、sav、GII、eadv。
实例6：说明
图12为特异性分析，分别对粪便样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)提取检测的沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠杆菌、小肠结肠耶尔森菌、空肠弯曲菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌及其人类白细胞采用硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取检测，检测结果如表1所示，荧光PCR扩增曲线图如图12所示。
表1：特异性分析：
。
基于实时荧光PCR检测的rovA、rovB、rovC、GI、GII、asv、sav、eadv最低检测限的确认，采用硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60105)分别提取rovA、rovB、rovC、GI、GII、asv、sav、eadv核酸，然后采用数字PCR技术对提取的核酸进行绝对定量，然后将确定浓度的核酸稀释至10000copies、1000copies、100copies进行检测，每个梯度做10个重复。检测结果如表2所示。
表2：最低检测限确认：
/>
。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 江苏硕世生物科技股份有限公司
<120> 一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法
<141> 2020-07-14
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaagttgagt atcacagtac att 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ataaattcag tagaaatgac 20
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagatatcag aatggatgtc atcacatctc caaa 34
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccattctgct atctgttcaa 20
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgctggatg cgcttc 16
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgatctcccc ttagacgcca tcatc 25
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggacaggag atcg 14
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggctatcgca atgacgccat cttcattc 28
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcatggact tttacgtg 18
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
attgcgatcg ccctcc 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggctctcgcc acctac 16
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgaaatggt ggcctccatc tcaaacact 29
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctccatttc aaacact 17
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcgtgagac attccttgat 20
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aagatgatta tggctgcaaa ttctacatca tcacc 35
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccagccatc atcatcttca tc 22
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccatgtttc ctaccctttc cagcataata actc 34
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttctgagtca ggcttgg 17
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttgtaggata catgggacc 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims (4)

1.一种用于快速检测腹泻病毒的引物探针组合物，其特征在于：包括：
（1）rovA序列如下：
引物1：5’- TTGGACCWTCTGATTCTGC -3’，
引物2：5’- GGTTAAGATAAATGCGAATCCATAGACAC -3’，
探针，5’端带VIC荧光素标记: 5’-VIC-TCTGCATTTGTCTTAACCGCAT-BHQ1-3’；
（2）rovB序列如下：
引物2：5’- ACTGTGATATTCAACTTGCCTCGTGGAGAAG-3’，
引物1：5’- CGCCAGTGGATATTTC-3’，
探针，5’端带FAM荧光素标记: 5’-FAM- AAAGTTGAGTATCACAGTACATT-MGB-3’；
（3）rovC序列如下：
引物1：5’- ATAAATTCAGTAGAAATGAC-3’，
引物2：5’- CAGATATCAGAATGGATGTCATCACATCTCCAAA-3’，
探针，5’端带FAM荧光素标记：5’-FAM- CCATTCTGCTATCTGTTCAA-BHQ1-3’；
（4）GI序列如下：
引物1：5’- CCGCTGGATGCGCTTC-3’，
引物2：5’- CGATCTCCCCTTAGACGCCATCATC-3’，
探针，5’端带FAM荧光素标记：5’-FAM- TGGACAGGAGATCG-BHQ1-3’；
（5）GII序列如下：
引物2：5’- GGCTATCGCAATGACGCCATCTTCATTC-3’，
引物1：5’- GGCATGGACTTTTACGTG-3’，
探针， 5’端带VIC荧光素标记：5’-VIC- ATTGCGATCGCCCTCC-BHQ1-3’；
（6）asv序列如下：
引物1：5’- GGCTCTCGCCACCTAC-3’，
引物2：5’- TTGAAATGGTGGCCTCCATCTCAAACACT-3’，
探针， 5’端带FAM荧光素标记：5’-FAM- CCTCCATTTCAAACACT-BHQ1-3’；
（7）sav序列如下：
引物1：5’- ATCGTGAGACATTCCTTGAT-3’，
引物2：5’-AAGATGATTATGGCTGCAAATTCTACATCATCACC-3’，
探针， 5’端带VIC荧光素标记：5’-VIC- CCCAGCCATCATCATCTTCATC-BHQ1-3’；
（8）eadv序列如下：
引物2：5’-CCCATGTTTCCTACCCTTTCCAGCATAATAACTC-3’，
引物1：5’- TTCTGAGTCAGGCTTGG-3’，
探针， 5’端带VIC荧光素标记：5’-VIC- TTGTAGGATACATGGGACC-MGB-3’；
引物2中，画底线部分为引物2的2-b段，其余部分为引物2的2-a段；
引物2的设计至少需要包含两部分内容，其一，引物2的3’端即引物2-a段为与模板另一条链完全互补；其二，引物2的5’端即引物2-b段为一段游离寡核苷酸链，引物2-a段与引物1能够与模板正负两条链结合，保证PCR扩增过程能够顺利进行；引物2-b段要能与探针处于半结合状态，该处半结合状态只需保证引物2-b段不能与模板竞争探针即可。
2.一种用于快速检测八种腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物探针组合物的检测液。
3.根据权利要求2所述的用于快速检测八种腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：还包括核酸扩增反应液、酶混合液、空白对照、阳性对照。
4.根据权利要求3所述的用于快速检测八种腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增反应液包括缓冲液、Mg2+、dNTPs；所述酶混合液包括RNA逆转录酶、DNA聚合酶；所述阳性对照为人工合成的基因；所述空白对照为灭菌的去RNA酶水。
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