CN113637802A - 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法 - Google Patents

一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113637802A
CN113637802A CN202110972334.5A CN202110972334A CN113637802A CN 113637802 A CN113637802 A CN 113637802A CN 202110972334 A CN202110972334 A CN 202110972334A CN 113637802 A CN113637802 A CN 113637802A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhabdovirus
kit
weever
ddpcr
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110972334.5A
Other languages
English (en)
Inventor
林强
李宁求
黄丹妮
付小哲
刘礼辉
梁红茹
罗霞
牛银杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Original Assignee
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pearl River Fisheries Research Institute CAFS filed Critical Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority to CN202110972334.5A priority Critical patent/CN113637802A/zh
Publication of CN113637802A publication Critical patent/CN113637802A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及水生动物病毒检测技术领域，尤其涉及一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。本发明利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒包括引物和特异性探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明的试剂盒与微滴数字PCR结合使用检测鲈弹状病毒，检测的灵敏度高，不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接判读样品中鲈弹状病毒的核酸拷贝数，极大的简化了操作步骤。

Description

一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及水生动物病毒检测技术领域，尤其涉及一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。
背景技术
鲈弹状病毒是危害大口黑鲈、鳜鱼等名优鱼类养殖产业的重大病原之一，它是一种在自然界广泛分布的有囊膜的、单股负链单链RNA病毒，感染宿主广、种类多，能引起多种淡水和海水鱼类出现严重的出血性败血症。通过比对发现，鲈弹状病毒与从乌鳢、鳜鱼、笋壳鱼上分离到的弹状病毒都属于弹状病毒科(Rhabdovirus)，鲈弹状病毒属(Perhabdovirus)。鲈弹状病毒有很高的传染性和致病性，可以通过亲本垂直传播和通过水源、鱼饵、带毒鱼、鱼卵、寄生虫进行水平传播。我们通过流行病学调查发现，鲈弹状病毒主要感染苗种，死亡率可达100％。为了尽早的发现鲈弹状病毒，及时切断病毒的传播，急需建立一种高灵敏度的检测方法。
聚合酶链反应(PCR)、间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)和环介导等温扩增(LAMP)等检测方法灵敏度高、操作简便，但是不能对结果进行定量分析，荧光定量PCR(qPCR)可以做定量分析，但是需要额外的标准品和标准曲线，且对低浓度病毒的定量结果较不稳定，无法在病毒低含量样品实现精准检测。微滴式数字PCR(ddPCR)是20世纪末，Vogelstein等提出的一项核酸定量检测新技术。该方法是对各个反应单元的荧光信号进行判读，根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度。与传统的定量PCR相比，ddPCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析，精确度和灵敏度更佳。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。本发明采用设计的特异性引物和探针与数字PCR结合的方式来检测鲈弹状病毒，将ddPCR技术用于鲈弹状病毒的检测，可以实现快速、准确的对鲈弹状病毒核酸进行绝对定量。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物和特异性探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示；所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒包括无RNA酶的蒸馏水、一步法ddPCR探针法预混液、探针法ddPCR微滴发生油、质控液、阴性对照和阳性对照。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述一步法ddPCR探针法预混液包括：DNA聚合酶预混液、上游引物、下游引物、特异性探针和无RNA酶蒸馏水。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述一步法ddPCR探针法预混液的总体积为950μL时具体包括：500μL DNA聚合酶预混液、50μL上游引物、50μL下游引物、50μL特异性探针和300μL的无RNA酶蒸馏水。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述阳性对照为含有鲈弹状病毒基因组的质粒；所述阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述引物和特异性探针的浓度均为10μM。
本发明同时提供一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的方法，所述方法为利用所述的试剂盒通过数字PCR技术进行检测。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述检测鲈弹状病毒的方法具体包括以下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板；
(2)配制ddPCR反应液，体积20μL，其配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μL，待测样品cDNA模板为2μL；
(3)制备微滴，按照液滴发生板上标记位置，分别在样品孔和油位孔加入ddPCR反应液20μL和微滴发生油70μL，然后将固定有微滴发生卡的底座置于微滴发生仪中生成微滴；将液滴生成孔中生成的微滴以一一对应的方式全部转入96孔板，用热封仪进行封膜；
(4)将封好膜的96孔板转入PCR仪中进行扩增；
(5)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中鲈弹状病毒检测结果。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(4)中所述扩增的程序为：95℃预变性10min；94℃变性30秒，53-65℃退火60秒，共40个循环；98℃10min，4℃恒温，结束反应，每步都设置2.5℃/秒的降温速度。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述退火的温度为59℃。
本发明的有益效果：
本发明采用微滴数字PCR技术检测鲈弹状病毒病毒，检测的灵敏度高，不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接判读样品中鲈弹状病毒的核酸拷贝数，极大的简化了操作步骤。
附图说明
图1为本发明实施例3验证本发明引物和探针的特异性实验结果示意图；其中，B10表示：神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)；C10表示：大口黑鲈双RNA病毒(Largemouth bass birnavirus，LBBV)；D10表示：鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia ofcarp virus，SVCV)；E10表示：草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)；F10表示：传染性脾肾坏死病毒(Infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)；G10表示：大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass Virus，LMBV)；F09表示：阴性对照组(无RNA酶蒸馏水)；A09表示：鲈弹状病毒阳性质粒。
图2为本发明实施例4对检测鲈弹状病毒的数字PCR检测方法的退火温度优化结果示意图；其中，A05表示：65℃；B05表示：64.3℃；C05表示：63℃；D05表示：61.4℃；E05表示：59℃；F05表示：57℃；G05表示：55.7℃；H05表示53℃。
图3为本发明实施例5验证试剂盒中的引物和特异性探针以及检测方法的灵敏度实验结果示意图；其中，A07表示：2×104copies/μL；B07表示：2×103copies/μL；C07表示：2×102copies/μL；D07表示：2×101copies/μL；E07表示：2×100copies/μL；F07表示：阴性对照组(无RNA酶蒸馏水)。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1
本实施例提供一种用于检测鲈弹状病毒的数字PCR检测试剂盒，包括无RNA酶的蒸馏水，一步法ddPCR探针法预混液，探针法ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。
其中，一步法ddPCR探针法预混液包括：500μL的DNA聚合酶预混液，上、下游引物分别为50μL，特异探针为50μL，引物和探针的浓度均为10μM，以及无RNA酶蒸馏水300μL，总体积为950μL。
阳性对照为含有鲈弹状病毒基因组的质粒，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
引物和探针核苷酸序列分别如下：
F：CTGTCGCAGCTGAAGTGGAG(SEQ ID NO:1)；
R：AGGCCGATTGTCCCCATGTA(SEQ ID NO:2)；
Probe：FAM-TGATGAAACCAGGCCAAGAGATTG-MGB(SEQ ID NO:3)。
实施例2
本实施例提供一种用于检测鲈弹状病毒的数字PCR检测方法，采用实施例1的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板。
(2)配制ddPCR反应液，体积20μL，其配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μL(其中包含引物、探针和无RNase酶蒸馏水)，待测样品cDNA模板为2μL。
(3)制备微滴，按照液滴发生板上标记位置，分别在样品孔和油位孔加入ddPCR反应液20μL和微滴发生油70μL，然后将固定有微滴发生卡的底座置于微滴发生仪中生成微滴；将液滴生成孔中生成的微滴(一般在42μL左右)以一一对应的方式全部转入96孔板，用热封仪进行封膜。
(4)将封好膜的96孔板转入PCR仪中进行扩增，PCR扩增程序为95℃预变性10min；94℃变性30sec，59℃退火60sec，共40个循环；98℃10min，4℃恒温，结束反应，每步都设置2.5℃/sec的降温速度。
(5)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中鲈弹状病毒检测结果。
实施例3
本实施例验证本发明提供的检测引物和探针的特异性，具体操作如下：
利用实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法，对待测病毒cDNA或DNA进行检测，同时设置鲈弹状病毒阳性对照组和阴性对照组(无RNA酶蒸馏水)，使用的待测病毒核酸包括神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)、大口黑鲈双RNA病毒(Largemouthbass birnavirus，LBBV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)、传染性脾肾坏死病毒(Infection spleenand kidney necrosis virus，ISKNV)、大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass Virus，LMBV)。
实验结果如图1所示，仅阳性对照组可检测到信号，其余各组均无信号为阴性，说明本发明的引物和探针具有良好的特异性。
实施例4
本实施例对检测鲈弹状病毒的数字PCR检测方法的退火温度进行了优化，具体操作如下：
利用实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法，形成微滴，上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，53-65℃退火60sec(仪器自动分布8个温度梯度，分别为65℃、64.3℃、63℃、61.4℃、59℃、57℃、55.7℃、53℃)，共40个循环；98℃10min结束反应。使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数。
实验结果如图2所示，退火温度65℃、64.3℃、63.3℃、61.4℃、59℃、57℃、55.7℃、53℃对应的拷贝数分别为10copies，0copies，11copies，79copies/μL，105copies，101copies，99copies，98copies。因此，根据结果显示选择59℃为本发明的最佳退火温度。
实施例5
本实施例验证了本发明试剂盒中的引物和特异性探针以及检测方法的灵敏度，具体操作如下：
本实验采用鲈弹状病毒阳性质粒进行10倍梯度连续稀释，共设置5个梯度(2×104copies/μL、2×103copies/μL、2×102copies/μL、2×101copies/μL、2×100copies/μL)，按照实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法进行检测。
实验结果如图3所示，本发明建立的ddPCR检测方法最低检出限为4copies/μL个拷贝数。
实施例6
采用ddPCR和TaqMan荧光定量PCR方法分别检测广东省内采集的20个大口黑鲈和鳜鱼苗种样品中的鲈弹状病毒，比较两种方法的检测准确性和灵敏度。结果如表1所示，实验数据结果表明ddPCR检测到15份阳性样品，而TaqMan荧光定量只检测到9份阳性样品，qPCR检测到的阳性样品ddPCR均得到一致的检查结果；在11份TaqMan荧光定量检测方法结果为阴性的样品中，其中ddPCR检测方法检测出6份阳性，病毒拷贝数在3.8-9.8之间，实验结果表明ddPCR检测鲈弹状病毒的灵敏度更高，在检测低病毒载量的样品中更具有优势。
表1 ddPCR和qPCR样品检测结果
Figure BDA0003226159320000071
注：-表示Negative-。
表1的检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量，与其他定量PCR检测方法相比结果更加准确可靠。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法
<130> 2021.8.10
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgtcgcagc tgaagtggag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggccgattg tccccatgta 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgatgaaacc aggccaagag attg 24

Claims (10)

1.一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物和特异性探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括无RNA酶的蒸馏水、一步法ddPCR探针法预混液、探针法ddPCR微滴发生油、质控液、阴性对照和阳性对照。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探针法预混液包括：DNA聚合酶预混液、上游引物、下游引物、特异性探针和无RNA酶蒸馏水。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探针法预混液的总体积为950μL时具体包括：500μL DNA聚合酶预混液、50μL上游引物、50μL下游引物、50μL特异性探针和300μL的无RNA酶蒸馏水。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有鲈弹状病毒基因组的质粒；所述阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和特异性探针的浓度均为10μM。
7.一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1-6任一项所述的试剂盒通过数字PCR技术进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测鲈弹状病毒的方法具体包括以下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板；
(2)配制ddPCR反应液，体积20μL，其配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μL，待测样品cDNA模板为2μL；
(3)制备微滴，按照液滴发生板上标记位置，分别在样品孔和油位孔加入ddPCR反应液20μL和微滴发生油70μL，然后将固定有微滴发生卡的底座置于微滴发生仪中生成微滴；将液滴生成孔中生成的微滴以一一对应的方式全部转入96孔板，用热封仪进行封膜；
(4)将封好膜的96孔板转入PCR仪中进行扩增；
(5)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中鲈弹状病毒检测结果。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增的程序为：95℃预变性10min；94℃变性30秒，53-65℃退火60秒，共40个循环；98℃10min，4℃恒温，结束反应，每步都设置2.5℃/秒的降温速度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述退火的温度为59℃。
CN202110972334.5A 2021-08-24 2021-08-24 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法 Pending CN113637802A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110972334.5A CN113637802A (zh) 2021-08-24 2021-08-24 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110972334.5A CN113637802A (zh) 2021-08-24 2021-08-24 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113637802A true CN113637802A (zh) 2021-11-12

Family

ID=78423464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110972334.5A Pending CN113637802A (zh) 2021-08-24 2021-08-24 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113637802A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114592091A (zh) * 2022-03-18 2022-06-07 杭州奥盛仪器有限公司 一种用于加州鲈鱼弹状病毒检测的试剂盒及其检测方法
CN114891926A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 珠海市现代农业发展中心(珠海市金湾区台湾农民创业园管理委员会、珠海市农渔业科研与推广中心) 脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103397106A (zh) * 2013-07-18 2013-11-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 杂交鳢弹状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN109762939A (zh) * 2019-02-02 2019-05-17 中国水产科学研究院珠江水产研究所 用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒
CN110551845A (zh) * 2019-08-12 2019-12-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒
CN111733283A (zh) * 2020-04-28 2020-10-02 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光pcr检测试剂盒
CN112063750A (zh) * 2020-08-17 2020-12-11 河海大学 一组鳜鲈弹状病毒的lamp检测引物组及其应用、一种检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103397106A (zh) * 2013-07-18 2013-11-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 杂交鳢弹状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN109762939A (zh) * 2019-02-02 2019-05-17 中国水产科学研究院珠江水产研究所 用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒
CN110551845A (zh) * 2019-08-12 2019-12-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒
CN111733283A (zh) * 2020-04-28 2020-10-02 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光pcr检测试剂盒
CN112063750A (zh) * 2020-08-17 2020-12-11 河海大学 一组鳜鲈弹状病毒的lamp检测引物组及其应用、一种检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PENG JIA等: "Analytical validation of a reverse transcriptase droplet digital PCR (RT-ddPCR) for quantitative detection of infectious hematopoietic necrosis virus", 《J VIROL METHODS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114592091A (zh) * 2022-03-18 2022-06-07 杭州奥盛仪器有限公司 一种用于加州鲈鱼弹状病毒检测的试剂盒及其检测方法
CN114592091B (zh) * 2022-03-18 2023-11-03 杭州奥盛仪器有限公司 一种用于加州鲈鱼弹状病毒检测的试剂盒及其检测方法
CN114891926A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 珠海市现代农业发展中心(珠海市金湾区台湾农民创业园管理委员会、珠海市农渔业科研与推广中心) 脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kuo et al. Real-time quantitative PCR assay for monitoring of nervous necrosis virus infection in grouper aquaculture
CN113637802A (zh) 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法
CN105907893B (zh) 一种荧光定量pcr检测试剂及其制备方法和应用
Tang et al. Rapid Detection of Tembusu Virus by Reverse‐Transcription, Loop‐mediated Isothermal Amplification (RT‐LAMP)
CN110551845B (zh) 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒
CN108676920B (zh) 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法
CN110777221A (zh) 非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒
CN111304371B (zh) 非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒
CN110846438A (zh) 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测
CN110643745A (zh) 一种用于检测猫杯状病毒和猫细小病毒的组合物、试剂盒及其应用
CN114134252B (zh) 用于检测冠状病毒的引物和试剂盒
Tang et al. Whole genome alignment based one-step real-time RT-PCR for universal detection of avian orthoreoviruses of chicken, pheasant and turkey origins
Liu et al. Development and validation of one-step SYBR green real-time RT-PCR for the rapid detection of newly emerged duck Tembusu virus
CN107699635B (zh) 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法
Zeng et al. A one‐step molecular biology method for simple and rapid detection of grass carp Ctenopharyngodon idella reovirus (GCRV) HZ08 strain
CN110257561B (zh) 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN111926113A (zh) 一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法
Hu et al. Simultaneous typing of seven porcine pathogens by multiplex PCR with a GeXP analyser
Rasmussen et al. Quantitative multiplex assay for simultaneous detection and identification of Indiana and New Jersey serotypes of vesicular stomatitis virus
CN1311084C (zh) 利用嵌合噬菌体标准物的高灵敏基因组检测
CN114381551B (zh) 一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针及试剂盒
CN111893218B (zh) 用于鸭丙型肝炎病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
Sung et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid and sensitive detection of nervous necrosis virus in groupers
CN105039593A (zh) 一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒及应用
Luan et al. A sensitive triple nanoparticle-assisted PCR assay for detection of fowl adenovirus, infectious bursal disease virus and chicken anemia virus

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211112