CN115896354A

CN115896354A - 一种同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN115896354A
Application number: CN202211639136.8A
Authority: CN
Inventors: 周咏松; 梅兴林; 汪劲能; 李娟�
Original assignee: Shanghai Xiongtu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Xiongtu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-20
Filing date: 2022-12-20
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-12-20
Also published as: CN115896354B

Abstract

本发明涉及一种同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组及试剂盒。所述引物组含有可复合扩增25种禽类疫病病原体的引物组合。所述试剂盒基于多重荧光PCR扩增和毛细管电泳平台，包含可同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组。本发明采用多色荧光系统，可实现单管PCR扩增即可快速鉴别25种禽类病原体疫病，具有检测疾病复合程度高、灵敏度高、准确性好、成本低和操作简便的特点。该方法在禽类疫病流行病学调查及快速鉴定方面具有较好的应用潜力。

Description

一种同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别涉及一种同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组及试剂盒。

背景技术

禽类常见的传染性疾病病原包含：禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、禽传染性支气管炎(AIBV)、禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、禽偏肺病毒(hMPV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、呼肠孤病毒(REO)、禽马立克氏病病毒(MDV)、鸡毒支原体(MG)、禽腺病毒(AADV)、禽沙门氏菌病(Sal)、产蛋下降综合征(EDSV)、禽痘(APVs)、鸭瘟(DPV)、鸭病毒性肝炎(DHV)、鸭浆膜炎(RA)、小鹅瘟(GPV)、禽霍乱(Pm)、禽支原体病(AM)、低致病性禽流感(LPAI)、禽结核病(MAA)。

近年来，各国科学家已对禽病及各类病原进行了多方面的研究。目前，对禽病病原体的检测所采用的方法有病原体的分离纯化培养鉴定、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学检测技术以及荧光定量PCR等分子检测技术。病毒分离操作烦琐，耗时长，漏检率高；ELISA方法相对简便，快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生来，由于其特异性、敏感性高，能在短时间内通过基因扩增得到大量的目的片段，克服了传统的禽流感检测技术包括病毒分离鉴定试验周期长的缺点，为禽流感早期快速检测提供了敏感、快速、实用的检测方法，使之成为目前禽病病原检测的重要手段之一。但普通PCR灵敏度低，且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测。荧光定量PCR法，单管一次最多只能检测4种病原体，同样存在检测通量低的问题。目前市场急需一种检测通量大，而且灵敏度高的检测方法。鉴于以上问题，本发明基于多重荧光PCR技术和毛细管电泳平台，一次可同时检测25种禽类疫病的病原体，该试剂盒检测通量大、灵敏度高、操作简单且经济，可以为我国禽病的防治提供先进、有效的早期快速监测手段，也为实验室对禽病病原体的流行病学研究提供技术支持。

发明内容

本发明目的在于公开了一种同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组及试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

本发明的第一方面在于提供了一套引物组合。所述引物组合的核苷酸序列如SEQID No.1至SEQ ID No.50所示，能够用于多重荧光PCR中，同管复合扩增25种禽类动物的疫病病原体的基因组序列。所述50条引物分别对应所述25种禽类动物的疫病病原体，分别是禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、禽传染性支气管炎(AIBV)、禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、禽偏肺病毒(hMPV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、呼肠孤病毒(REO)、禽马立克氏病病毒(MDV)、鸡毒支原体(MG)、禽腺病毒(AADV)、禽沙门氏菌病(Sal)、产蛋下降综合征(EDSV)、禽痘(APVs)、鸭瘟(DPV)、鸭病毒性肝炎(DHV)、鸭浆膜炎(RA)、小鹅瘟(GPV)、禽霍乱(Pm)、禽支原体病(AM)、低致病性禽流感(LPAI)和禽结核病(MAA)。

本发明的第二方面在于提供了所述引物组合在非诊断、治疗为目的的禽类动物疫病检测中的应用。所述引物组合既可用于活禽的疾病诊断，也可用于进出口禽肉的检验检疫，有效阻断禽类动物疫病的传播风险，起到保障公共卫生安全的效果。

本发明的第三方面在于提供了本发明的第三方面在于提供了一种试剂盒。所述试剂盒中含有上述的引物组合。用户只需一次取样，即可通过引物组合中的25组引物对对样品进行特异性扩增，完成25种禽类动物疫病病原体的筛查，具有高效快捷、准确灵敏的优点。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括由上游引物IC-F和下游引物IC-R组成的内标引物对，所述内标引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.51至SEQ ID No.52所示，用于标示试剂盒是否正常工作。

在本发明的一些实施方式中，每组所述引物对中至少有一条引物的末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、ATTO_495、ATTO_514、Alexa 488、R-PH或SIZ。通过不同荧光染料的标记，可以将长度相似的扩增产物区分开来，有助于提高复合扩增的目标数量。

在本发明的一些实施方式中，25组所述引物对分为两群。核苷酸序列如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.28所示的引物为第一群，所述荧光染料选自ATTO_495，检测AIV、NDV、AIBV、ILTV、IBDV、CIAV、REV、ALV、hMPV、AEV、REO、MDV、MG、AADV；甚至可以将IC一并加入所述第一群中。核苷酸序列如SEQ ID No.29至SEQ ID No.50所示的引物为第二群，所述荧光染料选自ATTO_514，检测Sal、EDSV、APVs、DPV、DHV、RA、GPV、Pm、AM、LPAI、MAA。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒所含引物如表1所示。

表1特异性扩增禽类疫病病原体的引物

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR Buffer 10μL，所述PCRBuffer包括：A-Taq酶，终浓度为5U；pH 8.0的Tris-HCl，终浓度为20mM；KCl，终浓度为20mM；MgCl2，终浓度为3.0mM；dNTPs，终浓度为0.3mM；甘油，终浓度为4％；TC，终浓度为30mM。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括毛细管电泳检测组分，所述毛细管电泳检测组分包括甲酰胺8.75μL，分子量内标XSZ-300 0.25μL。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法为：

(1)提取禽类的核酸样本。

(2)同管复合扩增：

所述试剂盒的反应体系包括PCR Buffer 10μL，引物混合物5μL，阳性标准品或样本核酸提取液5μL，去离子水补足反应体系至25μL。所述试剂盒的扩增程序为：95℃预变性1分钟；循环内94℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃终延伸5分钟。

(3)毛细管电泳：

在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.75μL，标品SIZE-300 0.25μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细管电泳。

(4)结果分析

根据所设计的同一色每种禽类疫病病原体的PCR产物的片段长度不同，毛细管电泳可获得不同峰图，详细见表2。

表4禽类疫病各病原体检测靶点电泳大小及荧光标记

阳性结果判定：当IC分型特征峰峰高均大于等于500RFU，且实际片段长度与参考片段长度的差距绝对值小于等于1.5nt时，则检测结果为该阳性。

阴性结果判定：IC峰值均高于500RFU，检测的特征峰峰高均小于500RFU时，则检测结果为阴性。

若内参IC峰高小于500RFU，则可考虑反应失败，需重新对样本进行PCR扩增及毛细管电泳片段分离。

有益效果：

(1)本发明所述试剂盒单管单次反应可同时检测25种禽类疫病，降低禽疫病监测中病原体漏检造成的“假阴性”；

(2)本发明所述试剂盒单管单次反应可同时检测25种禽类疫病，减少多种禽疫病监测中核酸样本的加样次数，降低实验室污染造成的“假阳性”；

(3)本发明所述试剂盒含有内参监控，内参IC的使用可监测PCR整个过程，避免了PCR操作不当或扩增失败造成的“假阴性”；

(4)本发明所述试剂盒操作方法简单，检测时长缩短。

综上所述，本发明具有强大的创新性和实用性，可快速、准确地对25种禽类疫病的病原体进行同时检测。

附图说明

图1为对比例1中AIV引物修改前分型图；

图2为对比例1中AIV引物修改后分型图；

图3为对比例1中REO引物修改前分型图；

图4为对比例1中REO引物修改后分型图；

图5为实施例2所述试剂盒的阳性对照的分型检测结果；

图6为实施例3的灵敏度检测结果；

图7为鸡肉样品分型检测结果图；

图8为病鸭样本分型检测结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中，PCR仪购自德国Eppendorf公司，型号为Mastercycler nexus；ABI3500XL遗传分析仪购自美国ABI公司；XT-Taq DNA聚合酶、P-Reaction mix、SIZE-300为上海雄图生物科技有限公司产品。

实施例1一种同时检测25种禽类疫病病原体的试剂盒的构建

1、基因座筛选以及引物设计

首先，利用NCBI数据库下载25种禽类疫病病原体的基因组序列，保证每种病原体基因组序列下载数量不少于100条。其次，分别对每种病原体的基因组序列进行比对分析，查找到各病原体基因组序列的所有保守区域，作为引物设计的优选靶标。然后进行单引物设计，并通过扩增及毛细管电泳验证单引物的特异性和效率。如果单引物符合质量要求，进行单引物叠加测试，即将引物逐条叠加混合，并验证特异性和效率。单引物测试或叠加测试中，如果出现非特异或扩增效率下降，则需要重新设计不符合要求的引物，并继续进行实验验证，直至50条引物单引物测试和多引物叠加测试均符合特异性、效率要求。最终得到核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.50所示的50条引物。

2、PCR反应Buffer优化

(1)PCR反应的Buffer包含Taq酶、一价和二价阳离子和反应底物，为了增强PCR扩增的特异性和灵敏度，PCR Buffer中还需要添加合适的PCR增强剂。PCR Buffer中每一种组分只有在其最适反应浓度下，才能发挥最大作用，如果浓度过低，则效果不显著，如果浓度过高，甚至会抑制PCR扩增。

优化后的试剂盒中PCR反应Buffer包含的组分优化的浓度如表3所示。

表3Buffer组分

3、扩增体系的确认

按照表4配置PCR反应体系，以提取的核酸为模板进行多重PCR。

表4配置PCR反应体系

4、PCR程序优化

一般PCR扩增需要经历变性、退火、延伸三个步骤的循环，才能富集目的片段。本发明试剂盒采用快速PCR扩增程序，减少了退火和延伸所需时间，具体扩增程序如表5所示：

表5反应程序

对比例1

本发明中检测涉及的25种禽类疾病基因组都具有多个保守序列，直接根据引物设计软件提供的引物序列进行复扩扩增会对整个实验扩增效果造成不良影响，会发现开始加入某个引物时，会出现出非特异扩增的情况。

在引物测试时，发现复扩引物体系在AIV位点的引物出现了非特异，如图1中圈出的标记所示。经过对引物修改，消除了该引物产生的非特异，如图2所示。对AIV修改前后的引物序列见表6。

表6AIV引物序列的修改前后对比

在加入引物REO时，发现REO位点峰高极低(图3中圈出的标记所示)，说明该条引物的REO与其它引物会产生非特异性扩增从而影响了扩增效率。经过对REO引物修改，消除了该非特异的存在(见图4)。对AIV修改前后的引物序列见表7。

表7REO引物序列的修改前后对比

实施例2基于毛细管电泳平台的同时检测25种禽类疫病病原体的试剂盒

在实施例1的基础上，试剂盒中还增加了毛细管电泳所需试剂。

在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.75μL，标品XSZ-300 0.25μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细管电泳。

根据所设计的同一荧光每种禽类疫病的PCR产物的片段长度不同，毛细管电泳可获得不同峰图。利用试剂盒中提供的的阳性对照(25种禽类疫病靶点质粒的溶液)进行特异性检测，分型检测结果如图5所示，清晰显示了所有禽类疫病各病原体检测靶点。

实施例3试剂盒灵敏度试验

在实施例2的基础上，利用试剂盒中的阳性对照进行灵敏度梯度测试。阳性对照的质粒为10⁵拷贝/mL，分别稀释为1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/mL的样品。经验证，本试剂盒的检测灵敏度为1.0×10²拷贝/mL，其分型结果如图6所示。

实施例4对进口鸡肉不合格样本进行禽类疫病病原体检测

从已被检验检疫单位认定不合格的一份进口肉鸡样本中采样，以进一步核实其带有何种禽类疫病病原体。

从血液样本中提取的核酸经过实施例2所述试剂盒检测分析，其分型结果如图7所示。图中可见IC峰值均高于500RFU，说明检测反应成功；AIBV和ILTV峰值均高于500RFU，此判断此鸡为AIBV(禽传染性支气管炎)和ILTV(禽传染性喉气管炎)阳性。

实施例5对养殖场病鸭进行禽类疫病病原体检测

从养殖场中获得患病鸭一只，表现高热、流泪、眼睑水肿、精神萎靡、两翅下垂、脚麻痹、间歇性抽搐。

本实例采集待检鸭粪便样本并提取核酸，以提取的核酸为模板，利用实施例2提供的试剂盒进行检测，具体步骤如下：

1、样本采集与提取：

对粪便样本进行采集。磁珠法或过柱法均可以对样本进行提取。

2、多重荧光PCR：

按照表4配置PCR反应体系，以提取的核酸为模板进行多重PCR，并按表5的PCR反应程序进行多重荧光PCR扩增。

3、在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.75μL，标品XSZ-300 0.25μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细管电泳。

4、结果分析：

根据所设计的同一荧光每种禽疫病的PCR产物的片段长度不同，毛细管电泳可获得不同峰图。图8是待检鸭粪便样本分型检测结果。图中可见IC峰值均高于500RFU，说明检测反应成功；DPV和DHV峰值均高于500RFU，此病鸭为DPV(鸭瘟)和DHV(鸭病毒性肝炎)阳性。

本发明采用多重荧光PCR结合毛细管电泳分析方法，快速对25种禽类疫病进行分型检测。同时加入25对特异性禽类疫病分型引物及内参引物，多重荧光PCR后获得长度不一的扩增片段，然后使用毛细管电泳进行分离，从而对其疫病进行准确分型。本发明所采用的方法检测方法能快速有效地对禽疫病进行分型，克服了传统方法存在的缺陷，本发明所述的复合扩增检测方法具有以下优点：

(1)通量大，减少病原体漏检造成的“假阴性”：本发明所述试剂盒单管单次反应可同时检测25种禽类疫病，减少禽疫病监测中病原体漏检造成的“假阴性”；

(2)通量大，减少核酸污染造成的“假阳性”：本发明所述试剂盒单管单次反应可同时检测25种禽类疫病，减少多种禽疫病监测中核酸样本的加样次数，降低实验室污染造成的“假阳性”；

(3)内参监控，减少PCR失败造成的“假阴性”：本发明所述试剂盒含有内参监控，内参IC的使用可监测PCR整个过程，避免了PCR操作不当或扩增失败造成的“假阴性”；

(4)操作简便：本发明所述试剂盒操作方法简单，检测时长缩短。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims

1.引物组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.50所示的25组引物对。

2.权利要求1所述引物组合在非诊断、治疗为目的的禽类动物疫病检测中的应用。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括由上游引物IC-F和下游引物IC-R组成的内标引物对，所述IC-F的核苷酸序列如SEQ ID No.51所示，所述IC-R的核苷酸序列如SEQ ID No.52所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID No.1和所述SEQID No.2的终浓度为0.16μM，所述SEQ ID No.3和所述SEQ ID No.4的终浓度为0.09μM，所述SEQ IDNo.5和所述SEQ ID No.6的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID No.7和所述SEQ ID No.8的终浓度为0.15μM，所述SEQ IDNo.9和所述SEQ ID No.10的终浓度为0.14μM，所述SEQ ID No.11和所述SEQ ID No.12的终浓度为0.11μM，所述SEQ ID No.13和所述SEQ ID No.14的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.15和所述SEQ ID No.16的终浓度为0.18μM，所述SEQ ID No.17和所述SEQ ID No.18的终浓度为0.25μM，所述SEQ ID No.19和所述SEQ ID No.20的终浓度为0.30μM，所述SEQ IDNo.21和所述SEQ ID No.22的终浓度为0.16μM，所述SEQ ID No.23和所述SEQ ID No.24的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID No.25和所述SEQ ID No.26的终浓度为0.13μM，所述SEQ ID No.27和所述SEQ ID No.28的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.29和所述SEQ ID No.30的终浓度为0.17μM，所述SEQ ID No.31和所述SEQ ID No.32的终浓度为0.15μM，所述SEQ IDNo.33和所述SEQ ID No.34的终浓度为0.13μM，所述SEQ ID No.35和所述SEQ ID No.36的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.37和所述SEQ ID No.38的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID No.39和所述SEQ ID No.40的终浓度为0.25μM，所述SEQ ID No.41和所述SEQ ID No.42的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.43和所述SEQ ID No.44的终浓度为0.17μM，所述SEQ IDNo.45和所述SEQ ID No.46的终浓度为0.23μM，所述SEQ ID No.47和所述SEQ ID No.48的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.49和所述SEQ ID No.50的终浓度为0.16μM，所述SEQ ID No.51和所述SEQ ID No.52的终浓度为0.12μM。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每组所述引物对中至少有一条引物的末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、ATTO_495、ATTO_514、Alexa 488、R-PH或SIZ。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，25组所述引物对分为两群，核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.28所示的引物为第一群，所述第一群的所述荧光染料选自ATTO_495，核苷酸序列如SEQ ID No.29至SEQ IDNo.50所示的引物为第二群，所述第二群的所述荧光染料选自ATTO_514。

8.根据权利要求3至7任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR Buffer10μL，所述PCR Buffer包括：A-Taq酶，终浓度为5U；pH 8.0的Tris-HCl，终浓度为20mM；KCl，终浓度为20mM；MgCl₂，终浓度为3.0mM；dNTPs，终浓度为0.3mM；甘油，终浓度为4％；TC，终浓度为30mM。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：95℃预变性1分钟；94℃变性10秒，60℃退火30秒,72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃终延伸5分钟。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括毛细管电泳检测组分，所述毛细管电泳检测组分包括甲酰胺8.75μL，分子量内标XSZ-300 0.25μL。