CN114106112B

CN114106112B - 截短表达的鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114106112B
Application number: CN202111449927.XA
Authority: CN
Inventors: 王高学; 赵昭; 朱斌; 凌飞; 马瑞; 龚宇明
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN114106112A

Abstract

本发明公开了截短表达的鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白及其应用。将鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白截短表达后通过酶联免疫吸附法评价各截短体的免疫原性。使用免疫原性更强的截短体对鳜进行注射免疫，可以显著提高鳜产生的特异性抗体水平和攻毒后的相对免疫保护率，本发明在开发高效传染性脾肾坏死病毒病疫苗以及鳜传染性脾肾坏死病毒病的防控中具有广泛应用前景。

Description

截短表达的鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及水产养殖抗病毒疫苗，具体涉及鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白(Major capsid protein，MCP)的截短表达及应用。

背景技术

鳜，俗称桂花鱼，是淡水鱼中的名贵品种，具有很高的经济价值。近年来鳜人工繁殖和育苗技术的不断成熟，使得鳜养殖业已经实现了产业化。然而鳜密集养殖区域经常大规模爆发一种传染性极强的流行性疾病，患病鳜死亡率达90％以上。经鉴定，这种以脾、肾坏死为主要特征的疾病是由传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidneynecrosis virus，ISKNV)引起的。传染性脾肾坏死病毒病(Infectious spleen and kidneynecrosis virus disease，ISKNVD)已经被世界动物卫生组织(Office International desEpizooties，OIE)列为必须申报的重要疫病。

渔用疫苗不仅能够增强水产动物的免疫力，在鱼类病害的防治中发挥极其重要的作用，而且能够显著减少抗生素等化学药物在水产养殖上的使用量，在降低养殖成本的同时，能够避免使用药物带来的食品安全问题和环境污染问题，符合生态养殖和绿色水产品生产要求。目前市场上还没有针对ISKNV的商品化疫苗，处于研究开发阶段的主要包括灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗。灭活疫苗制备速度快，但存在免疫保护效果较低以及保护时间较短等问题；DNA疫苗具有免疫保护力强和可实现同种异株交叉保护等特点，但是免疫保护时间短和潜在的生物安全问题限制了其在水产动物上的应用；亚单位疫苗具有安全性高、稳定性好、制备简单等特点，易于实现商业化生产，但是通常存在疫苗免疫原性弱等问题，难以诱发机体产生有效的抗病毒免疫应答。因此，如何提高亚单位疫苗的免疫保护效果是当前鳜养殖产业健康发展亟待解决的问题。

优势抗原表位筛选一般是通过寻找免疫原性强的核心抗原来提高疫苗免疫保护效果。抗原上的一些抗原表位可以诱导淋巴细胞的激活，从而产生体液免疫和细胞免疫，但是淋巴细胞仅能识别一些小分子的抗原成分，而一个抗原通常会含有大量的抗原表位，因此发现免疫原性强的抗原表位是开发更有效的亚单位疫苗的关键。

目前，在水产动物上用到优势抗原表位筛选的研究还相对较少，很多研究还是通过比较病毒不同的结构蛋白来确定合适的抗原蛋白，但是天然结构蛋白中含有很多非抗原蛋白，抗原表位仅占整体的一部分，而且各抗原表位免疫原性强度不一，这就导致通过这些抗原蛋白构建的亚单位疫苗免疫效果较差。中国专利CN104404057A公开了“一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用”，其通过分析大鲵虹彩病毒MCP基因的抗原区、亲水区及表面展示概率，选取多段抗原决定簇较集中且抗原性较强的亲水序列作为拟表达基因，并通过实际的诱导表达实验确定了一株重组巴斯德毕赤酵母菌株(仅表达其中一段基因)用于生产截短优化的重组蛋白，经攻毒实验证明了该截短体与MCP蛋白仅具有相当的免疫效果，但克服了MCP蛋白表达量低的不足。

尽管鳜ISKNV MCP蛋白基因序列在不同毒株间保守，但是前期实验表明，通过序列分析难以精确获得鳜ISKNV MCP的优势抗原表位分布信息。目前尚未见到利用鳜ISKNV优势抗原表位进行疫苗产品开发应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种截短表达的鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种病毒抗原蛋白，该抗原蛋白为鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白的截短体，所述截短体的氨基酸序列长度为100～150AA(例如120～121AA)。

优选的，所述抗原蛋白的氨基酸序列为鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白氨基酸序列各分段中的任意一段，鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白氨基酸序列的分段中，上一个分段与下一个分段具有3～17AA(例如，10AA左右)的重叠区域。

优选的，所述抗原蛋白的氨基酸序列选自鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白氨基酸序列羧基端的后120AA(即MCP-4)，具体参见SEQ.ID.NO.11。

上述病毒抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

采用基于基因工程构建的表达系统，将鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白的截短体进行原核表达，所述截短体的氨基酸序列长度为100～150AA。

优选的，所述病毒抗原蛋白的制备方法具体包括以下步骤：

1)根据鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白截短体的氨基酸序列获得对应的截短的基因片段，利用该基因片段构建所述截短体的原核表达菌株；

2)对所述原核表达菌株发酵培养后进行表达产物分离纯化，得到目的蛋白，该目的蛋白包括所述截短体。

优选的，所述原核表达菌株为含有用于表达所述基因片段的重组质粒的大肠杆菌。

优选的，所述目的蛋白还包括融合表达的His标签。

一种优势抗原表位筛选方法，包括以下步骤：

采用酶联免疫吸附法对鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白不同的截短体的免疫原性进行评价，从而确定免疫原性更强的抗原表位在鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白上的分布位置信息，所述截短体的氨基酸序列长度为100～150AA。

一种鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白的截短体(即上述病毒抗原蛋白)在制备传染性脾肾坏死病毒病疫苗中的应用，所述截短体的氨基酸序列长度为100～150AA。

优选的，所述疫苗采用注射免疫，经免疫后可以显著提高鳜产生的特异性抗体水平和传染性脾肾坏死病毒攻毒后的相对免疫保护率。

本发明的有益效果体现在：

本发明采用传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白的截短体作为抗原蛋白，解决了传统鳜传染性脾肾坏死病毒亚单位疫苗免疫原性低的瓶颈问题，并且抗原蛋白的制备操作简单。本发明发现了免疫原性更强的传染性脾肾坏死病毒抗原蛋白，在高效传染性脾肾坏死病毒病疫苗开发以及鳜传染性脾肾坏死病毒病的防控中具有应用前景。

进一步的，本发明通过将传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白基因截短、构建含有分段基因(MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4)原核表达质粒的基因工程菌株，以及诱导表达和分离纯化，并通过采用酶联免疫吸附法找出免疫原性更强的截短体，结果表明MCP-4的免疫原性最高，经其注射免疫后鳜血清抗体效价以及攻毒后的相对免疫保护率显著高于其他抗原蛋白(例如传染性脾肾坏死病毒MCP以及MCP-2、MCP-3、MCP-4)。

附图说明

图1为鳜ISKNV MCP分段示意图；其中：括号内为MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4在MCP蛋白基因序列中的对应起止位点，分段基因序列分别为MCP-1(1-363bp)，MCP-2(334-696bp)，MCP-3(667-1029bp)和MCP-4(1000-1362bp)。

图2为鳜ISKNV MCP及其截短体基因重组质粒双酶切鉴定图；其中：泳道M为DL5000DNA相对分子质量标准；泳道1、3、5、7、9分别为重组质粒pET-32a-MCP、pET-32a-MCP-1、pET-32a-MCP-2、pET-32a-MCP-3、pET-32a-MCP-4；泳道2、4、6、8、10分别为pET-32a-MCP、pET-32a-MCP-1、pET-32a-MCP-2、pET-32a-MCP-3、pET-32a-MCP-4的双酶切(BamH I和Xho I)。

图3为纯化后的重组质粒表达产物SDS-PAGE分析图；其中：泳道M为蛋白质相对分子质量标准；泳道1为重组鳜ISKNV MCP(含MCP全长)；泳道2、3、4、5为重组鳜ISKNV MCP截短体(含MCP对应分段MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4)。

图4为纯化后的重组质粒表达产物Western Blot分析图；其中：泳道M为蛋白质相对分子质量标准；泳道1为重组鳜ISKNV MCP(含MCP全长)；泳道2、3、4、5为重组鳜ISKNV MCP截短体(含MCP对应分段MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4)。

图5为免疫后鳜血清抗体效价分析图；其中：**P<0.01，与Control组相比差异极显著；*P<0.05，与Control组相比差异显著。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)MCP截短体的免疫原性评价试验

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒及菌株

pET-32a-MCP质粒、E.coli BL-21/pET-32a-MCP原核表达菌株由西北农林科技大学动物科技学院水产动物病害实验室保存。

1.1.2试剂

氯化钠、无水乙醇、丙三醇等购自国药集团化学试剂有限公司；鳜ISKNV MCP蛋白免疫的阳性血清由西北农林科技大学动物科技学院水产病害实验室保存；TMB酶显色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PBST购自北京索莱宝科技股份有限公司；透析袋、鼠源6×组氨酸(Histidine，His)标签单克隆抗体、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体、His标签蛋白纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。蛋白Marker购自天根生化科技(北京)有限公司；胰蛋白胨、酵母浸出粉购自美国sigma公司；IPTG、氨苄青霉素购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.3试验仪器

电子天平ALC-1100.2，北京赛多利斯仪器系统有限公司；超净工作台YT-CJ-2ND，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；T100型PCR仪，美国Bio-Rad公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN垂直电泳仪，北京市六一仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司。

1.2试验方法

1.2.1 PCR扩增获取MCP各截短体的基因

如图1所示，根据GenBank中ISKNV MCP蛋白基因序列(Accession no.：HQ317465.1)，将该基因序列截短为4段(由各段基因序列编码对应的MCP分段，例如MCP-4的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.11所示，其基因序列最后三位为终止密码子)，前后两个分段之间存在30bp重叠碱基，从而设计各分段基因引物(如表1所示)，以pET-32a-MCP质粒为模板分别进行PCR扩增。

表1.MCP基因及各分段基因引物序列

PCR扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V恒压20min。

1.2.2 MCP各截短体基因原核表达质粒及菌株的构建

电泳产物切胶、回收、经DNA纯化试剂盒纯化DNA产物，将上述各分段基因的纯化产物分别和pET-32a(+)原核表达载体(武汉淼灵生物科技有限公司)经BamH I和Xho I双酶切后进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态中，经蓝白斑筛选获取阳性菌株，并提取质粒进行PCR及测序鉴定，将各分段基因重组质粒分别命名为pET-32a-MCP-1、pET-32a-MCP-2、pET-32a-MCP-3和pET-32a-MCP-4，从而得到对应的原核表达菌株E.coli BL-21/pET-32a-MCP-1、E.coli BL-21/pET-32a-MCP-2、E.coli BL-21/pET-32a-MCP-3和E.coli BL-21/pET-32a-MCP-4。

1.2.3MCP及其截短体的原核表达

将含重组质粒pET-32a-MCP、pET-32a-MCP-1、pET-32a-MCP-2、pET-32a-MCP-3、pET-32a-MCP-4的原核表达菌株(pET-32a-MCP质粒于2018年10月构建，构建方法与其他重组质粒类似，仅是将分段基因替换为MCP基因)分别接种于100mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振摇培养至细菌生长至对数期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)至培养基中的终浓度为1.0mM，继续振摇培养4-6h，诱导结束。

1.2.4MCP及其截短体的分离纯化

收集上一步诱导表达的菌液，12000g、4℃条件下离心10min，弃上清。沉淀中加入等体积的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)进行重悬，然后用超声细胞破碎仪进行超声裂解(功率300w，超声2s，间隔3s)至菌液澄清透亮为止(反应在冰上进行)。然后通过His标签蛋白纯化试剂盒对所得蛋白液体进行纯化，并使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定其蛋白含量。纯化后的蛋白溶液经冷冻干燥制成冻干粉，于-20℃低温储存，使用时以无菌水溶解。

分别取不同重组质粒表达产物经分离和纯化后的蛋白溶液样品加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液进行制样处理，在经过SDS-PAGE分析后，以鼠源His标签单克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体为二抗进行Western Blot分析。

1.2.5MCP截短体的免疫原性评价

采用酶联吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进行免疫原性评价，具体流程如下：先用ELISA包被液将鳜阳性血清进行1:1000稀释，酶标板中每孔加入100μL稀释后的血清作为抗原并于4℃包被24h。弃去孔中液体后，每孔加入200μL的1％牛血清蛋白，于37℃封闭1h。封闭结束后用磷酸盐吐温缓冲液(Phosphate buffered salinewith Tween-20，PBST)漂洗3次，每次3min。随后分孔加入100μL不同重组质粒表达产物经分离和纯化后的蛋白溶液，于37℃下孵育1h。PBST漂洗3次，随后以鼠源6×His标签单克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体为二抗，先后在37℃下分别孵育1h。PBST漂洗3次后，加入TMB显色液，于37℃避光放置3-5min进行显色反应。随后每孔加入50μL显色终止液，在20min内通过酶标仪测定在波长450nm下各酶标孔的吸光度(OD₄₅₀)。

2结果与分析

2.1MCP各截短体基因原核表达质粒的鉴定

对构建好的各分段基因重组质粒pET-32a-MCP-1、pET-32a-MCP-2、pET-32a-MCP-3、pET-32a-MCP-4，分别进行双酶切鉴定和测序鉴定。酶切后经电泳检测(如图2所示)，结合质粒测序结果，表明各质粒构建正确，其中，MCP基因对应条带大小为1362bp，分段基因MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4对应条带大小均为363bp。

2.2 MCP及其截短体的诱导表达

经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后，对各原核表达菌株中相应重组质粒所表达的蛋白产物进行SDS-PAGE分析和Western blot分析。在SDS-PAGE分析结果中，可见表达的含MCP的目的蛋白大小在70kDa左右，表达的含MCP对应分段的目的蛋白大小均在30kDa左右(图3)。在Western Blot分析结果中，可见在70kDa处有一条明显的与含MCP的目的蛋白相符的识别条带，在30kDa处分别有一条明显的与含MCP对应分段的目的蛋白相符的识别条带(图4)。这些结果表明重组质粒pET-32a-MCP及pET-32a-MCP-1、pET-32a-MCP-2、pET-32a-MCP-3、pET-32a-MCP-4在大肠杆菌中可以有效表达MCP及MCP的截短体(具体为MCP对应分段MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4)。

2.3 MCP各截短体的免疫原性

利用BCA蛋白浓度检测试剂盒，分别检测表达的含MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4的目的蛋白的浓度，结果如表2所示。在目的蛋白含量相同的条件下，表2显示MCP-4的OD值显著高于MCP及MCP的其他分段，证明MCP-4的免疫原性显著高于MCP以及MCP的其他分段，这一结果为最终筛选获得鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白优势抗原表位提供了依据。

表2.MCP截短体的免疫原性评价

(二)鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白优势抗原表位亚单位疫苗的免疫效果

1材料和方法

1.1材料

1.1.1试验动物和病毒

健康鳜(6.0±0.5g)购买于广东省江门市某养殖场。饲养水温28±1℃，溶解氧保持在6mg/L以上，日光灯调节光照周期为光照12h/d。每天早上8点和下午5点定时饲喂，每日及时清除缸底残饵和粪便，每隔3d对鱼缸进行换水。暂养14d后进行试验。鳜传染性脾肾坏死病毒毒株由中国水产科学研究院珠江水产研究所惠赠。

1.1.2试剂

MCP及MCP截短体(具体为MCP-4)参照以上(一)中方法于西北农林科技大学动物科技学院水产动物病害实验室制备。鼠源His标签单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.1.3试验仪器

ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN型垂直电泳仪，北京市六一仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司；T100型PCR仪，美国伯乐公司。

1.2试验方法

1.2.1免疫

对暂养14d后的健康鳜麻醉后采用背鳍基部肌肉注射的方式进行注射免疫，每尾鱼注射体积为10μL。将制备的MCP和MCP-4分别以相应浓度溶解于无菌PBS中作为疫苗，稀释成不同浓度梯度以评价不同免疫剂量下疫苗的效果。MCP组的处理剂量为10.0μg/尾，MCP-4组的处理剂量分别为1.0、5.0和10.0μg/尾(具体分组见表3)，每个疫苗处理组包含60尾鱼，每组包含三个平行。

表3.免疫分组

1.2.2血清免疫抗体效价测定

在免疫后7d、14d、21d、28d收集鳜血液，每次采样3尾鱼用于抗体效价测定。将采集的血液样品室温静置2h，然后置于4℃过夜使其自然凝固。最后通过低温冷冻离心机5000g离心10min，收集上层血清置于-20℃中保存，以备后续抗体效价测定。

测定抗体效价时，以纯化的MCP为抗原，采样鳜血清为待测血清，鼠源-His标签单克隆抗体为一抗，HRP羊抗鼠IgG单克隆抗体为二抗，稀释比例均为1:1000，采用酶联免疫吸附法测定血清中的抗体效价。显色后通过酶标仪测定在波长为450nm条件下的吸光度。

1.2.3攻毒试验

免疫28d后，从各组中分别随机取37尾鳜，并置于新的饲养条件相同的鱼缸中进行攻毒试验。采取腹腔注射的方式，对每尾鱼注射3.98×10⁶TCID₅₀/mL ISKNV病毒液(50μL)。控制水温28±1℃，连续观察14d，定时检查、记录发病情况，最后计算死亡率和相对免疫保护率：

相对免疫保护率＝(1-疫苗处理组死亡率/Control组死亡率)×100％

2结果与分析

2.1血清免疫抗体效价

经注射免疫后鳜血清免疫抗体效价测定结果如图5所示，免疫后14d开始，MCP和MCP-4各剂量疫苗处理组的抗体效价水平随着免疫时间的延长均逐渐提高，在每个检测的时间点，抗体效价水平相比于Control组均有显著的提升，并且在免疫后28d达到最高。免疫后28d MCP-4各剂量疫苗处理组的抗体效价水平显著高于Control组，最高剂量疫苗处理组(10μg/尾)的抗体效价显著高于其他剂量疫苗处理组，可达Control组的3倍左右。此外，免疫后28d，采用5μg/尾剂量的MCP-4疫苗处理组的抗体效价就已经显著高于MCP疫苗处理组(10μg/尾)。

2.2累计死亡率与相对免疫保护率

对免疫28d后的鳜用ISKNV病毒进行攻毒后，每天记录鳜发病死亡情况，攻毒14d后各组鳜达到相对比较稳定的状态而且数量变化不大。对这14d内各组鳜的死亡率和相对免疫保护率进行统计的结果见表4，结果显示Control组的死亡率为100％，所有疫苗处理组的死亡率均低于Control组，而相对免疫保护率均高于Control组。攻毒14d后，MCP-4组(具体为最高剂量疫苗处理组)的相对免疫保护率最高，达到了62.3％，而MCP疫苗处理组的相对免疫保护率仅为44.9％。

表4.免疫后攻毒死亡率和相对免疫保护率

<110> 西北农林科技大学

<120> 截短表达的鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白及其应用

<160> 11

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> F

<400> 1

cgggatccat gtctgcaatc tcaggt 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> R

<400> 2

ccgctcgagt tacaggatag ggaagc 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> F1

<400> 3

cgggatccat gtctgcaatc tcaggt 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> R1

<400> 4

ccgctcgagt tatgccacca ggtcgtt 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> F2

<400> 5

cgggatccat ggtgtcggtg tcattt 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> R2

<400> 6

ccgctcgagt tatgctacat tgccaat 27

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> F3

<400> 7

cgggatccat ggtcaccctg gctaac 26

<210>8

<211> 27

<212> DNA

<213> R3

<400> 8

ccgctcgagt tagttctcgt aaatgag 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> F4

<400> 9

cgggatccat gctgtccgag gtgtca 26

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> R4

<400> 10

ccgctcgagt tacaggatag ggaagcc 27

<210> 11

<211> 120

<212> PRT

<213> MCP-4

<400> 11

Leu Ser Glu Val Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Thr Pro Arg Leu His Gln

1 5 10 15

Met Gly Val Asp Tyr Phe Thr Ser Val Asp Pro Tyr Tyr Phe Ala Pro

20 25 30

Ser Met Pro Glu Met Asp Gly Val Met Thr Tyr Cys Tyr Thr Leu Asp

35 40 45

Met Gly Asn Ile Asn Pro Met Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Arg Leu Ser

50 55 60

Asn Val Thr Leu Ser Cys Lys Val Ser Asp Asn Ala Lys Thr Thr Ala

65 70 75 80

Ala Gly Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Tyr Thr Val Ala Gln Lys Phe

85 90 95

Glu Leu Val Val Ile Ala Val Asn His Asn Ile Met Lys Ile Ala Asp

100 105 110

Gly Ala Ala Gly Phe Pro Ile Leu

115 120

Claims

1.一种病毒抗原蛋白，其特征在于：该抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

2.一种病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

将传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白的截短体进行原核表达，所述截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；

所述制备方法具体包括以下步骤：

1)根据传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白的截短体获得对应的截短的基因片段，利用该基因片段构建所述截短体的原核表达菌株；

3.根据权利要求2所述一种病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：所述原核表达菌株为含有用于表达所述基因片段的重组质粒的大肠杆菌。

4.根据权利要求2所述一种病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：所述目的蛋白还包括融合表达的His标签。

5.一种传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白的截短体在制备传染性脾肾坏死病毒病疫苗中的应用，其特征在于：所述截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述疫苗采用注射免疫。