CN102994518A - 一种猪ii型圆环病毒orf2蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法，将编码PCV2核衣壳蛋白的Cap基因连接到pET-28a(+)质粒上构建成表达质粒pET-28-Cap，转化BL21(DE3)感受态细胞，得到基因工程菌种pET-28-Cap/BL21。通过诱导表达及检测表明该重组蛋白具有良好的反应原性。可进一步用来作为诊断抗原或制备亚单位疫苗。产物在大肠杆菌中以可溶性形式表达，表达量大且避免了蛋白变性再复性的繁琐过程，降低了蛋白的损耗和生产成本。

Description

一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法。

背景技术

猪II型圆环病毒(PCV2)是近年来新发现的动物病毒之一，属于圆环病毒科，是一种二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒，病毒粒子直径为17nm，是目前发现的最小的动物病毒。该病最早于1991年在加拿大西部发现，根据致病性的不同，被分为PCV-1和PCV-2。其中PCV-2对猪有较强的感染性，可经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪，引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）等。感染猪出现进行性消瘦、行动迟缓、呼吸困难、黄疸、皮肤苍白，甚至死亡，病原学及血清学调查表明，该病在许多国家都广泛存在，给世界养猪业造成了很大的损失。

PCV-2基因组含ORF1和ORF2，ORF1编码Rep蛋白，参与病毒复制，ORF2编码233个氨基酸，是病毒的核衣壳蛋白(Cap)，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗和临床检测的首选抗原。

大肠杆菌表达系统不仅具有遗传背景清楚，培养操作简单、转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。另外，诱导剂乳糖是一种二糖，没有毒性，价格低廉，其本身作为一种碳源，可以被菌体代谢利用，乳糖所具备的无毒和价廉的优点，使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中，仍具有优于IPTG的潜在价值和优势。

猪II型圆环病毒（PCV2）细胞培养灭活疫苗产量低且国内缺乏对PCV2疫苗统一的生产检验方法及标准，这些问题已成为限制该类产品开发和应用的瓶颈；新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率还有待证实，而国外已有亚单位疫苗上市，能显著降低病毒血症，但价格昂贵。

猪II型圆环病毒ORF2蛋白亚单位疫苗中已有关于使用酵母和杆状病毒表达ORF2蛋白的报道，但酵母表达系统繁琐，可能存在蛋白切割的问题，而杆状病毒则存在表达成本高，蛋白纯化困难等缺点。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种降低蛋白的损耗和生产成本的猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法。

本发明采用如下技术方案：包括以下步骤：

1.序列合成

通过序列比对，在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列，把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并在序列两端分别加上EcoR I和Not I 限制性酶切位点，合成cap基因，连接到PES载体上，按照设定的限制性内切酶进行酶切，将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态DH5a细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定阳性质粒；

2．原核表达载体的构建与鉴定

将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切，回收702bp的目的片段，与同样经EcoR I和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a+连接，连接体系：目的片段5uL，pET-28a+ 载体3uL，T4 DNA Ligase 1uL，10*buffer 1uL，4℃连接过夜；取10µL连接产物与100µL BL21感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s后迅速置冰浴中静置2min，加入800µL无抗生素的LB培养基，37℃ 150 rpm摇床培养45min后，5000rpm离心5min，弃上清，留200uL将菌体吹匀后涂布含kana，100μg/mL的LB平板，37℃温箱倒置培养12-16h；次日挑取白色单菌落，用含kana的LB培养基小量扩增培养；OMEGA试剂盒小量提取质粒；分别经PCR鉴定和EcoR 、Not I双酶切鉴定，将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析；

3.重组菌的诱导表达

将鉴定为阳性的BL21菌液按1：100的比例转接到含kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期时，OD₆₀₀值为0.6，加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、6h，同时设未诱导菌液对照和pET-28a/BL21诱导对照；取1mL菌液，13000rpm离心1min后，弃上清，加入50uL PBS和50uL 2*SDS-PAGE Loading Buffer重悬，沸水煮5 min，进行12%SDS-PAGE，结果显示，pET-28-cap在30kDa处有一条很浓的蛋白条带，与预期目的条带大小相符；而未经诱导的重组菌则无此条带，空载体质粒pET-28a+转化菌经诱导后在约7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带，说明蛋白已经得到了表达；

4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化

通过对诱导温度，诱导时间，诱导剂浓度等诱导条件的摸索，重组菌在37℃，10g/L 乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h，蛋白的可溶性表达量最大；冻融菌体并进行超声破碎30min，设置为间隔1秒，超声3秒，离心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳；对可溶性的重组蛋白进行His-蛋白质镍亲和层析。

本发明猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法的有益效果是：利用大肠杆菌表达系统，不断摸索诱导条件，实现了蛋白的可溶性表达，避免了蛋白变性、复性等的繁琐过程，降低了生产成本，适宜于规模化发酵生产。

附图说明

图1为pET-28-cap重组菌在大肠杆菌中的蛋白表达；

图2 western blot 鉴定图。

在图１中，1、2、4、5 为诱导的pET-28-cap重组菌；M 为低分子量蛋白marker；3为未诱导的pET-28-cap重组菌；6为空载体pET-28a(+)对照；

在图２中，M为低分子量预染蛋白marker；1为目的蛋白；2 为未诱导菌体对照。

具体实施方式

请参阅图1和图2所示，本发明的一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1.序列合成

通过序列比对，在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列，把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并在序列两端分别加上EcoR I和Not I 限制性酶切位点，合成cap基因，连接到PES载体上，按照设定的限制性内切酶进行酶切，将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态DH5a细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定阳性质粒。

2．原核表达载体的构建与鉴定

将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切，回收702bp的目的片段，与同样经EcoR I和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a(+)连接，连接体系：目的片段5uL ，pET-28a(+) 载体3uL，T4 DNA Ligase 1uL，10*buffer 1uL，4℃连接过夜。取10µL连接产物与100µL BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s后迅速置冰浴中静置2min，加入800µL无抗生素的LB培养基，37℃ 150 rpm摇床培养45min后，5000rpm离心5min，弃上清，留200uL将菌体吹匀后涂布含kana(100μg/mL)的LB平板，37℃温箱倒置培养12-16h。次日挑取白色单菌落，用含kana的LB培养基小量扩增培养。OMEGA试剂盒小量提取质粒。分别经PCR鉴定和EcoR 、Not I双酶切鉴定，将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析。

3.重组菌的诱导表达

将鉴定为阳性的BL21菌液按1：100的比例转接到含kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期(OD₆₀₀值约0.6)时，加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、6h，同时设未诱导菌液对照和pET-28a/BL21诱导对照。取1mL菌液，13000rpm离心1min后，弃上清，加入50uL PBS和50uL 2*SDS-PAGE Loading Buffer重悬，沸水煮5 min，进行12%SDS-PAGE，结果显示，pET-28-cap在约30kDa处有一条很浓的蛋白条带，与预期目的条带大小相符。而未经诱导的重组菌则无此条带，空载体质粒pET-28a(+)转化菌经诱导后在约7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带。说明蛋白已经得到了表达。

4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化

通过对诱导温度，诱导时间，诱导剂浓度等诱导条件的摸索，重组菌在37℃，10g/L 乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h，蛋白的可溶性表达量最大。冻融菌体并进行超声破碎30min，设置为间隔1秒，超声3秒，离心后收集上清和沉淀。上清和沉淀中的蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳。对可溶性的重组蛋白进行His-蛋白质镍亲和层析。按照His·Bind® Purification Kit说明书进行。

5.重组蛋白的免疫原性鉴定

将表达蛋白进行12%SDS-PAGE电泳分离后，利用半干转印仪进行电转印，具体操作过程按分子克隆实验指南方法进行。将转印的PVDF膜用5%的脱脂奶4℃封闭过夜，然后以1:100稀释的标准阳性血清为一抗，1:5000稀释的HRP标记的兔抗猪IgG为二抗进行Western-blot分析。二抗孵育结束后进行洗涤，将洗涤充分的转印膜转移至新鲜配制的DAB底物溶液中作用5-10min，待有条带清晰显现时，立即用水冲洗终止反应，拍照保存。

结果表明：表达蛋白在DAB底物溶液显色后，分别出现了与预期大小一致的约30kDa的融合蛋白，表明表达蛋白具有良好的反应原性。

6．重组蛋白的应用

（1）特异性强、敏感性高的免疫学血清学技术是规模化猪场进行猪圆环病毒2型感染和流行状况调查所必备的手段。该重组蛋白与PCV2抗血清具有良好的反应性，可代替全病毒抗原作为ELISA检测的包被抗原，通过对抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的选择，待检血清稀释度的选择，阴阳性临界值的确定，建立检测PCV2抗体的间接ELISA方法，优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.8ug/mL，抗原最佳包被条件为4℃过夜，血清最适稀释度为1：40，酶标抗体最适稀释度为1：5000，最佳封闭液为1%明胶。阻断试验表明，建立的间接ELSA对PCV2抗体具有很好的特异性。经对临床疑似PCV2感染的100份血清样品进行检测，阳性检出率为72%。实验表明，建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法具有特异性强、重复性和稳定性好等特点，可用于PCV2抗体的血清学诊断和流行病学调查。

（2）重组菌经乳糖诱导表达纯化后，进行浓缩，按一定比例与佐剂混合，进行乳化，可用于制备亚单位疫苗来进行PCV2感染的防治（其疫苗具体制备方法，效果评价不在此累述）。

安全性试验:

方法：取21～25日龄健康仔猪4头,超剂量肌肉注射疫苗3ml/头,观察28日。

结果：安全检验表明:所有免疫猪健活,精神状态、行为活动和饮食正常;呼吸和体温均在正常范围内,全身及接种部位无其它不良反应。

效力试验：

方法：取25～28日龄健康仔猪15头。经检测圆环病毒抗体为阴性。随机分为3组,每组5头。

第1组为免疫组,颈部肌肉注射自制亚单位疫苗,2ml/头，14日后加强免疫1次。第2组为不免疫攻毒组。第3组为不免疫不攻毒的空白对照组。3组猪隔离饲养。二免后第21日,对所有猪采血,分离血清，测定血清中的PCV2抗体效价,并用SD株强毒（本实验室分离）病毒液(含10^5.5TCID₅₀/ml)对第1、2组猪攻毒,逐日测定体温并观察25日。攻毒到期后对所有猪进行剖检，观察各组织器官病理变化。

结果：通过ELISA方法对免疫前和免疫后21日的猪血清进行圆环病毒抗体的检测（结果见表1），结果表明二免后21日免疫组猪圆环病毒抗体滴度明显高于免疫前抗体滴度，不免疫攻毒组攻毒后仔猪出现体温持续升高，大于40℃的症状，明显食欲减退，精神沉郁，被毛粗乱，消瘦和生长速度减慢，剖检可见肺脏轻度水肿，肾脏有点状出血坏死， PCR方法检测其淋巴结组织，可检测到PCV2存在。而免疫对照组攻毒后10天仅有一头猪表现精神沉郁，食欲减退，其余四头与空白对照组猪精神状态、行为活动和饮食正常;呼吸和体温也在正常范围内,无全身及局部不良反应。

表1 各组试验猪PCV2抗体检测及攻毒情况

试验结论:试验用亚单位疫苗安全性良好,商品仔猪免疫后无任何不良反应。效力试验表明仔猪免疫后产生的抗体水平高，能够抵抗强毒攻击，由此推断，Cap蛋白制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗可以有效防控II型圆环病毒的侵袭。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1.序列合成

通过序列比对，在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列，把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并在序列两端分别加上EcoR I和Not I 限制性酶切位点，合成cap基因，连接到PES载体上，按照设定的限制性内切酶进行酶切，将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态DH5a细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定阳性质粒；

2．原核表达载体的构建与鉴定

将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切，回收702bp的目的片段，与同样经EcoR I和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a(+)连接，连接体系：目的片段5uL，pET-28a(+) 载体3uL，T4 DNA Ligase 1uL，10*buffer 1uL，4℃连接过夜；取10µL连接产物与100µL BL21感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s后迅速置冰浴中静置2min，加入800µL无抗生素的LB培养基，37℃ 150 rpm摇床培养45min后，5000rpm离心5min，弃上清，留200uL将菌体吹匀后涂布含kana，100μg/mL的LB平板，37℃温箱倒置培养12-16h；次日挑取白色单菌落，用含kana的LB培养基小量扩增培养；OMEGA试剂盒小量提取质粒；分别经PCR鉴定和EcoR І、Not I双酶切鉴定，将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析；

3.重组菌的诱导表达

将鉴定为阳性的BL21菌液按1：100的比例转接到含kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期时，OD₆₀₀值为0.6，加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、6h，同时设未诱导菌液对照和pET-28a/BL21诱导对照；取1mL菌液，13000rpm离心1min后，弃上清，加入50uL PBS和50uL 2*SDS-PAGE Loading Buffer重悬，沸水煮5 min，进行12%SDS-PAGE，结果显示，pET-28-cap在30kDa处有一条很浓的蛋白条带，与预期目的条带大小相符；而未经诱导的重组菌则无此条带，空载体质粒pET-28a(+)转化菌经诱导后在约7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带，说明蛋白已经得到了表达；

4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化

通过对诱导温度，诱导时间，诱导剂浓度等诱导条件的摸索，重组菌在37℃，10g/L 乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h，蛋白的可溶性表达量最大；冻融菌体并进行超声破碎30min，设置为间隔1秒，超声3秒，离心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳；对可溶性的重组蛋白进行His-蛋白质镍亲和层析。

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