CN102994518A - 一种猪ii型圆环病毒orf2蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法,将编码PCV2核衣壳蛋白的Cap基因连接到pET-28a(+)质粒上构建成表达质粒pET-28-Cap,转化BL21(DE3)感受态细胞,得到基因工程菌种pET-28-Cap/BL21。通过诱导表达及检测表明该重组蛋白具有良好的反应原性。可进一步用来作为诊断抗原或制备亚单位疫苗。产物在大肠杆菌中以可溶性形式表达,表达量大且避免了蛋白变性再复性的繁琐过程,降低了蛋白的损耗和生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法。
背景技术
猪II型圆环病毒(PCV2)是近年来新发现的动物病毒之一,属于圆环病毒科,是一种二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒,病毒粒子直径为17nm,是目前发现的最小的动物病毒。该病最早于1991年在加拿大西部发现,根据致病性的不同,被分为PCV-1和PCV-2。其中PCV-2对猪有较强的感染性,可经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪,引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等。感染猪出现进行性消瘦、行动迟缓、呼吸困难、黄疸、皮肤苍白,甚至死亡,病原学及血清学调查表明,该病在许多国家都广泛存在,给世界养猪业造成了很大的损失。
PCV-2基因组含ORF1和ORF2,ORF1编码Rep蛋白,参与病毒复制,ORF2编码233个氨基酸,是病毒的核衣壳蛋白(Cap),具有良好的免疫原性,是构建重组疫苗和临床检测的首选抗原。
大肠杆菌表达系统不仅具有遗传背景清楚,培养操作简单、转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。另外,诱导剂乳糖是一种二糖,没有毒性,价格低廉,其本身作为一种碳源,可以被菌体代谢利用,乳糖所具备的无毒和价廉的优点,使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中,仍具有优于IPTG的潜在价值和优势。
猪II型圆环病毒(PCV2)细胞培养灭活疫苗产量低且国内缺乏对PCV2疫苗统一的生产检验方法及标准,这些问题已成为限制该类产品开发和应用的瓶颈;新型的疫苗如DNA疫苗,免疫效率还有待证实,而国外已有亚单位疫苗上市,能显著降低病毒血症,但价格昂贵。
猪II型圆环病毒ORF2蛋白亚单位疫苗中已有关于使用酵母和杆状病毒表达ORF2蛋白的报道,但酵母表达系统繁琐,可能存在蛋白切割的问题,而杆状病毒则存在表达成本高,蛋白纯化困难等缺点。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种降低蛋白的损耗和生产成本的猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法。
本发明采用如下技术方案:包括以下步骤:
1.序列合成
通过序列比对,在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列,把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子,并在序列两端分别加上EcoR I和Not I 限制性酶切位点,合成cap基因,连接到PES载体上,按照设定的限制性内切酶进行酶切,将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上,转化感受态DH5a细胞,挑取阳性菌落,OMEGA试剂盒小量提取质粒,酶切鉴定阳性质粒;
2.原核表达载体的构建与鉴定
将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切,回收702bp的目的片段,与同样经EcoR I和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a+连接,连接体系:目的片段5uL,pET-28a+ 载体3uL,T4 DNA Ligase 1uL,10*buffer 1uL,4℃连接过夜;取10µL连接产物与100µL BL21感受态细胞混合,冰浴30min,42℃热激90s后迅速置冰浴中静置2min,加入800µL无抗生素的LB培养基,37℃ 150 rpm摇床培养45min后,5000rpm离心5min,弃上清,留200uL将菌体吹匀后涂布含kana,100μg/mL的LB平板,37℃温箱倒置培养12-16h;次日挑取白色单菌落,用含kana的LB培养基小量扩增培养;OMEGA试剂盒小量提取质粒;分别经PCR鉴定和EcoR 、Not I双酶切鉴定,将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析;
3.重组菌的诱导表达
将鉴定为阳性的BL21菌液按1:100的比例转接到含kana的LB液体培养基中,37℃振荡培养至对数生长期时,OD600值为0.6,加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、6h,同时设未诱导菌液对照和pET-28a/BL21诱导对照;取1mL菌液,13000rpm离心1min后,弃上清,加入50uL PBS和50uL 2*SDS-PAGE Loading
Buffer重悬,沸水煮5 min,进行12%SDS-PAGE,结果显示,pET-28-cap在30kDa处有一条很浓的蛋白条带,与预期目的条带大小相符;而未经诱导的重组菌则无此条带,空载体质粒pET-28a+转化菌经诱导后在约7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带,说明蛋白已经得到了表达;
4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化
通过对诱导温度,诱导时间,诱导剂浓度等诱导条件的摸索,重组菌在37℃,10g/L 乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h,蛋白的可溶性表达量最大;冻融菌体并进行超声破碎30min,设置为间隔1秒,超声3秒,离心后收集上清和沉淀;上清和沉淀中的蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳;对可溶性的重组蛋白进行His-蛋白质镍亲和层析。
本发明猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法的有益效果是:利用大肠杆菌表达系统,不断摸索诱导条件,实现了蛋白的可溶性表达,避免了蛋白变性、复性等的繁琐过程,降低了生产成本,适宜于规模化发酵生产。
附图说明
图1为pET-28-cap重组菌在大肠杆菌中的蛋白表达;
图2 western blot 鉴定图。
在图1中,1、2、4、5 为诱导的pET-28-cap重组菌;M 为低分子量蛋白marker;3为未诱导的pET-28-cap重组菌;6为空载体pET-28a(+)对照;
在图2中,M为低分子量预染蛋白marker;1为目的蛋白;2 为未诱导菌体对照。
具体实施方式
请参阅图1和图2所示,本发明的一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法,包括以下步骤:
1.序列合成
通过序列比对,在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列,把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子,并在序列两端分别加上EcoR I和Not I 限制性酶切位点,合成cap基因,连接到PES载体上,按照设定的限制性内切酶进行酶切,将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上,转化感受态DH5a细胞,挑取阳性菌落,OMEGA试剂盒小量提取质粒,酶切鉴定阳性质粒。
2.原核表达载体的构建与鉴定
将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切,回收702bp的目的片段,与同样经EcoR I和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a(+)连接,连接体系:目的片段5uL ,pET-28a(+) 载体3uL,T4 DNA Ligase 1uL,10*buffer 1uL,4℃连接过夜。取10µL连接产物与100µL BL21(DE3)感受态细胞混合,冰浴30min,42℃热激90s后迅速置冰浴中静置2min,加入800µL无抗生素的LB培养基,37℃ 150 rpm摇床培养45min后,5000rpm离心5min,弃上清,留200uL将菌体吹匀后涂布含kana(100μg/mL)的LB平板,37℃温箱倒置培养12-16h。次日挑取白色单菌落,用含kana的LB培养基小量扩增培养。OMEGA试剂盒小量提取质粒。分别经PCR鉴定和EcoR 、Not I双酶切鉴定,将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析。
3.重组菌的诱导表达
将鉴定为阳性的BL21菌液按1:100的比例转接到含kana的LB液体培养基中,37℃振荡培养至对数生长期(OD600值约0.6)时,加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、6h,同时设未诱导菌液对照和pET-28a/BL21诱导对照。取1mL菌液,13000rpm离心1min后,弃上清,加入50uL PBS和50uL 2*SDS-PAGE Loading
Buffer重悬,沸水煮5 min,进行12%SDS-PAGE,结果显示,pET-28-cap在约30kDa处有一条很浓的蛋白条带,与预期目的条带大小相符。而未经诱导的重组菌则无此条带,空载体质粒pET-28a(+)转化菌经诱导后在约7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带。说明蛋白已经得到了表达。
4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化
通过对诱导温度,诱导时间,诱导剂浓度等诱导条件的摸索,重组菌在37℃,10g/L 乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h,蛋白的可溶性表达量最大。冻融菌体并进行超声破碎30min,设置为间隔1秒,超声3秒,离心后收集上清和沉淀。上清和沉淀中的蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳。对可溶性的重组蛋白进行His-蛋白质镍亲和层析。按照His·Bind® Purification Kit说明书进行。
5.重组蛋白的免疫原性鉴定
将表达蛋白进行12%SDS-PAGE电泳分离后,利用半干转印仪进行电转印,具体操作过程按分子克隆实验指南方法进行。将转印的PVDF膜用5%的脱脂奶4℃封闭过夜,然后以1:100稀释的标准阳性血清为一抗,1:5000稀释的HRP标记的兔抗猪IgG为二抗进行Western-blot分析。二抗孵育结束后进行洗涤,将洗涤充分的转印膜转移至新鲜配制的DAB底物溶液中作用5-10min,待有条带清晰显现时,立即用水冲洗终止反应,拍照保存。
结果表明:表达蛋白在DAB底物溶液显色后,分别出现了与预期大小一致的约30kDa的融合蛋白,表明表达蛋白具有良好的反应原性。
6.重组蛋白的应用
(1)特异性强、敏感性高的免疫学血清学技术是规模化猪场进行猪圆环病毒2型感染和流行状况调查所必备的手段。该重组蛋白与PCV2抗血清具有良好的反应性,可代替全病毒抗原作为ELISA检测的包被抗原,通过对抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的选择,待检血清稀释度的选择,阴阳性临界值的确定,建立检测PCV2抗体的间接ELISA方法,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.8ug/mL,抗原最佳包被条件为4℃过夜,血清最适稀释度为1:40,酶标抗体最适稀释度为1:5000,最佳封闭液为1%明胶。阻断试验表明,建立的间接ELSA对PCV2抗体具有很好的特异性。经对临床疑似PCV2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为72%。实验表明,建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法具有特异性强、重复性和稳定性好等特点,可用于PCV2抗体的血清学诊断和流行病学调查。
(2)重组菌经乳糖诱导表达纯化后,进行浓缩,按一定比例与佐剂混合,进行乳化,可用于制备亚单位疫苗来进行PCV2感染的防治(其疫苗具体制备方法,效果评价不在此累述)。
安全性试验:
方法:取21~25日龄健康仔猪4头,超剂量肌肉注射疫苗3ml/头,观察28日。
结果:安全检验表明:所有免疫猪健活,精神状态、行为活动和饮食正常;呼吸和体温均在正常范围内,全身及接种部位无其它不良反应。
效力试验:
方法:取25~28日龄健康仔猪15头。经检测圆环病毒抗体为阴性。随机分为3组,每组5头。
第1组为免疫组,颈部肌肉注射自制亚单位疫苗,2ml/头,14日后加强免疫1次。第2组为不免疫攻毒组。第3组为不免疫不攻毒的空白对照组。3组猪隔离饲养。二免后第21日,对所有猪采血,分离血清,测定血清中的PCV2抗体效价,并用SD株强毒(本实验室分离)病毒液(含105.5TCID50/ml)对第1、2组猪攻毒,逐日测定体温并观察25日。攻毒到期后对所有猪进行剖检,观察各组织器官病理变化。
结果:通过ELISA方法对免疫前和免疫后21日的猪血清进行圆环病毒抗体的检测(结果见表1),结果表明二免后21日免疫组猪圆环病毒抗体滴度明显高于免疫前抗体滴度,不免疫攻毒组攻毒后仔猪出现体温持续升高,大于40℃的症状,明显食欲减退,精神沉郁,被毛粗乱,消瘦和生长速度减慢,剖检可见肺脏轻度水肿,肾脏有点状出血坏死, PCR方法检测其淋巴结组织,可检测到PCV2存在。而免疫对照组攻毒后10天仅有一头猪表现精神沉郁,食欲减退,其余四头与空白对照组猪精神状态、行为活动和饮食正常;呼吸和体温也在正常范围内,无全身及局部不良反应。
表1 各组试验猪PCV2抗体检测及攻毒情况
试验结论:试验用亚单位疫苗安全性良好,商品仔猪免疫后无任何不良反应。效力试验表明仔猪免疫后产生的抗体水平高,能够抵抗强毒攻击,由此推断,Cap蛋白制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗可以有效防控II型圆环病毒的侵袭。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1.序列合成
通过序列比对,在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列,把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子,并在序列两端分别加上EcoR I和Not I 限制性酶切位点,合成cap基因,连接到PES载体上,按照设定的限制性内切酶进行酶切,将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上,转化感受态DH5a细胞,挑取阳性菌落,OMEGA试剂盒小量提取质粒,酶切鉴定阳性质粒;
2.原核表达载体的构建与鉴定
将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切,回收702bp的目的片段,与同样经EcoR
I和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a(+)连接,连接体系:目的片段5uL,pET-28a(+) 载体3uL,T4 DNA Ligase 1uL,10*buffer 1uL,4℃连接过夜;取10µL连接产物与100µL BL21感受态细胞混合,冰浴30min,42℃热激90s后迅速置冰浴中静置2min,加入800µL无抗生素的LB培养基,37℃ 150 rpm摇床培养45min后,5000rpm离心5min,弃上清,留200uL将菌体吹匀后涂布含kana,100μg/mL的LB平板,37℃温箱倒置培养12-16h;次日挑取白色单菌落,用含kana的LB培养基小量扩增培养;OMEGA试剂盒小量提取质粒;分别经PCR鉴定和EcoR І、Not I双酶切鉴定,将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析;
3.重组菌的诱导表达
将鉴定为阳性的BL21菌液按1:100的比例转接到含kana的LB液体培养基中,37℃振荡培养至对数生长期时,OD600值为0.6,加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、6h,同时设未诱导菌液对照和pET-28a/BL21诱导对照;取1mL菌液,13000rpm离心1min后,弃上清,加入50uL PBS和50uL 2*SDS-PAGE Loading Buffer重悬,沸水煮5 min,进行12%SDS-PAGE,结果显示,pET-28-cap在30kDa处有一条很浓的蛋白条带,与预期目的条带大小相符;而未经诱导的重组菌则无此条带,空载体质粒pET-28a(+)转化菌经诱导后在约7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带,说明蛋白已经得到了表达;
4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化
通过对诱导温度,诱导时间,诱导剂浓度等诱导条件的摸索,重组菌在37℃,10g/L 乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h,蛋白的可溶性表达量最大;冻融菌体并进行超声破碎30min,设置为间隔1秒,超声3秒,离心后收集上清和沉淀;上清和沉淀中的蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳;对可溶性的重组蛋白进行His-蛋白质镍亲和层析。
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130327 |