CN104474540A - 一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，包括以下步骤：提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因开放阅读框片段，并铆定定向插入T4噬菌体；利用免疫筛选的方法获取具有ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X-Blue ST1(CCTCC M 2014397)宿主细胞；发酵培养获得的X-BlueST1宿主细胞，诱导表达灭活后培养物作为抗原；ELISA标定抗原效价，并用生理盐水倍比稀释抗原终浓度为107U/ml；1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即为疫苗。本发明利用噬菌体表达猪圆环病毒Ⅱ型抗原并制备疫苗，避免了弱毒疫苗毒力返强风险，且采用发酵培养利于大规模工业化生产，成本远低于通过细胞培养的方式生产疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法。
背景技术
猪圆环病毒感染是由圆环病毒引起的猪的一种急性传染病。主要特征为消瘦、体质下降、贫血、黄疸、腹泻、发育不良、呼吸困难、母猪繁殖障碍的。伴有广泛的病理化。根据其血清型的不同可分为PCV1及PCV2。其中我国报道较多感染比较严重的为PCV2。目前治疗PCV2的方法多方法复杂，成本较高，从技术上取得的效果收益甚微。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，用以控制猪圆环病毒Ⅱ型病的感染，减少危害。
本发明提供了一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，为了对披露的实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。
本发明的一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法包括以下步骤：
提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)病毒培养液RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2开放阅读框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后将所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体；利用所述T4噬菌体侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞，原核表达OFR2基因重组蛋白，并免疫动物制备多抗， 利用制备的猪圆环病毒Ⅱ型多抗对插入ORF2基因片段的所述噬菌体进行免疫筛选，获取阳性克隆斑，扩增并测序鉴定插入序列的正确性；获取具有正确插入ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞；
噬菌体再次侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞，发酵培养，OD值为0.6时，加入终浓度为100μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达2h，诱导表达后培养物加入终浓度为1％的甲醛并在4℃，转速为120r/min下震荡灭活24小时；处理后的培养物作为免疫抗原。利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测制备的抗PCV2血清的效价，再根据所测得的效价，把抗体效价稀释成为1:300；用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍比稀释，稀释抗原终浓度为107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即得到最终所获得疫苗。
其中，以下菌株保藏于中国典型培养物保藏中心：
大肠杆菌Escherichia coli X-Blue ST1；
保藏编号：CCTCC M 2014397；
保藏日期：2014年9月1日；
简称为X-Blue ST1；
保藏于中国，武汉，武汉大学。
本发明的有益效果如下：
通过制备带有PCV2病毒的噬菌体展示表达抗原，并把其制备成疫苗，取得较好的保护效果。且可以大量生产只需细菌发酵培养，生产成本低于现行的细胞培养。由于噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗是重组单蛋白抗原，并且T4噬菌体感染具有细胞嗜性，避免了现行活疫苗返毒及引入外援病原体感染的风险。该疫苗易于制备且利于大规模生产及使用。
为了上述以及相关的目的，一个或多个实施例包括后面将详细说明并在权利要求中特别指出的特征。
附图说明
图1ORF2基因PCR扩增产物电泳图；
图2ORF2抗原蛋白的抗原表位分析。
具体实施方式
以下优选实施例，对本发明作详细描述，以使本领域的技术人员能够实践它们。
下面对本发明做详细描述。
实施例1猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的获取及免疫筛选多抗的制备
1猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的获取。
GENBANK上查找PCV2的ORF2序列，根据所获得的序列查找开放阅读框，并根据开放阅读框的序列设计以下引物：
上游引物5’-CGGGTACCGCCACCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’
下游引物5’-GCGGATCCTCACTTAGGGTTAAGTGGGGGG-3’
提取猪圆环病毒Ⅱ型病毒培养液的mRNA，反转录为cDNA,并以此为模板PCR扩增ORF2片段，目的基因扩增结果如图1所示，704bp中为目的条带，连接PMD-18T载体，测序获得的基因片段的特征如下：
ORF的长度为704bp，起始密码子为ATG,终止密码子为TGA。基因序列如下：
ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGACGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCATCGGTTATACTGTCAAGAAAACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGATTTTCTTCCCCCAGGAGGG GGCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAATGCCCTAACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCGAAACCTGTCCTTGATAGGACAATCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGAAATCAACTCTGGCTGAGACTACAAACTACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTACAATATCCGTATAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTAAGTGA
翻译获得的多肽氨基酸序列如下：
MTYPRRRFRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTIGYTVKKTTVRTPSWNVDMMRFNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDRTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNPK
DNAStart分析ORF-2蛋白的抗原特征如图2所示。
2猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因原核表达及多抗制备。
根据设计的PCR引物扩增基因片段，连接pMD-18T载体命名为pMD-18T-ORF2，用EcoR Ⅰ和hindIII分别双酶切重组克隆质粒pMD-18T-ORF2和表达载体pET-28a(+)。以4μl ORF2基因片段、1μlpET-28a(+)载体片段、1μl T4 DNA酶、1μl连接酶缓冲液、3.5μl ddH2O的体系4℃连接过夜，并将连接产物转化到Top10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热应激90s，再冰浴2-3min，加1ml LB液体培养基37℃摇半个小时，均匀涂在含氨苄西林(100μg/ml)的LB琼脂平板上37℃培养过夜。挑取阳性菌落，摇菌，提取质粒，进行聚合酶链式反应(PCR)和双酶切鉴定。
将pET-28a-ORF2转化入感受态E.coli BL21(DE3)中，在含50μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜。挑取单菌落，加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液A600达0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，37℃振荡诱导4h，离心，收集菌体。取1ml菌液，4℃，3000g/min离心5min，保留沉淀物，向沉淀物中加入70μl 1×TE缓冲液，重悬沉淀，加入4.5μl DTT，2μl 5×上样缓冲液，煮沸10min，4℃10000g离心10min，取15μl上清进行SDS-PAGE分析。
如所获蛋白条带正确，将培养所得菌体用PBS反复冲洗两次，再进行超声，超声仪设置为130W、开5s、停5s，超声30min，超声破碎菌体，12000r/min离心15min，收集沉淀。用含有8M尿素的蛋白缓冲液，4℃溶解1h。过镍柱，分离纯化表达的重组蛋白，并对纯化的重组蛋白进行梯度复性，并透析浓缩。
用纯化复性的原核表达蛋白免疫猪(20mg每头，皮下注射免疫),三免后采血，重组蛋白抗原包被ELISA检测抗体效价，抗体效价大于1:16时，采血，静置析出，离心后获得血清作为多抗。
实施例2猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因插入T4噬菌体
将猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段连接插入pMD-18T载体后，利用EcoR Ⅰ和hindIII双酶切，回收酶切片段，并用EcoRⅠ和hindIII酶切T4噬菌体表达质粒。回收酶切片段，T4连接酶连接基因片段到T4噬菌体的SOC位点，并用连接好的重组T4噬菌体侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞。
实施例3免疫筛选
1试剂的配制
LB四环素：每1mL蒸馏水中加10mg四环素，溶解后用0.22μm的滤器过滤除菌，-20℃保存。
麦芽糖补充的LB培养基：1L的LB培养基，121℃下0.2Mpa，20min， 加入0.22μm滤器过滤的1M MgSO4(10mL)和2M麦芽糖(3mL)。
NZY琼脂：NaCl 5g,MgSO4.7H2O 2g,酵母提取物5g,水解酪蛋白(NZ Qmine)10g,琼脂15g。加去离子水至1L,调pH＝7.5，121℃0.2Mpa，20min，降到室温后，倒入平皿。
NZY培养基：NaCl 5g,MgSO4.7H2O 2g,酵母提取物5g,NZ Qmine 10g。加去离子水至1L,调pH＝7.5，121℃0.2Mpa，20min。
NYZ顶层琼脂：NaCl 5.8g,MgSO4.7H2O 2g,1M Tris-HCl(pH＝7.5)50.0ml,2％(w/v)gelatin 0.5ml。准备1L NYZ灭菌后的培养基，加入0.7％(w/v)琼脂糖，0.2Mpa，121℃0.2Mpa，20min灭菌。
SM缓冲液：NaCl 5.8g,MgSO4·7H2O 2g,Tris·Cl 1mol/L(pH 7.5)50mL，2％gelat in 5mL。加蒸馏水至1L,121℃0.2Mpa，20min灭菌。
LB/麦芽糖/MgSO4培养基：1L LB培养基，121℃0.2Mpa，20min灭菌，然后加入过滤后的1M MgSO4(10mL)和过滤后的2M麦芽糖溶液(3mL)。
TNT缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween-20。
TNT封闭缓冲液(TNT缓冲液中加入1％明胶(m/v)+3％(m/v)牛血清白蛋白)，4℃保存备用。
10mM IPTG：溶解2.4g IPTG固体于1000mL水中，0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存。
2多抗处理
正常的猪血清中存在与大肠杆菌具有交叉免疫反应的抗体，在筛选过程中会呈现假阳性，从而影响筛选结果的准确性。在正式的免疫筛选之前需要去除免疫交叉抗体使其共沉淀。离心收集X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞，重悬后超声破碎，将超声破碎后的菌体，在4℃条件下，14000g离心10min，上清液即为处理好的大肠杆菌裂解液。用TNT封闭缓冲液以 1：10稀释抗体血清后，按照1:15的比例在抗血清中加入大肠杆菌裂解液。37℃孵育4-6h，4℃保存备用。
3免疫筛选
3.1噬菌体的平板培养
将X-Blue ST1 CCTCC M 2014397菌接种至LB液体培养基中，37℃振荡培养直到OD600值约为1.0，12000r/min离心1min收集菌体，用10mMMgSO4重悬，重悬后稀释成OD600＝0.5备用。培养使用10cm平皿，然后在离心管中分别加入200μl OD600＝0.5的菌液和10ul含所稀释106噬菌体表达的SM缓冲液，37℃孵育15min。将含有4mL融化的NZY顶层琼脂的试管温度控制在45℃左右，然后加入孵育好的菌液混匀后。迅速倒入37℃预热的NZY琼脂平板上，待冷却后，封板，37℃温箱中倒置培养6-8h。
3.2抗原蛋白的诱导表达
(1)将硝酸纤维素膜(NC膜)在10mM IPTG中浸泡5-10min并标记记号。取出后用滤纸吸干。
(2)从培养箱中取出平板，迅速将NC膜覆盖表面，与平板接触后切勿移动滤膜，在滤膜上扎小孔做位置标记后，将平板放在37℃温箱中温育6h。
(3)将平板置于4℃，30min或-20℃，5min中预冷，掀开平皿，用无菌镊子从平板上剥离NC膜，将NC用大量TNT缓冲液摇荡洗涤，用封口膜将相应的T4噬菌体平板包好，4℃保存直至得出免疫筛选结果以准备取样。
3.3显色
(1)洗涤：所有NC膜用TNT缓冲液，于室温震荡洗涤30min。
(2)封闭：用镊子将NC膜逐张转移至TNT封闭缓冲液的玻璃平皿中，37℃封闭60min。
(3)筛选：用镊子将NC膜逐张转移到含一抗的封闭缓冲液中，室温震荡孵育60min。
(4)使用Western-blott ing显色。
(5)阳性斑的状态为：因融合蛋白处于被感染细菌的周围，故阳性斑的颜色常为周围深，中央浅的环形斑。如图1所示，用记号笔在平板的相应的棕色点位置标识出阳性斑的位置。
3.4分离阳性噬菌体斑
在离心管中，加入200μL无菌的SM缓冲液。用微量移液器的枪头挑取噬菌体斑，将沾有噬菌斑的枪头置于SM缓冲液中，室温放置1h，4℃保存。送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
实施例4培养及疫苗的制备
上一步骤筛选获得的噬菌体再次侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞后，发酵培养，当OD值达到0.6时，加入终浓度为100μg/ml IPTG诱导表达2h，诱导表达后培养物加入终浓度为1％的甲醛并在4℃，转速为120r/min震荡灭活24小时；处理后的培养物作为免疫抗原。利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用间接ELISA方法检测制备的抗PCV-2血清的效价，再根据所测得的效价，把抗体效价稀释成为1:300；用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍比稀释，稀释抗原终浓度为107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐剂，乳化为油包水剂型即得到最终所获得疫苗。
所述疫苗佐剂可为通常将抗原和其他典型的添加剂溶解在合适的载体或溶剂系统，例如化妆品级白油、硅油等。
其中，PCV2弱毒疫苗为勃林格殷格翰动物保健有限公司生产的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗。
对于本发明的疫苗免疫效果的判定。
用本专利提供的方法制备的重组疫苗免疫猪后，ELISA检测血清中的PCV2抗体效价呈阳性。在上述免疫后的猪ELISA检测呈阳性的动物身上进 行PCV2攻毒，攻毒7天后，剖检攻毒后的猪，取猪的主要内脏组织分别进行培养分毒，组织稀释液及培养液PCV2特异性引物PCR呈阴性，转接细胞后无病变，说明实验动物未感染PCV2病毒。第三，免疫实验的同时设勃林格殷格翰动物保健有限公司生产的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗作为对照组。实验组和对照组的免疫后ELISA抗体效价都在1：800-1：3200之间，组间差异不显著(统计分析P＞0.05)，而未免疫空白对照为阴性。再次利用本专利制备的疫苗免疫空白对照组猪，ELISA检测，其抗体转阳，攻毒后，组织病毒分离呈阴性。说明该疫苗能够有效的诱导易感动物产生抗体，起到保护猪不受PCV2感染的作用。
Claims (5)
1.一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)病毒培养液RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2开放阅读框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后将所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体；利用所述T4噬菌体侵染X-Blue ST1CCTCC M2014397宿主细胞，原核表达OFR2基因重组蛋白，并免疫动物制备多抗，利用制备的猪圆环病毒Ⅱ型多抗对插入ORF2基因片段的所述噬菌体进行免疫筛选，获取阳性克隆斑，扩增并测序鉴定插入序列的正确性；获取具有正确插入ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞；
噬菌体再次侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞，发酵培养，OD值为0.6时，加入终浓度为100μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达2h，诱导表达后培养物加入终浓度为1％的甲醛并在4℃，转速为120r/min下震荡灭活24小时；处理后的培养物作为免疫抗原；利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测制备的抗PCV2血清的效价，再根据所测得的效价，把抗体效价稀释成为1:300；用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍比稀释，稀释抗原终浓度为107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即得到最终所获得疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体方法为：将所述改造后的ORF2基因片段连接插入pMD-18T载体，制成pMD-18T-ORF2；利用EcoR Ⅰ和hindIII双酶切，回收酶切片段，并用EcoR Ⅰ和hindIII酶切T4噬菌体表达质粒；回收酶切片段，T4连接酶连接基因片段到T4噬菌体的SOC位点。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猪圆环病毒Ⅱ型多抗的制备方法为：
用EcoRⅠ和hindIII分别双酶切重组克隆质粒pMD-18T-ORF2和表达载体pET-28a(+)；以4μl ORF2基因片段、1μl pET-28a(+)载体片段、1μl T4DNA酶、1μl连接酶缓冲液、3.5μl ddH2O的体系，4℃连接过夜，将连接产物转化到Top10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热应激90s，冰浴2-3min，加1ml LB液体培养基37℃摇40min，均匀涂在含氨苄西林(100μg/ml)的LB平板上37℃培养过夜；挑取阳性菌落，摇菌，提取质粒，进行聚合酶链式反应(PCR)和双酶切鉴定，得到pET-28a-ORF2；
将所述pET-28a-ORF2转化入感受态E.coli BL21(DE3)中，在含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜；挑取单菌落，加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液A600达0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，37℃振荡诱导4h，离心，收集菌体；取1ml菌液，4℃，8000g/min离心5min，保留沉淀物，菌体用PBS反复冲洗两次，再进行超声，超声仪设置为130W、开5s、停5s，超声30min，12000r/min离心15min，收集沉淀；向沉淀物中加入70μl 1×TE缓冲液，重悬沉淀，加入4.5μl二硫苏糖醇(DTT)，2μl 5×上样缓冲液，煮沸10min，4℃，10000g离心10min，取15μl上清进行SDS-PAGE分析；条带正确后，用含有8M尿素的缓冲液重悬沉淀；4℃条件下溶解1h；过镍柱，分离纯化表达的重组蛋白，对纯化复性的原核表达蛋白进行梯度复性，并透析浓缩；用纯化复性的原核表达蛋白免疫猪(每头20mg),三免后采血，重组蛋白抗原包被ELISA检测抗体效价，抗体效价大于1:16时，采血，静置析出，离心后获得血清作为多抗。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达，表达并纯化所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白，用重组蛋白制备多克隆血清，并利用获取的阳性多克隆血清，把插入ORF-2基因的T4噬菌体从T4噬菌体文库中筛选出来，免疫筛选获取阳性克隆斑，纯化测序鉴定，并把其作为侵染新的X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞的种毒。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述疫苗佐剂为化妆品级白油。
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| 王宪文 等: "猪圆环病毒II型衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达", 《中国农学通报》, vol. 24, no. 5, 31 May 2008 (2008-05-31), pages 58 - 61 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112126986A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-12-25 | 苏州京脉生物科技有限公司 | 一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法 |
| CN112126986B (zh) * | 2020-04-30 | 2023-07-18 | 苏州京脉生物科技有限公司 | 一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法 |
| CN116199751A (zh) * | 2023-03-13 | 2023-06-02 | 华中农业大学 | 一种细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法 |
| CN116199751B (zh) * | 2023-03-13 | 2024-03-19 | 华中农业大学 | 一种细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法 |
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