CN116199751A - 一种细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在细菌全基因组水平上高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法，该方法主要为三部分，第一部分是构建展示细菌蛋白的裂解性噬菌体文库，第二部分是利用噬菌体免疫共沉淀技术对噬菌体文库进行筛选，第三部分为二代测序结合生物信息学分析筛选出潜在的细菌高免疫原性的抗原蛋白。本发明提供的是一种细菌全基因组水平上、无偏好、高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法，该方法操作简便、成本低且可重复性强，在制备细菌的亚单位疫苗以及检测和诊断方面具有重要价值和应用潜力。

Description

一种细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结合噬菌体展示文库、免疫共沉淀、二代高通量测序等多种技术手段的细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法，本发明还涉及一种利用该方法从猪链球菌中筛选到的高免疫原性抗原蛋白。
背景技术
细菌性疾病是威胁人类生存的一大难题，如在历史上爆发的鼠疫、霍乱、炭疽及结核病等，这些细菌性传染病造成了大量人类死亡和难以估计的经济损失。除此之外，细菌还经常与其他病毒发生共感染。这些细菌性疾病不仅加重了全球的经济负担，也极大的影响着人类的健康。抗生素在治疗细菌性疾病中发挥了至关重要的作用，但是随着抗生素的大量使用导致耐药菌株频发，据统计，每年约有70万人因感染耐药菌而死亡，这给细菌性疾病的防控带来了更大的挑战。
疫苗在传染病的预防中发挥着无可替代的作用，研发细菌疫苗，预防细菌感染，减少耐药风险是当前防治细菌性疾病的迫切需求。然而，细菌的血清型众多，目前使用的灭活疫苗和减毒活疫苗，只能抵抗相同或相似血清型的细菌感染，交叉保护效率低。亚单位疫苗是一类以病原体主要抗原为疫苗靶标的新型疫苗，因而安全性高，是当前疫苗研发的重点，但是细菌基因组复杂，编码的蛋白众多，因此如何高通量筛选细菌具有交叉保护性的高免疫原性的抗原蛋白是细菌疫苗研发中亟需解决的重大问题。
尽管目前有一些筛选细菌免疫原性抗原的方法，但是这些方法非常有限，并且在筛选细菌抗原时存在筛选过程繁琐或者是花费昂贵等局限性，因此本发明以猪链球菌为例，筛选猪链球菌核心基因中具有高免疫原性的抗原蛋白，希望可以开发一种高通量、低成本、无偏见筛选细菌高免疫原性抗原的方法，为今后细菌疫苗的研发以及细菌性疾病的诊断提供一种新方案。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可以在细菌全基因组水平上无偏见、高通量筛选高免疫原性抗原蛋白的方法。
本发明的第二个目的是提供一种从猪链球菌核心基因组中筛选的具有高免疫原性的抗原蛋白，为猪链球菌疫苗的研发或者诊断提供抗原靶标。
为了实现第一个目的，本发明提供细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
1)根据细菌的ORF和蛋白质结构域的大小，将细菌核心基因编码的蛋白分割成由相同数目氨基酸组成的片段，然后针对这些片段设计引物，以细菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物等量混合后进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用；
2)使用T4连接酶将细菌的核心基因片段与T7噬菌体的基因组DNA融合连接，将蛋白展示于T7噬菌体的衣壳表面，通过体外包装使其成为完整的噬菌体颗粒，并在宿主细胞上增殖，完成裂解性细菌抗原噬菌体展示文库的构建；
3)将细菌抗体阳性血清与噬菌体展示文库共孵育，用protein A和protein G包被的磁珠回收与抗体结合的噬菌体，利用噬菌体免疫共沉淀技术对噬菌体文库进行筛选；
4)以富集在磁珠上的噬菌体基因组为模板，设计引物，通过两轮扩增，对PCR产物进行高通量测序，利用开源软件对测序结果进行生物信息学分析，最终筛选出细菌免疫原性抗原并进行验证。
其中，在对细菌核心基因编码的蛋白进行分割时，1)所述蛋白的片段均为200个氨基酸的等长蛋白；2)同一蛋白两个相邻的片段之间重叠100个氨基酸，位于每个蛋白尾端不足100个氨基酸的片段则从该蛋白基因的尾端3’端向前5’端拉长至200个氨基酸，位于基因3’末端不足5个氨基酸的蛋白则直接舍弃；3)对于不足200个氨基酸的蛋白在保证其蛋白ORF正确的前提下向后紧邻的一个基因拉长至200个氨基酸，避免构建文库时因所展示的蛋白大小不一而造成的文库偏差和方便该基因的扩增。
本发明通过将细菌抗原的外源基因与T7噬菌体的衣壳蛋白10B基因相融合，通过体外连接形成完整的噬菌体基因组。具体是通过体外包装融合了细菌抗原基因的噬菌体基因组，并在宿主细胞上增殖，完成细菌噬菌体文库的构建从而将外源的细菌蛋白展示于T7噬菌体的衣壳表面。
本发明构建的噬菌体文库为裂解性噬菌体文库，并且展示的是均等长度的蛋白，避免文库的选择偏好性。
与传统噬菌体的多次筛选不同，该筛选方法仅对噬菌体文库进行一轮筛选，避免了在多轮筛选过程中一些与抗体具有亲和力但是处于生长劣势的噬菌体丢失。
在二轮PCR的下游引物序列上添加了index序列，这样可以对多个样品同时测序并通过index区分不同的样品。
本发明选择能够引起人畜共患病的猪链球菌为模式细菌，完成了猪链球菌噬菌体展示文库的构建及抗原蛋白的筛选，本发明的筛选方法也适用于其他人源和动物源性的细菌。
为了实现第二个目的，本发明提供一种蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。申请人从猪链球菌基因组DNA中扩增基因，构建了蛋白的表达质粒并转化感受态，获得纯化的重组蛋白。经ELISA验证，该蛋白能与小鼠的猪链球菌阳性血清反应。利用纯化的蛋白对动物进行免疫，能够产生较高的血清抗体，对免疫后的动物进行攻毒，该蛋白能降低小鼠的发病及死亡率，对小鼠产生了20％的保护。
以上结果表明，本发明筛选的蛋白是一种猪链球菌高免疫原性抗原蛋白，可应用于猪链球菌的检测以及相关疾病的临床诊断，也可用于制备亚单位疫苗，在猪链球菌的传染病防控中有重要价值和应用潜力。
更详尽的技术方案参见具体实施例。
附图说明
图1：高通量筛选细菌具有免疫原性抗原蛋白的流程示意图。
图2：SDS-PAGE以及Western-blot验证所表达的蛋白。
图3：通过ELISA验证所筛选的蛋白能与阳性血清反应。
图4：通过ELISA检测免疫蛋白后小鼠产生的血清抗体效价。
图5：通过攻毒实验检测抗原蛋白对小鼠的保护力。
图中，575为申请人对所筛选的猪链球菌免疫原性抗原蛋白的自命名。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
关键材料及其说明：
猪链球菌SC19：是申请人华中农业大学构建的一株猪链球菌2型血清型弱毒株，该毒株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M2016584，且已在CN 108410784A的专利文献中公开。
T7 10-3b载体：T7 10-3b载体是基于T7噬菌体的蛋白质展示载体，该载体可以在T7噬菌体衣壳10B蛋白的C端融合展示外源蛋白，能以5-15个拷贝数展示高达1200个氨基酸的蛋白。靶序列可以克隆到10B蛋白第348位氨基酸后面的一系列酶切位点中与10B蛋白的C末端融合表达。该载体为商业化载体，可购买得到。
BLT5615细胞：宿主菌BLT5403或者BLT5615内含可表达10A蛋白的质粒，可以为噬菌体提供额外的10A衣壳蛋白，为商业化菌株。
其它如无特殊说明的材料，均为本领域常规材料。
序列表说明：
SEQ ID NO.1：本发明所设计的猪链球菌1986条等长基因片段之一，含有该基因的噬菌体文库与猪链球菌高免血清进行反应，并通过二代高通量测序和数据分析筛选到该基因，设计引物扩增该基因并对蛋白进行表达，可得到核苷酸如SEQ ID NO.12所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的抗原蛋白。
SEQ ID NO.2-3：用于扩增SEQ ID NO.1所示基因的正、反引物序列。
SEQ ID NO.4-5：扩增噬菌体单斑的正、反引物序列，用于扩增含有细菌抗原的DNA区段，可区分阳性与野生型噬菌体。
SEQ ID NO.6-7：对噬菌体文库进行二代高通量测序的一轮PCR扩增引物，用于扩增噬菌体免疫沉淀后噬菌体基因组上含有细菌抗原区段的DNA。
SEQ ID NO.8-9：对噬菌体文库进行二代高通量测序的二轮PCR扩增引物，以噬菌体免疫沉淀后的一轮PCR产物为模板，在序列上添加用于高通量测序的磷酸化碱基以及区分样品的index序列。
SEQ ID NO.10-11：用于扩增抗原蛋白的正、反向引物，以猪链球菌基因组DNA为模板扩增得到核苷酸如SEQ ID NO.12所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的抗原蛋白。
SEQ ID NO.12-13：本发明筛选到的一种抗原蛋白的编码核苷酸序列和氨基酸序列。
实施例1：构建猪链球菌的噬菌体文库
1.统计猪链球菌的核心基因并设计展示蛋白片段的大小
首先我们根据2015年已发表的文章(Weinert LA，等.Nat Commun.2015.PMID:25824154)统计了猪链球菌一共793个核心基因，我们通过NCBI数据库下载这些核心基因的蛋白序列，并通过NCBI blastp找到在2型血清型猪链球菌SC19基因组中的这793个核心基因，然后将每一个蛋白的基因平均分成200个氨基酸的片段，相邻两个片段重叠100个氨基酸，对于3’末端不足100个氨基酸的片段，将其3’末端向5’端前移至200个氨基酸，保证每个片段的大小均为200个氨基酸，这样可以保证不会因为展示肽段的大小不同而影响噬菌体的生长偏差，对于3’末端不足5个氨基酸的片段则直接舍弃。而对于一些不足200个氨基酸的蛋白，从该蛋白的起始密码子开始到终止密码子后再向紧邻的后一个基因延长至200个氨基酸，这样在保证其蛋白序列正确的前提下还方便该基因的扩增。最后将793个核心基因共分割成1986条等长的基因片段。
2.扩增猪链球菌的核心基因
1)引物的设计
在设计引物之前，我们先统计了这1986条基因序列的酶切位点，为了方便扩增，我们将这些基因片段一共分成了三类：第一类为不含有EcoR Ⅰ和Hind III酶切位点的片段，在设计引物时在引物的5’端加上EcoR Ⅰ的酶切位点，在3’端加上Hind III的酶切位点，并在两端的酶切位点上加上保护性碱基；第二类为不含有BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点的序列，在引物的5’端加上BamH Ⅰ的酶切位点，在3’端加上NotⅠ的酶切位点，并在两端的酶切位点上加上保护性碱基；第三类是含有酶切位点而不能直接使用EcoR Ⅰ和Hind III或者是BamH Ⅰ和Not Ⅰ这两对酶切位点进行酶切的片段，则通过无义突变将片段中的酶切位点进行突变后在引物的5’端和3’端分别加上EcoR Ⅰ和Hind III或者是BamH Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点，并在两端的酶切位点上加上保护性碱基。最终使用EcoR Ⅰ和Hind III酶切位点酶切的片段共有1433个序列，使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点进行酶切的序列有553个序列。由于扩增的核心基因片段过多，我们以一个序列为例，以下试验仅列出该序列的引物作为参考，建库基因序列详见SEQ ID NO.1。
2)猪链球菌核心基因的扩增
以猪链球菌SC19的基因组为模板，扩增猪链球菌的核心基因片段，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量，在1986条扩增的序列中，除其中一个片段没有扩增出条带，其它片段均扩增出明显的PCR条带。定量后将相同酶切位点的DNA等量混合进行琼脂糖凝胶电泳，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用，测量DNA浓度，用QuickCutTM Hind III/QuickCutTM EcoR Ⅰ或者QuickCutTM BamH Ⅰ/QuickCutTM Not Ⅰ(Takara)将片段的DNA进行双酶切，并经过琼脂糖凝胶电泳切胶回收DNA，分光光度计测量浓度后保存备用。PCR扩增体系、酶切体系以及反应条件如下：
核心基因片段的PCR扩增体系：
Figure BDA0004123648400000061
引物序列(大写字母为酶切位点)：
1-F：5’-ccgGAATTCtatggctcgtattgctgga-3’(SEQ ID NO.2)
1-R：5’-ggcAAGCTTgtgcagatttagcagcag-3’(SEQ ID NO.3)
核心基因片段的PCR扩增条件：
95℃3min，95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，进行30个循环，72℃延伸5min。
基因片段的DNA酶切体系：
Figure BDA0004123648400000062
反应条件：
酶切产物置于37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用。
3.构建猪链球菌的噬菌体文库
将实验室已经提取好的T7噬菌体的基因组(T7 10-3b)用QuickCutTM Hind III/QuickCutTM EcoR Ⅰ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶后采用OMEGA凝胶回收试剂盒回收DNA。回收后采用赛默飞的T4连接酶(货号EL0012)，将酶切好的DNA片段与T7噬菌体载体体外连接，得到完整的噬菌体基因组。利用实验室已有的包装提取物(公司：
Figure BDA0004123648400000063
产品货号：70548)体外包装连接后的噬菌体基因组使其体外组装成完整的噬菌体颗粒，感染宿主细胞BLT5615后获得猪链球菌的噬菌体文库。在获得猪链球菌的噬菌体文库后，随机挑选20个噬菌斑，并以白色小枪头蘸取噬菌体单斑为模板进行PCR扩增，送往公司测序，检测文库展示序列的多样性及正确性。噬菌体基因组的酶切体系、连接体系、反应体系以及PCR的扩增体系和反应体系如下：
噬菌体基因组的酶切体系：
Figure BDA0004123648400000071
反应条件：
酶切产物置于37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用。
体外连接反应体系(5μl)：
Figure BDA0004123648400000072
反应条件：
将上述混合物置于PCR仪16℃过夜孵育。
噬菌体的PCR扩增体系：
模板(噬菌斑)
Figure BDA0004123648400000073
引物序列：
J-F：5’-CGTTATCGGCCTGTTCAT-3’(SEQ ID NO.4)
J-R：5’-GGCAGTCTCAACGTTCAT-3’(SEQ ID NO.5)
噬菌体的PCR扩增条件：
95℃3min，95℃15sec，60℃15sec，72℃25sec，进行30个循环，72℃延伸5min。
4.计算噬菌体文库的效价
在构建完噬菌体文库以及在做噬菌体免疫沉淀之前，需要计算噬菌体文库的效价，以确定筛选时加入噬菌体的量。吸出100μl噬菌体原液加入含有900μl Pi-Mg buffer(26mM Na2HPO4、68mM NaCl，22mM KH2PO4、1mM MgSO4，pH 7.5)的1.5ml EP管中并记为10-1，在涡旋震荡仪上混匀后，吸出100μl至下一个含有900μl Pi-Mg buffer的1.5ml EP管中并记为10-2，然后按照10倍比依次往后稀释至10-9。取出3个10ml EP管并加入300μl培养在对数期的5615菌液，再加入30μl 1mmol/ml的IPTG，将稀释好的10-7、10-8和10-9的噬菌体各取出100μl与5615菌液混匀，加入7ml含有氨苄青霉素的半固体，颠倒混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃恒温培养箱培养4～6小时。最后对平板上的噬菌斑进行计数，10-7、10-8和10-9平板上的噬菌斑个数分别为290、33和4，那么噬菌体的效价为(290+330+400)/3×10-7×10＝3.4×1010pfu/ml。
实施例2：高通量筛选猪链球菌核心基因组中高免疫原性的抗原蛋白
1制备猪链球菌的高免血清
1)制备小鼠的高免血清
10只六周龄的BALB/c雌鼠，每组5只，一组活菌腹腔感染100μl SC19菌液，另外一组作为对照组腹腔注射同样体积的PBS，一共免疫三次，每次间隔的时间分别为14天和7天，每次感染的菌量为4×107cfu；每次免疫的前一天对小鼠进行尾静脉采血，并将采集的血清放入37℃恒温培养箱中1小时，6000g离心8min分离小鼠血清。最后一次采血在第三次免疫后7天。
2)定量小鼠血清中的IgG含量
将对照组和实验组分离的5只小鼠血清等量混合，取出4μl血清至16μl PBS中将血清稀释5倍。取出已制备好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔加入10μl稀释后的实验组和对照组的血清样品，并在剩余的孔中加入2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg的BSA。电压80V约40min蛋白样品跑完浓缩胶后，切换电压至120V跑完分离胶。然后将蛋白胶放在含有2.5g/L的考马斯亮蓝染液中染色2h，之后转至脱色液(10％冰醋酸，5％乙醇)中进行脱色。脱色后通过计算BSA的灰度值并制作蛋白的标准曲线，最后根据IgG的分子量以及BSA的标准曲线定量血清抗体中的IgG含量。
2噬菌体免疫共沉淀筛选与抗体结合的噬菌体
在封闭好的1.5ml的EP管(TBST配置3％的BSA在4℃过夜封闭)中加入2.0×108pfu(文库个体约为2.0×103，用于筛选的噬菌体为单个噬菌体的105)的T7噬菌体，并用PBS稀释至1ml。每个样品中加入含有2μg IgG的小鼠高免血清，每个样品做3个重复。将试管放在旋转混匀器上置于4℃孵育18h。将protein A和protein G包被的磁珠(公司：赛默飞，产品货号：88803)用洗涤缓冲液(0.02％ Tween 20的磷酸盐缓冲液)洗涤两遍后用等体积的PBS重悬，每个试管加入40μl的磁珠并放入4℃孵育4h。孵育结束后将试管置于离心机中1000g离心1min，然后放在磁力板架上，移液器弃去液体并加入600μl的IP wash buffer(150mMNaCl，50mM Tris-HCl，0.1％ NP40)重悬磁珠并转移至新的1.5ml EP管中，放在磁力板架上弃去液体后再次加入1ml的IP wash buffer洗去未结合的噬菌体。最后加入40μl的灭菌水，98℃煮10min。将煮过的样品8000g离心2min后放在磁力板架上吸出上清，作为一轮PCR扩增的模板。PCR扩增后通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收DNA，并以一轮回收产物作为二轮PCR扩增的模板。在设计二轮的DNA扩增引物时，在3’的引物上加上index以方便后续区分不同的样品。PCR扩增完成后通过琼脂糖凝胶电泳，采用OMEGA凝胶回收试剂盒回收DNA。将二轮回收的DNA利用华大基因的测序平台进行二代高通量测序。
一轮PCR的扩增体系如下：
Figure BDA0004123648400000091
一轮引物参考序列：
引物F1:5’-CCGAACGCAGCAAACTACGC-3’(SEQ ID NO.6)
引物R1：5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-GGGGTTAACTAGTTACTCGAGTGCGG-3’(SEQ ID NO.7)
噬菌体的PCR扩增条件：
95℃3min，95℃15sec，60℃15sec，72℃35sec，进行30个循环，72℃延伸5min。
二轮PCR扩增体系如下：
Figure BDA0004123648400000092
二轮引物参考序列：
F2:5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCGTATTCCAGTCAGGTGTGATG CTCGG-3’(SEQID NO.8)
R2:5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG-CCATTACCGT-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCT-3’(波浪线部分为index序列，SEQ ID NO.9)
噬菌体的PCR扩增条件：
95℃3min，95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，进行30个循环，72℃延伸5min。
3通过数据分析模型分析测序结果
分析过程：利用开源软件fastp以及cutadapt去除低测序质量的碱基以及与后续匹配无关的接头序列，利用开源软件kallisto对测序结果进行匹配与计数，最后用开源软件phip-stat筛选出显著富集的多肽。Kallisto参数设置为kallisto quant--single--plaintext--fr-stranded-l 75-s 0.1-t 4，其余所有参数设置均为默认参数。通过以上实验及分析，在猪链球菌的噬菌体文库中我们一共筛选出18个高免疫原性的抗原蛋白。
4验证所筛选出来的蛋白是高免疫原性的蛋白
为了验证所筛选出来的蛋白和测序分析结果一致，我们将筛选出来的蛋白进行表达纯化。并利用间接ELISA的方法来验证该方法的可靠性。蛋白表达过程以及间接ELISA的方法如下：
1)构建蛋白表达质粒：
我们以其中一个蛋白为例讲述其表达纯化过程。采用OMEGA质粒提取试剂盒提取pET-32a的质粒并用QuickCutTM HindIII/QuickCutTM EcoRⅠ酶切获得线性化的表达载体。设计扩增蛋白基因的引物，以SC19的基因组为模板，PCR扩增片段，并用QuickCutTMHindIII/QuickCutTM EcoRⅠ对片段进行酶切。酶切后的载体和片段通过T4连接酶连接并转化至DH5α感受态细胞，37℃孵育45min，将细胞涂在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB固体平板上，放在37℃的恒温培养箱中过夜培养。次日挑取单菌落至10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时后提取质粒并PCR鉴定，鉴定后挑取阳性克隆送往测序公司测序。酶切体系、扩增体系、连接体系及反应条件如下：
pET-32a质粒酶切体系如下：
Figure BDA0004123648400000101
Figure BDA0004123648400000111
反应条件：
酶切产物置于37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用。
蛋白片段的PCR扩增体系：
Figure BDA0004123648400000112
引物序列：
575F：5’-CCGgaattcatggctcgtattgctgga-3’(SEQ ID NO.10)
575R：5’-ggcAAGCTTttttttcttacctgcgatc-3’(SEQ ID NO.11)
蛋白片段的PCR扩增条件：
95℃3min，95℃15sec，60℃15sec，72℃20sec，进行30个循环，72℃延伸5min。蛋白片段的DNA酶切体系：
Figure BDA0004123648400000113
反应条件：
酶切产物置于37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用。
表达质粒的连接体系：
Figure BDA0004123648400000114
反应条件：
将上述混合物置于PCR仪16℃过夜孵育。
表达蛋白的核苷酸序列详见SEQ ID NO.12，氨基酸序列详见SEQ ID NO.13。
2)蛋白的表达及纯化：
将测序正确的质粒转化到表达感受态BL21(DE3)并涂到含有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的固体LB平板上，37℃恒温培养箱培养12小时，挑取单菌落至含有10mL培养基的细菌瓶中，并添加氨苄青霉素和氯霉素并使其终浓度为100μg/ml和34μg/mL。次日按照1：100转接至1L的LB培养基中，放入37℃摇床中200rpm摇菌至OD值约为0.6左右，将摇床温度调至30℃，并加入1ml的IPTG使其终浓度为1mmol/L，继续培养5小时。5小时后将培养的细菌倒入离心瓶中，6000rpm离心10min收集沉淀，PBS洗涤沉淀两遍。150ml的结合缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM咪唑)重悬细菌沉淀并用高压破碎仪低温破碎半个小时左右，待液体澄清后收集破碎后的蛋白，30000g离心20min收集上清，并用0.22μm的滤器过滤上清，将过滤好的蛋白上清通过蠕动泵用His标签的蛋白纯化预装柱纯化蛋白。待蛋白液流尽之后更换洗涤缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，20mM咪唑)洗涤杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，400mM咪唑)洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白用10kDa的超滤管对蛋白进行超滤浓缩，同时加入低盐的GE buffer(100mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)置换出高盐的洗脱缓冲液，最后将超滤好的蛋白分装并存放在－80℃备用。
3)SDS-PAGE和Western-blot验证纯化的蛋白
将纯化后的蛋白取出10μL加入含有30μL PBS的1.5ml EP管中，再加入10μL 5×蛋白上样缓冲液，混匀后100℃煮10min。取出两块已制备好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，一块用于SDS-PAGE验证所纯化的蛋白，另一块用于Western-blot验证。其中作为SDS-PAGE的蛋白胶中加入10μL稀释后的蛋白，其他的孔依次加入2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg的BSA以方便对蛋白进行定量。在80V电压下跑完浓缩胶后切换电压至120V跑完分离胶。蛋白胶跑完之后一块直接放入含有2.5g/L的考马斯亮蓝染液中染色2h，之后转至脱色液(10％冰醋酸，5％乙醇)中进行脱色。而另一块蛋白胶则用于Western-blot验证。
切下蛋白凝胶的胶块，在65V的电压下转35min将蛋白转至PVDF膜上。TBST洗膜3遍，每次间隔5min，5％脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗膜3遍，每次间隔5min，鼠抗His-Tag的单克隆抗体作为一抗室温孵育2h(公司：Abclonal货号：AE003，抗体用TBST以1：4000倍稀释)，TBST洗膜5遍，每次间隔5min，HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗孵育45min(公司：Abbkine货号：A21010，用TBST以1：8000倍稀释)，TBST洗膜5遍，每次间隔5min，ECL发光显色液A:B等体积混合后避光使用化学发光仪显色(公司：Biosharp货号：BL520A)，所纯化的蛋白结果如图2所示。
4)间接ELISA验证所筛选蛋白
将纯化好的蛋白用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释并按照每孔100ng/100μL包被酶标板，放置4℃过夜。次日弃去包被液后用PBST洗涤5次，每孔加200μL 3％的BSA于37℃封闭1h。封闭结束后弃去封闭液，PBST洗涤5遍后于第一孔加入200μL的PBST，其余孔加上100μL的PBST，将用于筛选的阳性血清从第一个孔以1：100开始按照2倍比依次往后稀释，37℃孵育1h。弃去血清，PBST洗涤5遍，每孔加100μL HRP标记的羊抗鼠二抗(公司：Abbkine，货号：A21010)37℃孵育50min。弃去二抗，PBST洗涤5遍，每孔加100μL TMB显色液。室温显色至不变色后每孔加100μL 2M的浓硫酸终止显色。最后通过酶标仪测定OD450处的吸光度。所筛选的蛋白验证结果如图3所示，该蛋白与阳性血清反应所测得的OD值明显高于阴性血清组。
实施例3：动物实验验证所筛选的蛋白对小鼠是否具有保护效果
1.动物免疫实验
随机取10只六周龄BALB/c雌鼠分成两组，每组5只，一组为实验组，另外一组为对照组。实验组的每只小鼠免疫30μg纯化的蛋白，将蛋白用PBS稀释至100μL并与赛彼科ISA201佐剂等体积混合，每只小鼠200μL进行腹腔免疫。对照组则将PBS与佐剂等体积混合后每只小鼠腹腔注射200μL。一共免疫两次，每次间隔14天。在第二次免疫前一天对小鼠进行尾静脉采血，二免后10天对小鼠进行二次采血。
2.间接ELISA检测小鼠的血清抗体
在第二次采血后，检测小鼠的血清抗体。将纯化好的蛋白用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释并按照每孔100ng/100μL包被酶标板，放置4℃过夜。次日弃去包被液后用PBST洗涤5次，每孔加200μL 3％的BSA于37℃封闭1h。封闭结束后弃去封闭液，PBST洗涤5遍后除第一孔加入200μL的PBST，其余孔加上100μL的PBST，将蛋白二次免疫后的血清从第一个孔以1：100开始按照2倍比依次往后稀释，37℃孵育1h。弃去血清，PBST洗涤5遍，每孔加100μL HRP标记的羊抗鼠的二抗(公司：Abbkine，货号：A21010)37℃孵育50min。弃去二抗，PBST洗涤5遍，每孔加100μLTMB显色液，置于避光处，室温显色至不变色后每孔加100μL2M的浓硫酸终止显色。最后通过酶标仪测定OD450处的吸光度。小鼠抗体效价的测定结果如图4所示，免疫该蛋白的小鼠与对照组相比产生了更高的抗体效价。
3.动物攻毒实验
在第二次采血后，通过动物攻毒实验来验证筛选的蛋白对动物是否具有保护效果。挑取新鲜的SC19单菌落至10ml含有10％的新生牛血清的TSB培养基中培养过夜，次日按照1：100转接至50ml含有10％的新生牛血清的TSB培养基中培养9小时，将细菌倒入离心管中8000g离心5min，弃去上清，加入10ml PBS洗涤两遍。最后将细菌沉淀用2ml的PBS重悬，并且按照10倍比稀释法对细菌进行稀释，稀释后将细菌涂至含有10％新生牛血清的TSA平板上，37℃恒温培养箱培养过夜，次日通过平板计数法对细菌进行计数。计数后用PBS将菌液浓度调整至3.0×1010cfu/ml，每只小鼠的腹腔攻毒200μL的细菌，剂量为6×109cfu。攻毒后对小鼠观察一周，统计小鼠的发病及死亡情况。蛋白对小鼠的保护效果如图5所示，与PBS组的小鼠相比，使用菌株SC19对小鼠攻毒后，该蛋白对小鼠产生了20％的保护。

Claims (10)

1.一种细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据细菌的ORF和蛋白质结构域的大小，将细菌核心基因编码的蛋白分割成由相同数目氨基酸组成的片段，然后针对这些片段设计引物，以细菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物等量混合后进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用；
2)使用T4连接酶将细菌的核心基因片段与T7噬菌体的基因组DNA融合连接，将蛋白展示于T7噬菌体的衣壳表面，通过体外包装使其成为完整的噬菌体颗粒，并在宿主细胞上增殖，完成裂解性细菌抗原噬菌体展示文库的构建；
3)将细菌抗体阳性血清与噬菌体展示文库共孵育，用protein A和protein G包被的磁珠回收与抗体结合的噬菌体，利用噬菌体免疫共沉淀技术对噬菌体文库进行筛选；
4)以富集在磁珠上的噬菌体基因组为模板，设计引物，通过两轮扩增，对PCR产物进行高通量测序，利用开源软件对测序结果进行生物信息学分析，最终筛选出细菌免疫原性抗原并进行验证。
2.如权利要求1所述的筛选细菌免疫原性抗原蛋白的方法，其特征在于：在对细菌核心基因编码的蛋白进行分割时，1)所述蛋白的片段均为200个氨基酸的等长蛋白；2)同一蛋白两个相邻的片段之间重叠100个氨基酸，位于每个蛋白尾端不足100个氨基酸的片段则从该蛋白基因的尾端3’端向前5’端拉长至200个氨基酸，位于基因3’末端不足5个氨基酸的蛋白则直接舍弃；3)对于不足200个氨基酸的蛋白在保证其蛋白ORF正确的前提下向后紧邻的一个基因拉长至200个氨基酸，避免构建文库时因所展示的蛋白大小不一而造成的文库偏差和方便该基因的扩增。
3.如权利要求1所述的筛选细菌免疫原性抗原蛋白的方法，其特征在于：所述宿主细胞为BLT5615或BLT5403细胞。
4.如权利要求1所述的筛选细菌免疫原性抗原蛋白的方法，其特征在于：所述细菌是猪链球菌。
5.一种蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
6.编码权利要求5所述蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
7.包含权利要求6所述基因的表达载体。
8.包含权利要求7所述表达载体的宿主菌。
9.权利要求5所述的蛋白，或权利要求6所述的基因，或权利要求7所述的表达载体，或权利要求8所述的宿主菌在制备猪链球菌检测试剂盒中的应用。
10.权利要求5所述的蛋白，或权利要求6所述的基因，或权利要求7所述的表达载体，或权利要求8所述的宿主菌在制备猪链球菌亚单位疫苗中的应用。
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