CN117736275A - 一种基于lsdv噬菌体展示文库筛选的蛋白质及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用LSDV噬菌体展示文库高通量、无偏见筛选到的LSDV抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首先构建了展示LSDV的噬菌体文库，接着利用LSDV阳性血清对文库进行噬菌体免疫共沉淀筛选，通过二代测序以及数据分析，从文库中筛选出LSDV的抗原蛋白，经验证，该抗原蛋白能特异性与LSDV抗体反应，在LSDV诊断试剂研发中有很高的应用价值。

Description

一种基于LSDV噬菌体展示文库筛选的蛋白质及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于牛结节性皮肤病病毒(lumpy skindisease virus，LSDV)噬菌体展示文库筛选获得的抗原蛋白，本发明还涉及该蛋白的制备方法及其应用，尤其是在LSDV病毒检测中的应用。

背景技术

牛养殖业是我国畜牧业的重要组成部分，近年来，随着人们生活水平的提高，牛肉和牛奶的需求量不断增加。随着国际、国内牛产品和活牛贸易量的增加、规模化养牛水平提高以及自然等因素，牛病毒性传染病对养殖业以及公共卫生安全的影响日益严重。因此，对牛病毒性传染病的及时诊断和预防十分重要。

疫苗是控制传染性疾病的有效措施。虽然目前有一些牛常见传染病的疫苗已经用于生产实践，但是依旧有一些病毒性传染病缺乏疫苗，再加之有些病毒存在多个亚型或毒株以及毒株不断发生变异等原因，也使得一些疫苗免疫失败或者无法对动物产生交叉保护。除此之外，加快特异性诊断靶标研发，及时发现病原并控制病原的传播，这对预防传染性疾病的爆发至关重要。基于此，申请人建立了展示全球以牛亚科动物为宿主的已知所有病毒的噬菌体文库，并利用病毒感染后的牛阳性血清，采用噬菌体免疫共沉淀技术，对所有已知牛病毒进行全基因组扫描，鉴定新抗原以及已知抗原的高免疫原性区域或表位，以为新型疫苗研发和开发特异性的诊断试剂等提供新的抗原靶标。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用LSDV噬菌体展示文库高通量、无偏见筛选到的LSDV抗原蛋白，并进一步提供该抗原蛋白的制备方法及其应用，旨在为特异性诊断试剂的开发提供新的抗原靶标。

为了实现上述目的，本发明首先构建了展示LSDV的噬菌体文库，接着利用感染了LSDV的阳性血清对文库进行噬菌体免疫共沉淀筛选，通过二代测序以及数据分析，从文库中筛选出LSDV的抗原肽段。

具体而言，所述抗原蛋白的筛选方法如下：

1)从NCBI Virus中搜索LSDV，一共搜索到29株核苷酸序列，包含4522条蛋白序列，将蛋白序列切割为56个氨基酸的肽段并去冗余后一共有1792条肽段，其中包括一条LSDV的切割肽段，其序列如SEQ ID NO.3所示；

2)将1792条肽段的两端加上EcoR I和HindⅢ的酶切位点以及同源臂序列后每条肽段的长度均为200bp，然后合成这些肽段；

3)以合成好的肽段序列为模板进行PCR扩增，将扩增产物胶回收后用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用；

4)使用T4连接酶将牛病毒的基因片段与T7噬菌体的基因组DNA融合连接，将蛋白展示于T7噬菌体的衣壳表面，通过体外包装使其成为完整的噬菌体颗粒，并在宿主细胞上增殖，完成裂解性噬菌体展示文库的构建；

5)将感染LSDV的牛血清与噬菌体展示文库共孵育，用protein A和protein G包被的磁珠回收与抗体结合的噬菌体，利用噬菌体免疫共沉淀技术对噬菌体文库进行筛选；

6)以富集在磁珠上的噬菌体基因组为模板，设计引物，通过两轮扩增，对PCR产物进行高通量测序，利用开源软件对测序结果进行生物信息学分析，最终筛选出抗原蛋白并进行验证。

通过上述方法，本发明筛选到一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为了对抗原蛋白进行验证，对筛选到的蛋白进行了表达纯化，步骤如下：

1)扩增表达该蛋白的核苷酸序列并克隆至蛋白表达载体pET28a，构建该蛋白的表达质粒；

2)将重组表达质粒转化至感受态细胞进行诱导表达，获得包含所述蛋白质的宿主菌；

3)利用His标签的蛋白纯化预装柱纯化蛋白从宿主菌中分离纯化所述蛋白质。

本发明的具体实施例中通过Western blot和间接ELISA试验验证了所述蛋白的反应原性。

本发明的具体实施例中还进一步验证了所述蛋白质检测LSDV的特异性和敏感性。

综合以上试验，本发明所筛选的蛋白质能够用于制备牛结节性皮肤病检测试剂盒。

本发明进一步提供了一种检测LSDV的间接ELISA方法，包括以下步骤：

1)用所述的蛋白质包被酶标板；

2)用封闭液封闭酶标板；

3)将待测血清样品稀释后加入酶标板中进行一抗孵育；

4)将酶标二抗稀释后加入酶标板中进行酶标二抗孵育；

5)加入显色液和终止液，采用酶标仪测量OD450数值并进行结果判定。

该方法可用于LSDV所致疾病的诊断，例如用于牛结节性皮肤病的诊断。另外，该方法也能用于以非疾病诊断为目的的LSDV实验室筛查鉴定。

当然，本发明的技术方案并不局限于实施例，利用本发明所提供的蛋白，本领域技术人员还能使用其它方法进行替换并用于检测，例如，利用该蛋白制备抗体并对LSDV抗原进行直接ELISA检测，这些不经过创造性劳动的改进方案也都在本发明的保护范围内。

本发明的有益效果是：

本发明成功构建了一个牛病毒噬菌体展示文库，所提供的抗原蛋白是从噬菌体展示文库中筛选出来，是在病毒全基因组水平上进行的一种高通量、无偏见、低成本的筛选，其结果具有很高的准确性，同时也为其它牛病毒抗原蛋白的筛选作出了示范。

本发明筛选的抗原蛋白具有很高的反应原性，在LSDV诊断试剂研发中有很高的应用前景。

附图说明

图1：PCR扩增牛病毒文库的基因片段。

图2：PCR鉴定牛病毒文库中的阳性克隆。

图3：展示LSDV的噬菌体文库质量的分析结果。

图4：LSDV103基因的PCR扩增条带。

图5：LSDV103蛋白表达质粒PCR鉴定的电泳结果。

图6：SDS-PAGE以及Western-blot验证表达的LSDV103蛋白。

图7：牛的阴性血清和感染LSDV的阳性血清验证LSDV103蛋白反应原性。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：构建展示牛病毒的噬菌体文库

1.统计LSDV的序列信息并进行切割和设计

首先在NCBI Virus中搜索LSDV的全部核苷酸序列，截至到2021年的12月13日，共搜索到LSDV的全基因组序列有29条，包含4522条蛋白序列。将4522条蛋白序列按照如下规格进行切割：1.所有蛋白序列从N端开始，切割成56氨基酸的肽段，且前后相邻两个肽段有28个氨基酸重叠，剩余不足56个氨基酸的部分舍弃；2.所有蛋白序列从C端额外切割一条长56氨基酸的肽；3.蛋白全长不足56个氨基酸的，添加终止子后添加“GGSG”氨基酸循环，将全长补足至56个氨基酸。切割后的文库以95％为阈值，使用cd-hit软件对设计好的文库去冗余，得到的序列根据大肠杆菌的密码子反向翻译成核苷酸序列。最终4522条蛋白序列共切割成1792条肽段。然后在这1792条肽段的5’端和3’端分别加上16bp的同源臂序列，5’端包含EcoR I的酶切位点，3’端含有HindⅢ的酶切位点，使其每个肽段的总长均为200bp。这样可以避免肽段在PCR扩增时由于基因的长度不同而造成的偏差以及噬菌体文库的选择偏好性。将设计好的病毒序列信息发送至金唯智生物科技有限公司进行合成。由于文库扩增的基因片段过多，我们以一个序列为例，列出其序列信息如下。

GAATTCCGGCGGTGGCATGTCAGATAAAAAACTGAGCCGTAGCAGCTACGATGATT

ATATCGAGACCATCAATAAATTAACCCCGCAGCTTCGCACTATTCTGGCGCATATCT

CTGGTGAACAGGCCTCTCAGAAAAGTAATTTAACTCCGGAAGATAATACTACTAACAATACTGACGAAAATGGCAGCGCGTAAGCTT(SEQ ID NO.3)

2.PCR扩增所有病毒的DNA序列

以SEQ ID NO.3为例，以合成好的基因序列为模板，设计引物对病毒的基因序列进行PCR扩增，引物序列包括保护性碱基、酶切位点以及与模板结合的核苷酸序列，将设计好的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以合成好的基因片段为模板，通过PCR扩增病毒的基因片段，扩增产物的长度为214bp，扩增结果如图1所示，目的条带清晰明显。基因扩增后通过琼脂糖凝胶电泳，采用OMEGA凝胶回收试剂盒回收病毒基因片段的DNA并测量DNA浓度，用QuickCut^TM HindⅢ/QuickCut^TM EcoRⅠ(Takara)将片段的DNA进行双酶切，并经过琼脂糖凝胶电泳切胶回收DNA，分光光度计测量浓度后保存备用。PCR扩增体系、酶切体系以及反应条件如下：

病毒基因片段的PCR扩增体系：

引物序列(下划线的为酶切位点)：

Lib F:tgatcaaGAATTCCGGCGGTGGC(SEQ ID NO.4)

Lib R:caacatcAAGCTTACGCGCTGCC(SEQ ID NO.5)

病毒基因片段的PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，60℃15sec，72℃15sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

病毒基因片段的DNA酶切体系：

反应条件：

酶切产物置于37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用。

3.构建展示牛病毒肽段的噬菌体文库

将实验室已经酶切好的T7噬菌体基因组(T7 10-3b)与酶切好的DNA片段通过赛默飞的T4连接酶(货号EL0012)按照说明书体外连接，得到完整的噬菌体基因组。利用实验室已有的包装提取物(公司：产品货号：70548)按照产品说明书体外包装连接后的噬菌体基因组使其体外组装成完整的噬菌体颗粒，感染宿主细胞BLT5615后获得展示牛病毒肽段的噬菌体文库。在获得噬菌体文库后，以构建好的文库噬菌体单斑为模板，PCR扩增，同时也扩增野生型噬菌体作为对照，验证文库中的阳性率，结果如图2所示，经过PCR扩增发现，在挑选的47个单斑中，有44个单斑条带大小符合预期，剩余3个样品有一个没有条带，另外两个条带大小不一致，总之，文库的阳性率约93％，质量良好。同时，以收集的噬菌体文库为模板，PCR扩增，将PCR产物送往华大基因进行二代测序，以检测文库的覆盖度以及丰度信息。通过二代高通量测序和数据分析，结果如图3所示，在测序深度为274时，文库的覆盖度可达79％，并且文库肽段均一性良好，整体而言，构建的噬菌体文库质量良好，可进行后续实验。噬菌体基因组的连接体系、反应体系以及PCR的扩增体系和反应体系如下：

体外连接反应体系(5μl)：

反应条件：

将上述混合物置于PCR仪16℃过夜孵育。

噬菌体单斑的PCR扩增体系：

引物序列：

T7 F：5’-CGTTATCGGCCTGTTCAT-3’(SEQ ID NO.6)

T7 R：5’-GGCAGTCTCAACGTTCAT-3’(SEQ ID NO.7)

PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

噬菌体文库的PCR扩增体系：

引物序列：

F1：5’-TAGGTCCGATGATCCGAATTCCGGCGGTGGC-3’(SEQ ID NO.8)

R1：5’-TAGGTCCGATCCGCAAGCTTACGCGCTGCC-3’(SEQ ID NO.9)

PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，60℃15sec，72℃15sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

4.计算噬菌体文库的效价

用移液枪吸出100μl噬菌体原液加入含有900μl Pi-Mg buffer(26mM Na₂HPO₄、68mM NaCl，22mM KH₂PO₄、1mM MgSO₄，pH 7.5)的1.5ml EP管中并记为10^-1，在涡旋震荡仪上混匀后，吸出100μl至下一个含有900μl Pi-Mg buffer的1.5ml EP管中并记为10^-2，然后按照10倍比依次往后稀释至10^-9。取出3个10ml EP管并加入300μl培养在对数期的5615菌液，再加入30μl 1mmol/ml的IPTG，将稀释好的10^-7、10^-8和10^-9的噬菌体各取出100μl与5615菌液混匀，加入7ml含有氨苄青霉素的半固体，颠倒混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃恒温培养箱培养4～6小时。最后对平板上的噬菌斑进行计数，10^-7、10^-8和10^-9平板上的噬菌斑个数分别为315、28和3，那么噬菌体的效价为(315+280+300)/3×10^-7×10＝3.0×10¹⁰pfu/ml。

实施例2：牛病毒的噬菌体文库的应用

1.利用感染LSDV的牛血清对噬菌体文库筛选

在做噬菌体免疫沉淀之前，先将噬菌体文库在4℃预冷的离心机中以3000g离心两小时以去除文库中的细胞碎片、琼脂等杂质，然后用移液枪轻柔吸出噬菌体上清并放入4℃备用。在过夜封闭好的1.5ml的EP管(TBST配置3％的BSA在4℃过夜封闭)中加入6.0×10⁹pfu(文库个体约为6.0×10⁴，用于筛选的噬菌体不少于单个噬菌体的10⁵)的T7噬菌体，并加入PBS使其总体积为1ml。每个样品中加入含有2μg IgG的牛血清，每个血清样品均有3个重复；除此之外，还有3个重复为只含有噬菌体而不含血清，作为本实验的阴性对照组。将1.5ml的EP管放在旋转混匀器上并置于4℃孵育18h。用洗涤缓冲液(0.02％ Tween 20的磷酸盐缓冲液)将protein A和protein G包被的磁珠(公司：赛默飞，产品货号：88803)洗涤两遍后用等体积的PBS重悬，每个试管加入40μl的磁珠并放入4℃孵育4h。孵育结束后将试管置于离心机中1000g离心1min，然后放在磁力板架上，移液枪弃去液体并加入600μl的IPwash buffer(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.1％ NP40)重悬磁珠并转移至新的1.5ml EP管中，放在磁力板架上弃去液体后再次加入1ml的IP wash buffer洗去未结合的噬菌体。最后在EP管中加入40μl的灭菌水并在涡旋振荡仪上将磁珠均匀混入液体中，98℃煮10min。将煮过的样品8000g离心2min后放在磁力板架上吸出上清，作为PCR扩增的模板。将扩增后的DNA通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收，并测量回收DNA的浓度，送往华大基因的测序平台进行二代高通量测序。

PCR的扩增体系如下：

引物参考序列：

引物F2：5’-GGACGGAATCGATCCGAATTCCGGCGGTGGC-3’(SEQ ID NO.10)

引物R2：5’-GGACGGAATCCCGCAAGCTTACGCGCTGCC-3’(SEQ ID NO.11)

噬菌体的PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，60℃15sec，72℃15sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

2.通过数据分析模型分析测序结果

分析过程：利用开源软件fastp以及cutadapt去除低测序质量的碱基以及与后续匹配无关的接头序列，利用开源软件kallisto对测序结果进行匹配与计数，最后用开源软件phip-stat筛选出显著富集的多肽。Kallisto参数设置为kallisto quant--single--plaintext--fr-stranded-l 75-s 0.1-t 4，其余所有参数设置均为默认参数。

实施例3：蛋白的表达纯化及其应用

1.蛋白表达质粒的构建

1)PCR扩增目的基因

通过噬菌体免疫沉淀以及测序分析，我们筛选到一个牛结节性皮肤病病毒的LSDV103蛋白，在该蛋白上的多个肽段均被筛选到，因此表达了该蛋白的全长序列。该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，编码该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。设计扩增LSDV103基因的引物，引物包含与模板结合的核苷酸序列以及酶切位点和保护性碱基，以LSDV的基因组为模板，通过PCR扩增LSDV103基因片段，扩增结果如图4所示，目的条带清晰且明显，条带大小符合预期。基因扩增后通过琼脂糖凝胶电泳，采用OMEGA凝胶回收试剂盒回收该片段的DNA并测量DNA浓度，用QuickCut^TM BamHⅠ/QuickCut^TM XhoⅠ(Takara)将基因片段的DNA双酶切，并经过琼脂糖凝胶电泳切胶回收DNA，分光光度计测量浓度后保存于-20℃备用，PCR的扩增体系以及反应条件如下：

LSDV103基因片段的PCR扩增体系：

引物序列(下划线的为酶切位点)：

LSDV103 F：5’-CGCggatccatgtctgataaaaaattatctcgaagc-3’(SEQ ID NO.12)

LSDV103 R：5’-GGCctcgagttaatccataccatcgtcgataga-3’(SEQ ID NO.13)

LSDV103基因片段的PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

2)构建LSDV103基因的复制型质粒

将实验室已酶切好的pET28a质粒载体与目的片段的DNA连接。将连接后的连接产物加入DH5α感受态中，放置于冰上冰浴30分钟，42℃热激45秒，热激后将感受态置于冰上冰浴2分钟，在感受态中加入500μl的LB液体培养基，放入37℃摇床180rpm孵育45分钟，孵育后5000rpm离心3分钟，弃去500μl上清，剩余100μl的上清重悬沉淀，重悬后将菌液涂至含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜。次日挑取单菌落至10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，培养12小时后提取质粒并使用pET-28a载体的T7/T7er通用引物进行PCR鉴定，鉴定结果如图5所示，六个质粒通过PCR扩增，均有目的条带，并且大小符合预期，证明表达质粒连接成功。连接体系及反应条件如下：

复制型质粒的连接体系：

反应条件：

将上述混合物置于PCR仪16℃过夜孵育。

2.蛋白的表达及纯化

将测序正确的质粒用移液枪吸取10ng加入到表达感受态BL21(DE3)中，置于冰上冰浴30分钟，42℃热激45秒，热激后将感受态置于冰上，再次冰浴2分钟，在感受态中加入500μl的LB液体培养基，放入37℃摇床180rpm孵育45分钟，孵育后5000rpm离心3分钟，弃去500μl上清，剩余100μl上清重悬沉淀后将菌液涂至含有50μg/ml卡那霉素的固体LB平板上，37℃恒温培养箱培养12小时，挑取单菌落至含有10mL培养基的细菌瓶中，并添加卡那霉素并使其终浓度为50μg/ml，约震荡培养8小时，按照1：100转接至1L的LB液体培养基中，并放入37℃摇床200rpm摇菌至OD₆₀₀值约为0.6，将摇床转速调至180rpm，并加入0.5ml的IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，诱导表达6小时。6小时后将培养的细菌倒入离心瓶中，6000rpm离心10min倒掉上清并收集沉淀，用PBS将细胞沉淀洗涤两遍。200ml的结合缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl，浓盐酸调至pH为8.0，10mM咪唑)重悬细菌沉淀，高压破碎仪将蛋白低温破碎约半个小时，待液体澄清后收集破碎后的蛋白，10000g离心10min收集蛋白上清，并用0.22μm的滤器过滤上清，将过滤好的蛋白上清通过蠕动泵用His标签的蛋白纯化预装柱纯化蛋白。待蛋白液流尽之后更换洗涤缓冲液(300mM NaCl，100mM Tris-HCl，浓盐酸调至pH为8.0，100mM咪唑)洗涤杂蛋白，约洗涤10分钟后将缓冲液更换为洗脱缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl，浓盐酸调至pH为8.0，250mM咪唑)洗脱与His柱结合的目的蛋白。将洗脱后的目的蛋白用10kDa的超滤管对蛋白进行超滤浓缩，先用超纯水将超滤管洗涤两遍，将蛋白加至超滤管中，4℃4000rpm离心，离心时间根据蛋白的量而定。每次离心后，加入一定体积的GE buffer(20mM Tris，100mM NaCl，用浓盐酸调至pH为8.0)，置换出蛋白中高浓度的盐和咪唑。超滤后从超滤管中吸出蛋白至1.5mL离心管中混匀，将蛋白分装至PCR小管中，每管50μL，分装后放至-80℃冰箱保存备用。

3.SDS PAGE和Western blot验证纯化的蛋白

将纯化后的蛋白取出10μL加入含有70μL PBS的1.5ml EP管中，再加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，涡旋振荡混匀后100℃煮10min。取出两块已制备好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，一块用于SDS PAGE验证所纯化的蛋白，另一块用于Western blot验证。先80V电压下跑完浓缩胶后切换电压至120V跑完分离胶。蛋白胶跑完之后一块直接放入含有2.5g/L的考马斯亮蓝染液中染色2h，之后转至脱色液(10％冰醋酸，5％乙醇)中进行脱色。而另一块蛋白胶则用于Western blot验证。

切下蛋白凝胶的胶块，在65V的电压下转35分钟将蛋白转至PVDF膜上。TBST洗膜3遍，每次间隔5min，5％脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗膜3遍，每次间隔5min，感染LSDV的牛阳性血清作为一抗，室温孵育2小时(血清用TBST以1：200倍稀释)，TBST洗膜5遍，每次间隔5min，酶标兔抗牛IgG作为二抗室温孵育1小时(TBST以1：5000倍稀释)，TBST洗膜5遍，每次间隔5min，ECL发光显色液A:B等体积混合后避光使用化学发光仪显色(公司：Biosharp货号：BL520A)，所纯化的蛋白结果如图6所示，通过SDS-PAGE发现所纯化的LSDV103蛋白约34kDa，与预测结果一致，并且通过Western blot验证，所纯化的蛋白与感染LSDV的牛阳性血清有较好的反应原性。

4.间接ELISA验证LSDV103蛋白的反应原性

将优化后的ELISA条件用于验证LSDV103蛋白与阳性血清的反应原性。LSDV103蛋白按照1μg/mL的浓度包被酶标板(蛋白用0.05M碳酸盐缓冲液稀释，pH 9.6)，每孔100μL，37℃包被1小时。用0.1％的PBST洗涤液洗2次，每孔300μL，每次3min。配置1％鱼明胶封闭液，每孔200μL，37℃孵育2小时。弃去封闭液，0.1％PBST洗涤3遍，每孔300μL，每次3分钟。使用PCR管稀释血清，第一孔加入250μL用PBS稀释好的血清(1：100)，其余孔加上125μL的PBS，按照2倍比依次往后稀释，然后将稀释完成的血清以每孔100μL加入至包被LSDV103蛋白的酶标板中，置于37℃恒温培养箱中孵育1小时。弃去血清，PBST洗涤3遍，每孔300μL，每次3分钟。每孔加100μL酶标兔抗牛IgG(1：5000稀释)，37℃孵育1小时。弃去二抗，PBST洗涤3遍，每孔加入100μL TMB显色液(公司：Solarbio，货号：RP1200)，将酶标板置于暗处避光，37℃显色10分钟，每孔加50μL终止液终止反应(公司：Solarbio，货号：C1058)。最后通过酶标仪测定OD₄₅₀处的吸光度。结果如图7所示，在感染LSDV的阳性血清稀释200倍时，LSDV103蛋白与阳性血清有很高的反应原性，说明LSDV103蛋白可作为检测牛结节性皮肤病的潜在诊断靶标，具有临床应用价值。

5.间接ELISA验证LSDV103蛋白的特异性和敏感性

为了测试基于LSDV103蛋白建立的ELISA方法是否具有良好的分析特异性，选取了存在交叉可能性的牛病毒性腹泻病毒，按照上述ELISA操作流程分别做三个样品的重复，读取OD450数值。为了测试基于LSDV103蛋白建立的ELISA方法的分析敏感性，感染血清和免疫血清分别按照1:100倍比稀释至1:12800，读取OD450数值。结果表明：使用LSDV103蛋白作为包被抗原，与感染了牛病毒性腹泻病毒的血清抗体无交叉反应，表明LSDV103蛋白具有良好的特异性。基于LSDV103蛋白建立的ELISA方法，根据ELISA试剂盒判定标准，最低阳性血清检出限为1:1600。

Claims (10)

1.一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种筛选权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建裂解性噬菌体展示文库，所述噬菌体展示文库中包含了已知的LSDV基因组序列和蛋白质序列的切割肽段，且所述切割肽段展示于噬菌体的衣壳表面，其中一条切割肽段的序列SEQ ID NO.3所示；

2)将感染LSDV的牛血清与噬菌体展示文库共孵育，用protein A和protein G包被的磁珠回收与抗体结合的噬菌体，利用噬菌体免疫共沉淀技术对噬菌体文库进行筛选；

3)以富集在磁珠上的噬菌体基因组为模板，设计引物，通过PCR扩增，对PCR产物进行高通量测序，利用开源软件对测序结果进行生物信息学分析，最终筛选出目标抗原并进行验证。

4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述文库中一共有29株LSDV基因组序列和4522条蛋白序列，切割后一共有1792条肽段。

5.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：在进行肽段切割时，首先将蛋白序列从N端开始切割成56氨基酸的肽段，然后在肽段的两端加上EcoR I和HindⅢ的酶切位点以及同源臂序列，使每条肽段的长度均为200bp。

6.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以LSDV的基因组DNA为模板，设计PCR引物扩增序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因；

2)将扩增产物克隆至pET28a载体，获得连接有目的基因的重组质粒；

3)将重组质粒转化至感受态细胞进行诱导表达，获得包含权利要求1所述蛋白质的宿主菌；

4)从宿主菌中分离纯化所述蛋白质。

7.权利要求1所述的蛋白质在制备牛结节性皮肤病检测试剂盒中的应用。

8.一种试剂盒，该试剂盒中含有权利要求1所述的蛋白质。

9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的基因或权利要求8所述的试剂盒在非诊断目的检测LSDV中的应用。

10.一种非诊断目的检测LSDV的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)用权利要求1所述的蛋白质包被酶标板；

2)用封闭液封闭酶标板；

3)将待测血清样品稀释后加入酶标板中进行一抗孵育；

4)将酶标二抗稀释后加入酶标板中进行酶标二抗孵育；

5)加入显色液和终止液，采用酶标仪测量OD450数值并进行结果判定。