CN106220716B - 鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家禽传染病防疫领域，尤其涉及一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法。提供一种副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，包括氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示的16个抗原表位或表位域；优选地，其氨基酸序列选自Seq ID No.17，18，19，20和21之一。还提供一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其免疫活性组分包括所述副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。该疫苗能够明显增强鸡对A，B，C三种血清型副鸡禽杆菌的抵抗力，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可以用来预防不同血清型副鸡禽杆菌引起的鸡传染性鼻炎。

Description

鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及家禽传染病防疫领域，尤其涉及一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

鸡传染性鼻炎(Avian infectious coryza)是由副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)感染引起的最重要的呼吸疾病之一。患有鸡传染性鼻炎的鸡主要呈现流鼻涕、眼睑肿和溢泪等临床症状。鸡传染性鼻炎可以导致鸡产蛋的延迟、产蛋量的下降，从而引起大量的经济损失。

Apg为巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌，基本特征为无运动性、菌体呈多形性、强毒株带有荚膜。Page等人将Apg分为A、B和C三种血清型，研究表明A、B、C三个血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的灭活菌体不存在型间交叉免疫。为了预防鸡传染性鼻炎，目前已经广泛使用了灭活疫苗，这些疫苗是通过以福尔马林、硫柳汞等灭活副鸡禽杆菌的细胞而获得的。目前国际上普遍使用的灭活疫苗绝大多数都包含了A型和C型Apg，随着国内外陆续发现有大量B型Apg的流行和发生，国际上影响较大的疫苗公司已经开始提供包含A、B、C三种血清型的三价灭活疫苗。由于副鸡禽杆菌属于苛生菌，培养成本较高导致常规灭活菌苗成本居高不下；另外，副鸡禽杆菌含有LPS等毒素物质，大量接种所带来毒副作用也会影响鸡的产蛋与生长，在接种的鸡中还会形成局灶性坏死斑。鸡传染性鼻炎灭活疫苗对野外鸡群感染的预防效果大约为70-80％，在其效力检验中由于环境和评价方法的差异可能会有不同的结果。

为了开发更为安全有效的疫苗，有学者研究了通过遗传重组技术制备重组疫苗的可行性。例如，Ryuichi Sakamoto等人克隆表达了A型和C型副鸡禽杆菌的外膜蛋白，获得的重组蛋白可用作分别抵抗A型和C型鸡传染性鼻炎感染的保护性抗原。然而，在设计用于制备疫苗的重组抗原时，由于筛选A，B，C三种血清型Apg共有的、具有中和活性的抗原表位十分困难，目前还未见到能够同时抵抗A，B，C三种血清型的副鸡禽杆菌感染的保护性抗原的相关报道。

发明内容

经过发明人的深入研究，本发明提供一种新型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，免疫原性强，以该抗原蛋白作为活性成分制备的亚单位疫苗能够同时有效预防A型、B型和C型副鸡禽杆菌的感染。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，包括氨基酸序列如Seq IDNo.1～16所示的16个抗原表位或表位域。

优选地，所述副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的氨基酸序列选自Seq ID No.17，18，19，20和21之一。

编码权利要求1所述的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因。

优选地，所述基因的核苷酸序列选自Seq ID No.22，23，24，25和26之一。

一种构建体，其特征在于，包含权利要求3或4所述的基因。

一种重组细胞，其特征在于，是由权利要求5所述的构建体转化受体细胞而得；任选地，所述受体细胞选自细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。

一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其特征在于，其免疫活性组分包括权利要求1或2所述的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。

优选地，所述副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的终浓度为5-100μg/ml。

一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建权利要求1或2所述的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的表达载体；

(2)用所述表达载体转化与之匹配的蛋白表达系统，得到重组细胞；

(3)培养所述重组细胞，诱导表达获得副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白并纯化蛋白；

(4)将纯化后的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白与辅助试剂混合，调节所述抗原蛋白的终浓度为5-100μg/ml，得到鸡传染性鼻炎亚单位疫苗。

优选地，所述表达载体选自pET、pQE和pGEX系列的载体；所述蛋白表达系统选自大肠杆菌BL21、DH5ɑ、Top10和JM109菌株；所述辅助试剂包括免疫增强剂、稳定剂、防腐剂、盐溶液和/或蒸馏水。

本发明利用生物信息学软件geneious(Biomatters.Ltd，网址http://www.geneious.com/)，通过对副鸡禽杆菌外膜蛋白HMTp210的基因(GenBank:KJ867498.1，全长6255bp)及其编码的蛋白序列(2083个氨基酸残基)进行抗原表位分析。根据预测结果和实验经验，选取免疫原性强的若干肽段，经过多次序列优化后，确定了16个核心的抗原表位/表位域，其氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示。

一些实施例中，由上述16个抗原表位/表位域组合而得到若干种重组抗原蛋白。

一些实施例中，获得了包含上述16个抗原表位多肽，还包括选取的其它氨基酸序列如连接肽或其它抗原表位或表位域，通过序列拼接而获得了若干种重组抗原蛋白。

实施例列出了5种重组抗原蛋白(氨基酸序列如Seq ID No.17，18，19，20和21所示，分别命名为p1，p2，p3，p4，p5)的实验结果。其余重组抗原蛋白的数据与此类似。

对所得的重组抗原蛋白的抗原特性进行实验分析，Western Blotting实验证明本发明所得的重组抗原蛋白具有较强的免疫原性；使用该抗原蛋白免疫试验鸡后能保护试验鸡只不受副鸡禽杆菌感染。

免疫实验数据表明，本发明所得的重组抗原蛋白能够对针对多株不同血清型的副鸡禽杆菌产生免疫保护作用，如Hp8、221、0083、BJ、222、668、Modesto等A型、B型和C型Apg菌株，且保护效果优于全菌灭活疫苗。在本发明的一个实施例中，攻毒实验表明，采用本发明所得的重组抗原蛋白(以p1，p4，p5为例)制备的疫苗免疫的鸡群在A、B或C型副鸡禽杆菌攻毒后，所有鸡只没有出现鼻炎症状，保护率为100％；采用p2，p3制备的疫苗免疫的鸡群在A型Hp8株攻毒后，所有鸡只没有出现鼻炎症状，保护率为100％，在用B型BJ株和C型Modesto株攻毒后，只有10％的鸡只出现鼻炎症状，保护率为90％；采用全菌灭活疫苗免疫的鸡群在攻毒后7天内有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70-80％；而未进行免疫的对照组鸡群在攻毒后全部出现鼻炎症状，保护率为0。免疫组与非免疫组的保护率有极显著差异。

因此，本发明的重组抗原蛋白具有很好的免疫保护活性，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可以作为副鸡禽杆菌亚单位疫苗的候选抗原。

所述构建体，可以是克隆载体或表达载体。所述表达载体可以是具有trp启动子、T7启动子、cspA启动子等多种市售的表达载体。这类表达载体包括pET系列的载体，如pET-28a；pQE系列的载体，如pQE30；pGEX系列的载体，如pGEX-6-1。

所述重组细胞，可以是用于克隆和保存质粒的细胞，也可以是用于蛋白表达的细胞。表达系统可以采用原核表达系统或真核表达系统，原核表达系统可以选择大肠杆菌BL21、DH5ɑ、Top10、JM109等菌株，优选大肠埃希氏菌BL21(DE3)；真核表达系统可以是酵母、动物细胞或植物细胞。相应地，选用与之匹配的表达载体、转化条件、表达条件及蛋白提取方法进行抗原蛋白的制备。

利用本发明的重组抗原蛋白制备的亚单位疫苗，能够明显增强鸡对A，B，C三种血清型副鸡禽杆菌的抵抗力，有效预防副鸡禽杆菌的感染。在一些实施例中，所述亚单位疫苗包括本发明的1种，2种，3种，4种，5种或多种氨基酸序列的副鸡禽杆菌重组抗原蛋白。本发明的亚单位疫苗可以单独使用，也可以联合一种或多种其他传染病病原体抗原，制作一针防多病的联合疫苗。其他抗原包括引起鸡只感染的各种传染性病原体，例如鸡传染性法氏囊病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病毒；或者由鸡沙门氏菌、支原体、鸡球虫等微生物或寄生虫病。

所述亚单位疫苗中，副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的终浓度优选为5-100μg/ml，更优选为10-50μg/ml，最优选为20μg/ml。

本发明还提供一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备方法，在一些实施例中，包括如下步骤：

构建表达载体：全基因合成编码重组抗原蛋白的DNA，所述DNA编码SEQ ID No.17～21所示的融合肽或其中删除、添加或替换了一个或数个氨基酸的融合肽突变体；设计PCR的引物大量扩增该DNA，为方便和表达载体连接，在上、下游引物的5’末端加上合适的酶切位点。将获得的编码重组抗原蛋白的DNA片段连接到合适的表达载体中，所述表达载体可以是具有trp启动子、T7启动子、cspA启动子等多种市售的表达载体。这类表达载体包括pET系列的载体，如pET-28a；pQE系列的载体，如pQE30；pGEX系列的载体，如pGEX-6-1。

导入宿主细胞：将携带有重组抗原蛋白编码基因的表达载体导入宿主中以表达重组抗原蛋白。表达用的宿主可以是细菌、昆虫细胞、动物细胞、酵母、植物细胞等，例如，可以选择大肠杆菌BL21、DH5ɑ、Top10、JM109菌株进行蛋白的大量表达，操作简便易行，且生产成本较低。根据所用的宿主细胞选择合适的转化方法，可以使用本领域常规方法，例如电转化，热激、脂质体转染等，将表达载体导入宿主细胞。

诱导蛋白表达：培养携带重组抗原蛋白表达载体的宿主细胞，加入诱导剂诱导蛋白的表达，通过离心收集诱导表达的宿主细胞，将其悬浮于固定体积的蒸馏水或PBS中，通过超声裂解将其破碎，并进行离心以收沉淀物和上清液。将回收的固定量的上清液和沉淀物进行SDS-PAGE凝胶电泳，以考马斯亮蓝染色后，通过目标条带相对于蛋白Marker的位置大小来确认目标蛋白是否表达。也还可以使用ELISA、Western-blotting等体外抗原-抗体反应的试验来验证。

纯化蛋白：对诱导表达后的重组大肠杆菌进行离心，收集细菌沉淀。通过化学物质、表面活性剂、溶菌酶或超声裂解等方法将收集的大肠杆菌进行破碎，从而将重组蛋白释放到细胞外。利用镍琼脂糖亲和层析原理处理经超声波裂解后的菌体上清液，如果目标蛋白是包涵体形式存在，则通过离心浓缩将含有包涵体的溶液以沉淀物的形式回收，经变性复性后再亲和层析纯化。包涵体蛋白纯化时，将回收的包涵体溶解于含有变性剂的溶液中。涉及到的变性剂可以是4M-8M的脲、或盐酸胍。溶解变性剂或还原剂的缓冲液可以是pH7-8的磷酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液等。通过透析使重组蛋白复性，恢复正常的空间结构。透析溶液可以使用与用于溶解包涵体相同种类、温度和pH的缓冲液。用SDS-PAGE法测定蛋白的纯度，并用分光光度计或专用试剂盒测定所获得的蛋白的含量或浓度。

获得疫苗：将纯化后的抗原蛋白与辅助试剂混合，调节所述抗原蛋白的终浓度为20μg/ml。所述辅助试剂包括免疫增强剂，例如氢氧化铝、矿物油或非矿物油；稳定剂，例如聚山梨酯80、乳糖以及蔗糖等；以及防腐剂，如福尔马林、硫柳汞、苯甲醇等。在一些实施例中，将重组抗原蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂进行等体积混合乳化，制备副鸡禽杆菌亚单位疫苗。本发明亚单位疫苗的免疫途径没有特别限制，可以通过皮下、皮内或肌肉注射等方式。

免疫效果验证：使用所述亚单位疫苗免疫鸡，采集免疫鸡的血清，测定血清中副鸡禽杆菌的抗体效价；或者用Apg强毒菌株攻击免疫鸡并观察鸡的存活和临床症状。

附图说明

图1.本发明典型实施例中使用的pET28a质粒图谱。

图2.本发明重组蛋白SDS-PAGE分析图，

其中，M为蛋白分子量标准；1.pET28a-p1诱导后全菌；2.pET28a-p2诱导后全菌；3.pET28a-p3诱导后全菌；4.pET28a-p4诱导后全菌；5.pET28a-p5诱导后全菌。

图3.本发明重组蛋白SDS-PAGE分析图，

其中，M为蛋白分子量标准；1.pET28a-p1诱导裂解后沉淀；2.pET28a-p2诱导裂解后沉淀；3.pET28a-p3诱导裂解后沉淀；4.pET28a-p4诱导裂解后沉淀；5.pET28a-p5诱导裂解后沉淀。

图4.本发明重组蛋白SDS-PAGE分析图，

其中，M为蛋白分子量标准；1.pET28a-p1诱导裂解后上清；2.pET28a-p2诱导裂解后上清；3.pET28a-p3诱导裂解后上清；4.pET28a-p4诱导裂解后上清；5.pET28a-p5诱导裂解后上清。

图5.纯化的重组蛋白SDS-PAGE分析图，

其中，M为蛋白分子量标准；1.p1蛋白；2.P2蛋白；3.P3蛋白；4.P4蛋白；5.P5蛋白。

图6.本发明重组抗原蛋白Western-blotting检测结果，

其中，M为蛋白分子量标准；1.p1蛋白；2.P2蛋白；3.P4蛋白；4.P5蛋白；5.P3蛋白。

图7.副鸡禽杆菌221株外膜蛋白的抗原分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

本发明实施例中未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可以商购获得，或通过本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、副鸡禽杆菌外膜蛋白的抗原表位预测

外膜蛋白：其氨基酸序列如Seq ID No.27所示，该序列源自GenBankNo.KJ867498.1副鸡禽杆菌221株外膜蛋白的编码基因。

抗原表位预测：使用抗原表位预测软件geneious(Biomatters.Ltd，网址http://www.geneious.com/)预测外膜蛋白的抗原表位，分析外膜蛋白的二级结构、亲疏水性、抗原性等信息(图7)。

序列分析与拼接：综合软件分析，根据蛋白序列抗原性，考虑蛋白表达、纯化的难易性，避开信号肽区域，从中选取合适抗原表位序列或抗原表位集中区域用于序列拼接；根据预测结果和积累的实验经验对选取的抗原表位序列进行多次优化，截取部分抗原表位区域，使拼接所得的抗原蛋白免疫原性强且适合进行蛋白表达和动物免疫。最终确定了16个核心的抗原表位/表位域，其氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示。

由上述16个抗原表位/表位域组合而得到若干种重组抗原蛋白。

还与选取的其它蛋白序列如连接肽或其它抗原表位或表位域，通过序列拼接而获得了若干种重组抗原蛋白。

其中5种副鸡禽杆菌重组抗原蛋白，分别命名为p1，p2，p3，p4，p5，其氨基酸序列如Seq ID No.17，18，19，20和21所示。

实施例2、副鸡禽杆菌重组抗原蛋白的原核表达

1.材料

1.1质粒与菌株

本实例采用的pET28a质粒(Pharmacia公司产品，购自北京百灵克生物技术有限责任公司)；该pET28a质粒图谱如图1所示。

大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态购自北京天根生物技术有限公司。

本发明所用副鸡禽杆菌菌株为Hp8、221、0083、BJ、222、Modesto、668菌株，购自中国北京中国兽医药品监察所，属于商业菌株。

1.2副鸡禽杆菌抗原蛋白

实施例1中由生物信息学软件预测、分析和拼接获得的5种副鸡禽杆菌重组抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5。

1.3主要试剂及耗材

氯化钠、EDTA二钠盐、乙醇、甲醇、丽春红S、三氯乙酸(TCA)是中国国药公司产品。

Tris碱(Tris-HCL)、二硫苏糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸钠、乙酸钠购自上海生工生物工程技术有限公司。

甘氨酸、考马斯亮蓝R-250购自AMRESCO公司。

牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制剂(PMSF)、甲醛均为Sigma公司产品。

蛋白酶K(贮存液浓度为20mg/ml，使用液浓度为1mg/mI)购自上海华舜生物工程有限公司。

卡那霉素(kanamycin)、胎牛血清、诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)均为Invitrogen公司产品。

吸头与离心管是AxyGen公司产品。

Taq酶及10xTaq酶缓冲液、NcoI、Xho I等核酸内切酶及相关缓冲液、T4连接酶及10x T4连接酶缓冲液、Rnase、DNA marker(DL-2000、DL-15000)均为宝生物(大连)有限公司产品。

柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡IgG购自Sigma公司。

底物液配制：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄.12H₂O 14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。

大肠杆菌培养基：LB液体培养液及固体培养基：每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

副鸡禽杆菌培养基TSB、TSA，及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。

纯化副鸡禽杆菌抗原蛋白采用Sepharose 4B纯化柱(Amershan pharmacia公司产品)购自北京百灵克生物技术有限公司。

PBS缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

Western-blotting缓冲液：

电转缓冲液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇。配制1000mL转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37g SDS，加200mL甲醇，加ddH₂O至总量为1000mL。

TBS(pH8.0)缓冲液：10mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl。

TBST缓冲液：在上述TBS中加入终浓度为0.05％Tween-20即可。

丽春红S(10×)贮存液：2g丽春红S，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加dd H₂O至100mL。

1.4试验动物：6周龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通SPF鸡实验动物中心。

2.序列设计与合成

抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5(p1-5)的基因编码序列如Seq ID No.22，23，24，25，26所示，将基因编码序列送华大科技(北京)有限公司进行全基因合成。

按照各自的碱基序列分别设计上、下游引物，并在上、下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点，送华大科技(北京)有限公司进行引物合成，引物序列如Seq ID No.28～37所示。

3.重组表达质粒的构建

3.1抗原蛋白p1-5编码基因的PCR扩增

以步骤2得到的合成产物为模板，利用合成的引物进行PCR，

PCR反应体系：

PCR各个成分的用量：(其中引物浓度为1OD溶于400μl ddH₂O)

PCR反应程序：在98℃反应1分钟后，进行30个循环的“变性(95℃，10秒)、退火(56℃，15秒)和延伸反应(72℃，120秒)”，然后修复延伸反应(72℃，7分钟)。

3.2PCR产物的酶切及回收

将上述PCR产物进行NcoI和XhoI酶切，

酶切体系：

PCR产物片段酶切体系(50ul)：

以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h。

将全部的酶切产物通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离之后，采用北京天根生化技术有限公司的普通DNA胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行DNA片段回收。回收的目的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

3.3表达载体的酶切及回收

对表达载体PET28a进行Nco I和XhoI酶切和酶切产物的回收，方法及步骤同3.2PCR产物的酶切及回收。

3.4目的片段与载体连接

将步骤3.2回收纯化的目的DNA片段和3.3回收纯化的表达载体PET28a进行连接，得到重组质粒。

连接体系为：目的DNA片段，8ul；表达载体pET28a，4ul；10×T4DNA连接酶缓冲液，2ul；T4DNA连接酶，1ul(5u/ul)；ddH₂O补充至20ul。

连接条件：上述连接体系的混合液放在22℃PCR仪1h即可。

3.5转化并筛选克隆

取大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞100μl加入到1.5ml EP管中，将步骤3.4获得的重组质粒pET28a-p1，pET28a-p2，pET28a-p3，pET28a-p4，pET28a-p5各5-10μl分别加入各自的EP管中并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3-5分钟。加入400μl LB，于37℃，200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4℃，25000rpm离心10min，弃去400μl上清，用剩余的100μl重悬沉淀并涂布于含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。37℃增殖1h，再将平板翻过来，37℃倒置培养14h-16h至菌落出现。

3.6重组质粒的酶切鉴定

挑取步骤3.5中平板上长出的单菌落，分别接种于含25μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.6～1。

收集菌体，使用普通质粒提取试剂盒(天根生化技术有限公司)提取重组质粒，具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。利用NcoI+XhoI酶切鉴定重组质粒，酶切后出现预期大小的外源片段和载体片断的，即为正确的重组质粒。

4.重组表达菌株的构建

取感受态细胞BL21(DE₃)100μl加入到1.5ml EP管中，将鉴定正确的重组质粒pET28a-p1，pET28a-p2，pET28a-p3，pET28a-p4，pET28a-p5各0.5μl加入各自的EP管中并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3-5分钟。将其涂布于含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。37℃置1h，再将平板翻过来，37℃倒置培养14h-16h至菌落出现。挑取单菌落，按照步骤3.1中的反应体系和反应程序进行菌落PCR并测序比对，鉴定阳性克隆。

5.目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化

5.1目的基因的诱导表达：将含重组质粒pET28a-p1，pET28a-p2，pET28a-p3，pET28a-p4，pET28a-p5的阳性克隆分别接种于含有25μg/ml卡那霉素的3mL LB液体培养基，于37℃振荡培养。从培养好的菌液中取100μl接种于10mL含有25μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0.8mmol/L，继续培养3h后收集菌体。

5.2表达产物的SDS-PAGE电泳分析

(1)制胶：SDS-PAGE凝胶配制方法如表1所示：

表1SDS-PAGE凝胶配制方法

12％的分离胶配制：将各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加纯化水。然后，再配制5％浓缩胶：将表中相关各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面(先将分离胶上面的纯化水倒干净)，灌满后插入加样梳。待浓缩胶凝固后，取下梳子。

(2)PAGE：将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品：电泳电压200V，电流在20mA-40mA范围内，电泳1h，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。

(3)聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色：卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液染色30min，再用脱色液进行脱色1min，观察结果。

结果如图2所示，将含有阳性重组质粒的大肠埃希菌以1mM IPTG诱导37℃诱导表达后，经SDS-PAGE检测，在预期位置出现蛋白目标条带，预期蛋白大小相一致，未诱导菌没有此蛋白。

5.3重组蛋白的制备及纯化

1)挑取步骤4鉴定正确的阳性克隆，接种于3mL含25μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃活化过夜后，1:100稀释到含25μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃、230r/min振摇培养至对数生长期(OD₆₀₀ 0.6～1)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃、230r/min振摇诱导培养6-8h。分别于诱导前和诱导后不同时间取出1mL,5,000r/min离心10min收集菌体，弃上清后加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，用12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检查，并用Quantity One-4.3.1(BIO-RAD)软件分析表达产量。

2)收集500mL经诱导表达6h后的菌液，8000r/min离心10min，沉淀用5mL的10mmol/L PBS溶解，超声波破碎后，12,000r/min离心10min后，保留上清。包涵体沉淀用8mol/L的尿素溶液溶解，8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右，1mM EDTA，10％Triton X-100，二硫键还原剂中洗涤。洗涤4～8h，使包涵体变性可溶。包涵体溶解后的上清液，用镍亲和层析柱纯化。操作过程参照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南进行。具体过程如下：转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗涤镍亲和层析柱，以除尽基质中的乙醇和空气，并防止下一步Ni²⁺沉淀；5×柱体积的Charge Buffer(50mM NiSO₄)充电；20×柱体积的三蒸水洗涤，去尽游离的Ni²⁺；10×柱体积的Binding Buffer平衡柱子；手工上样，根据蛋白的浓度来确定上样体积；20×柱体积的Binding Buffer洗涤；6×柱体积的Wash Buffer洗涤，至检出无蛋白；Elution Buffer洗脱，每次1ml，收集洗脱流出液，洗脱至检出无蛋白；然后进行SDS-PAGE电泳检测。

结果参见图3和图4，两图为本发明构建的重组质粒诱导表达后超声裂解后的SDS-PAGE，图3是裂解后沉淀，可知p1，p2，p4和p5大部分在沉淀中；图4是裂解后上清，可知p3蛋白大部分存在于裂解后的上清中。

诱导后裂解上清中的蛋白含量若高于沉淀，纯化时可以直接使用裂解上清，省去包涵体变性复性的步骤,利用镍琼脂糖亲和层析原理处理经超声波裂解后的菌体上清液，具体操作如下：

①取5mLNi-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。

②样品(裂解液上清)上柱，流速为2ml/min，收集穿透液。

③10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子,流速10mL/min。

④Wash Buffer洗杂,流速5ml/min，收集洗脱液。

⑤Elution Buffer洗脱,流速2ml/min，收集洗脱液。

⑥将纯化后的蛋白置于透析袋中，在PBS，缓冲液(pH＝7.4)中缓慢透析，收集透析后的样品进行SDS-PAGE分析。

注：Binding Buffer(PBS，0.5％Triton X-100，pH＝7.4)

Wash buffer-10(PBS，10mM咪唑，pH＝7.4)

Elution Buffer-500(PBS，500mM咪唑，pH＝7.4)

结果参见图5，经纯化，获得了较纯的目的蛋白p1，p2，p3，p4和p5。

实施例3、重组抗原蛋白的特性分析

1.用Western-blot方法分析重组抗原蛋白的抗原性

将上述纯化的重组抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5按照常规方法进行SDS-PAGE电泳，其步骤是：

1)转移：切出6张Whatman 3M滤纸和1张硝酸纤维膜(NC膜)，滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶，用铅笔在滤膜一角作标记，确保转印后膜与凝胶的相对方向；将硝酸纤维膜在纯化水中浸泡5min；在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液，将6张Whatman 3M滤纸浸泡于其中。然后按照如下步骤安装转移电泳槽：平放石墨电极的底座(阳极)，依次放3层3M滤纸、硝酸纤维膜、聚丙烯酰胺凝胶和3层3M滤纸。彻底排除各层间的气泡：将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极一转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65mA/cm²-1.0mA/cm²的参数接通电流，电泳转移0.5h-2h。

2)丽春红染色：转移结束后，取下NC膜，于去离子水中漂洗2-3次后，转移至丽春红染色液中染色5min-10min，观察转印效果，并用铅笔标出蛋白Marker位置；室温下用去离子水漂洗硝酸纤维膜直至颜色褪去；将NC膜置于5％的脱脂奶粉中，室温封闭2h；洗膜：弃封闭液，用1×TBST洗NC膜3遍，每次5min。

3)一抗孵育：将NC膜放入用5％的脱脂奶粉稀释(体积比1:50)的鸡抗Apg型菌阳性血清，37℃孵育1h。洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min。

所述阳性血清由本实验室用Apg Hp8\BJ\668菌株制备的三价灭活疫苗免疫SPF鸡制备而得，可对外提供用于验证实验。

4)二抗孵育：将膜转入5％的脱脂奶粉稀释(体积比1：5000)的HRP标记的羊抗鸡IgG抗体，37℃孵育2h；洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min。

5)显色：将NC膜置于新配制的DAB显色液中，置暗处显色，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用1×TBST、冲洗以终止反应。

2.重组蛋白抗血清的制备

1)疫苗的制备及免疫试验

重组抗原蛋白疫苗的制备：将重组抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5分别与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中抗原蛋白终浓度为20μg/ml。第二次免疫用疫苗采用弗氏不完全佐剂，其余组分及浓度与首次免疫相同。

免疫方法：给所述的42日龄试验SPF鸡胸部肌肉注射弗氏完全佐剂乳化的重组抗原蛋白疫苗(接种量为0.5ml/只)；2周后胸部肌肉注射弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白疫苗(接种量为0.5ml/只)；间隔10天后于翅静脉采血，收集血清。

血清特异性抗体的检测：采用ELISA方法，具体步骤为：

使用纯化的重组抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5各1μg/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA 37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装，于-20℃保存。

将加强免疫一周后的鸡采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设佐剂对照和空白对照。

37℃反应30min。

洗板3次后加入体积比1:5,000稀释的兔抗鸡IgY(H+L)-HRP，37℃反应30min。

洗板5次后加100μl底物液，避光显色10min后加入2％H₂SO₄终止反应，于630nm读数。

样品与对照组OD值之比大于2的血清判为血清ELISA抗体阳性。

重组抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5的Western-blotting检测结果如图6所示，鸡传染性鼻炎阳性鸡血清与各重组抗原蛋白均发生了反应，与预期结果相符。由此表明，本发明的重组抗原蛋白具有良好的抗体结合活性。

实施例4、重组抗原蛋白对SPF鸡免疫效力试验

1.重组抗原蛋白疫苗制备及免疫方法

1.1重组抗原蛋白疫苗的制备

将重组抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5分别与MONTANIDE^TM ISA 71VG佐剂(SEPPIC公司产品)按3:7重量比(30％重量的抗原，70％重量的佐剂)混合乳化(操作方法见SEPPIC公司产品使用方法介绍)，使疫苗中抗原蛋白终浓度为20μg/ml(不同地区鸡传染性鼻炎流行威胁程度不同，不同鸡种对免疫原的敏感度也有差异，可根据实际需要调整所述抗原蛋白终浓度为5-100μg/ml)。所制备的疫苗依次命名为vp1，vp2，vp3，vp4，vp5。

全菌灭活疫苗制备：分别将A、B、C型副鸡禽杆菌Hp8株、BJ株和668株菌经纯培养后，挑取单个菌落8～10个，涂于TSA平板上(含10％灭活牛血清)。37℃培养16h～18h后，用灭菌的0.01mol/L PBS将平板上的菌苔洗下，稀释至7.5×10⁹cfu/ml，用甲醛灭活(3‰)4h～48h，然后等体积混合。混合菌液与10号工业白油(杭州炼油厂)佐剂按1：1体积混合，胶体磨乳化，所得的三价灭活疫苗抗原终浓度达到1.0×10⁹cfu/ml。

1.2免疫方法

42日龄SPF试验鸡210只，分为亚单位疫苗组、常规灭活疫苗组和PBS对照组。其中疫苗组再分为vp1，vp2，vp3，vp4，vp5五小组，每组30只；常规三价灭活疫苗组和PBS对照组各30只。各组亚单位疫苗组试验鸡分别用vp1，vp2，vp3，vp4，vp5进行免疫，常规三价灭活疫苗组试验鸡用常规灭活疫苗免疫，对照组试验鸡接种PBS。采用胸部肌肉注射，0.5ml/只；4周后相同剂量、相同途径加强免疫。期间每两周翅静脉取血，用于血清特异性抗体的监测。

血清抗体的检测采用ELISA方法，步骤同实施例3。

1.3免疫鸡攻毒试验

对加强免疫4周后的试验鸡全部进行攻毒试验。各试验组内再分别用A型(Hp8株)，B型(BJ株)和C型(668株)Apg进行攻毒，每组10只，眶下窦接种，剂量依次是A型(Hp8株)1×10⁶CFU，B型(BJ株)5×10⁵CFU，C型(668株)1×10⁶CFU。连续观察一周，记录试验鸡的临床发病情况，包括流鼻涕，眼睑肿，溢泪等。评价重组亚单位疫苗的免疫保护力，结果参见表2。

表2本发明鸡传染性鼻炎亚单位疫苗免疫鸡对Apg菌株攻毒的保护效果

注：攻毒剂量A型Hp8株1×10⁶CFU，B型BJ株5×10⁵CFU，C型668株1×10⁶CFU。

*亚单位疫苗免疫组获得免疫保护的试验鸡数与PBS对照组比较，差异显著。

表2列出了A型Hp8株、B型BJ株和C型668株的攻毒实验结果。实验时，分别用本发明优选的5个重组蛋白制备的5种亚单位疫苗免疫试验鸡，2次免疫后用A，B，C三个血清型的Apg强毒攻击，非免疫对照组所有试验鸡陆续发病。亚单位疫苗免疫组攻毒后只有个别试验鸡表现出鼻炎症状，保护率为90％～100％；全菌三价灭活疫苗免疫组在攻毒后3天内有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70～80％；而非免疫对照组所有试验鸡都表现出严重的鼻炎症状。

利用A型221株、0083株，B型222株和C型Modesto株的Apg进行攻毒实验的结果与Hp8株、BJ株和668株的攻毒实验结果相似，Vp1，Vp4和Vp5实验组的保护率为100％，Vp2，Vp3实验组的保护率为90％～100％。由此可见，采用本发明提供的重组抗原蛋白制备的疫苗免疫效果显著，能够同时有效预防鸡感染A，B，C三个血清型的Apg。

此外，蛋白亚单位疫苗的保护率优于全菌三价灭活疫苗的保护效果，与非免疫组相比，有极显著差异。由于纯化蛋白不含全菌体所携带的脂多糖等成分，本发明制备的亚单位疫苗没有副反应，而全菌灭活疫苗会有一过性食欲下降，精神萎靡等副反应。从制备成本上说，亚单位疫苗由于培养诱导容易，培养基便宜，容易纯化等特点，也低于常规灭活菌苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，由氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示的16个抗原表位或表位域以及连接肽通过序列拼接构成，其氨基酸序列如Seq IDNo.21所示。

2.编码权利要求1所述的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.26所示。

4.一种构建体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的基因。

5.一种重组细胞，其特征在于，是由权利要求4所述的构建体转化受体细胞而得。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述受体细胞选自细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。

7.一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其特征在于，其免疫活性组分包括权利要求1所述的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。

8.根据权利要求7所述的鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其特征在于，所述副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的终浓度为5-100μg/ml。

9.一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建权利要求1所述的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的表达载体；

(2)用所述表达载体转化与之匹配的蛋白表达系统，得到重组细胞；

(3)培养所述重组细胞，诱导表达获得副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白并纯化蛋白；

(4)将纯化后的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白与辅助试剂混合，调节所述抗原蛋白的终浓度为5-100μg/ml，得到鸡传染性鼻炎亚单位疫苗。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达载体选自pET、pQE和pGEX系列的载体；所述蛋白表达系统选自大肠杆菌BL21、DH5ɑ、Top10和JM109菌株；所述辅助试剂包括免疫增强剂、稳定剂、防腐剂、盐溶液和/或蒸馏水。