CN111621550B - 适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的rpa反应体系 - Google Patents

Abstract

本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系。通过设计特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，对产物进行凝胶电泳验证后，根据是否有目的条带出现定性判断检测样品是否含有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。本发明提供了一种稳定、特异、高效的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系，该反应体系对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种具有特异性，在此基础上开展美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA检测技术研究，为实现美人鱼发光杆菌美人鱼亚种精准、快速的RPA检测奠定了技术基础。

Description

适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系

技术领域

本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系。

背景技术

美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)广泛分布于全球海洋环境中，是弧菌科(Vibrionaceae)发光杆菌属(Photobacterium)的一种重要致病菌，包括美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(P.damselae subsp.damselae,PDD)和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(P.damselae subsp.piscicida,PDP)两个亚种，其中杀鱼亚种只感染鱼类，而美人鱼亚种不仅可以感染多种海洋动物，还可以感染人发病。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种由美国科学家于1981年首次报道，随后世界各地陆续有该菌感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟、鲸鱼和海豚等不同海洋动物发病的案例。1982年，The Lancet杂志首次报道了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染人发病的案例，在这之后日本、美国、中国香港、沙特阿拉伯等地的科学家多次报道了该菌感染人发病并致死的病例。现有的研究已经证实，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种是一种来自海洋环境的、对人有致死能力的人鱼共患病原。该菌在海洋环境中广泛分布，不仅会对海水养殖生产造成经济损失，还会对海水养殖从业者、浴场旅游人员、海上作业人员等构成一些潜在的公共卫生风险，应引起足够的重视。

在前期的研究过程中，我们已经发现美人鱼发光杆菌美人鱼亚种在我国的海水养殖环境中普遍存在，可以感染石斑鱼、鲆鲽类、许氏平鲉等多种鱼类，没有明显的地域或宿主特异性。为了更好的防控该菌的感染和传播扩散，研发其精准、快速的检测技术尤为重要，可以为临床的诊治提供重要的技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是美人鱼发光杆菌美人鱼亚种在海洋环境中广泛分布，不仅会对海水养殖生产造成经济损失，还会对海水养殖从业者、浴场旅游人员、海上作业人员等构成一些潜在的公共卫生风险，必须防控该菌的感染和传播扩散。

为解决上述问题，我们提供了一种稳定、特异、高效的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系，该反应体系对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种具有特异性，在此基础上开展美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA检测技术研究，为实现美人鱼发光杆菌美人鱼亚种精准、快速的RPA检测奠定了技术基础。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，通过设计特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，对产物进行凝胶电泳验证后，根据是否有目的条带出现定性判断检测样品是否含有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。

进一步的，所述特异性引物是基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因设计的，分别为DNA正向序列：PDDF:5’-CTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAG-3’和反向序列：PDDR：5’-GCGACTTTGCTCGATAGCCGCTACGGCATTG-3’，运用该特异性引物扩增的Mcp基因的目的片段长度为300bp。

这对引物序列是我们测定美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的全基因组序列后，通过对基因组数据库的分析，筛选Mcp基因的部分序列作为目标片段(划线部分，其中斜体部分为本发明的引物)。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因序列全长如下：

将该序列在NCBI上进行Blast比对，结果显示序列相似度高于98％的前3种序列全部来自美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(见图1，其中Evalue＝0)，充分证明我们所筛选的Mcp基因具有较好的种间特异性，能够将美人鱼发光杆菌美人鱼亚种和其他细菌区分开。我们针对这段序列，用生物学软件设计不同的特异引物，通过PCR反复验证后获得的一对特异性最好的引物，扩增了其中长度为300bp的序列(上述Mcp基因序列中下划线的部分，其中斜体部分分别为正向引物和反向引物)，约占Mcp基因全长序列的15.7％，足以用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测鉴定，这是本项发明得以实施的技术基础。

同时，我们将所设计的引物序列在NCBI的Primer-Blast中进行了引物通用性的Blast比对，结果发现与NCBI数据库中的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种全基因组引物匹配度很高(图2)，证明其对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种具有很好的特异性。

Mcp基因是甲基化受体蛋白的编码基因，广泛存在于细菌和古细菌中。Mcp基因被认为是一种管家基因，其序列因物种的不同而存在较大差异，具有很好的种间特异性。在前期的研究中，我们已经证实美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因位于染色体上，保守度高、特异性好，非常适合作为鉴定美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的靶标基因。

进一步的，用于检测的RPA反应体系总体积为46.5μL，包含2×Reaction Buffer缓冲液25μL，10×Basic E-mix5μL，上述浓度为10μM的PDDF和PDDR引物各2.4μL，dNTP酶9.2μL，20×Core Reaction Mix 2.5μL。

进一步的，上述反应体系的制备方法包括以下步骤：

(1)在无菌的200μLPCR管中分别加入浓度10μM的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种正向引物PDDF和反向引物PDDR各2.4μL。

(2)在上述PCR管中依次加入2×Reaction Buffer 25μL，dNTPs+ddH₂O 9.2μL，10×Basic E-mix 5μl，震荡混合均匀。

(3)向上述预混液中加入2.5μL 20×Core Reaction Mix4，再次震荡混合均匀，即获得所述的适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA快速检测的反应体系。

进一步的，上述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA反应体系的使用包括以下步骤：

(1)首先将预混好的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA反应体系冻干后，进行密封保存。

(2)进行检测时，打开密封的装有冻干反应体系的PCR管，并加入46.5μL中的ddH₂O，轻微振荡，直至反应体系全部溶解。

(3)随后在溶解的反应体系中，依次加入2.5μL的280mM MgOAc和1μL检测样本DNA模板，使反应体系总体积达到50μL，盖上PCR管盖，并用封口膜进行密封。

(4)将密封好的PCR管放置手心处，握拳(维持温度约37℃)20min就可以完成扩增反应，扩增好的检测产物通过凝胶电泳进行验证和拍照，就可以完成RPA检测。

本发明的有益效果在于：

1.本发明采用了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Mcp基因的一对特异性引物，相比其他基因序列，其保守性更高，具有更好的种间识别性，可以准确鉴定美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。

2.本发明采用预混PCR反应体系并冻干封装的方式，可以实现快速检测，简化了检测的操作程序，提高了检测效率，适于进行快速检测技术的研发。

3.本发明依靠人体体温就可完成扩增反应，大大简化了PCR反应的前处理过程，降低了样品前处理的条件要求，进一步提升了检测速度。

附图说明

图1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Mcp基因在NCBI数据库中的比对结果

图2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Mcp基因引物对在NCBI数据库中的比对结果图3美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA反应体系对不同病原菌特异性检测结果；

注：图中，1.美人鱼发光杆菌美人鱼亚种；2.哈维氏弧菌；3.鳗弧菌；4.副溶血弧菌；5.溶藻弧菌；6.大菱鲆弧菌；7.嗜环弧菌；8.灿烂弧菌；9.费氏弧菌；10.大肠杆菌；M：DNAMark2000。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

从本实验室的水产动物病原库中，随机挑选10株不同的病原菌(表1)，采用本发明所述的RPA反应体系进行检测。将10株病原菌保存液从-80℃超低温冰箱取出，放于4℃，使菌液自然融化后，吸取30μL划线于TSB固体培养基上，倒置于28℃培养24～36小时。待菌落形成后，挑取单菌落再次划线于一个新的TSB固体培养基上于28℃进行纯化培养。纯化培养3次后，刮取单菌落悬浮于0.5mL的无菌1.5％NaCl溶液中，制备细菌菌悬液。

表1用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异性检测的参考菌株

在上述制备好的菌悬液中加入100μL上海创坤生物科技有限公司的2×LysisBuffer组织裂解液，封口并40℃水浴10min后，用掌式离心机8000rpm离心2min，吸取上清液转移至一个无菌的离心管中，作为待检测细菌的核酸模板。

取10个提前冻干保存的装有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA反应体系的PCR管，打开后向每个管中均加入46.5μL中的ddH₂O，盖上管盖，轻微振荡1-2min，使冻干体系完全溶解。

然后在每个PCR管中均加入2.5μL的280mM MgOAc，再次轻微振荡均匀，随后在10个管中分别加入1μL上述制备好的、不同细菌的核酸模板，盖好管盖，并用封口膜进行密封，轻微振荡使反应体系均匀。

把配制好反应体系的PCR管放入手心中，握拳20min，待RPA反应完成。

将反应完成的RPA反应产物进行凝胶电泳验证，拍照记录结果。如图3所示，只有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种出现了阳性条带，从而证明本发明所述的反应体系对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种具有较好的特异性，可以以此为基础开发能够进行现场应用的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA检测技术。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系

<130> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<140> 1

<141> 2020-06-17

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtctcatg atgtggccca agtaagtgaa g 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgactttgc tcgatagccg ctacggcatt g 31

<210> 3

<211> 1914

<212> DNA

<213> Mcp

<400> 3

atgaatttaa atcacttaag tattaagaaa aaactgatcc tcgccatgat cagtgcggta 60

ctattttcta ctgctcttgt tggtatttta agccaacaac aagcacgaaa agtcattgaa 120

actcgcttac ttgaatcgga aattcctgcg actttgctgc agattcgcaa ccaaatcgat 180

aaagaagttt ccttgttgca agcagcggca caacaactgg caaccaaccc attagtgatt 240

gattcactca ccgcaacgct gcctcaagat aacacccagc tcgttacctt acttaacgag 300

atcaagcagc aatatcatct atttgatgcc tctattgcgg atcgaaatac aggaaactac 360

tggaaccaag acggtttttt acgccagctt aaccaccaac aagatagctg gttctacaac 420

tttgtccgca gtggcaacgc taagatgctc aatgtctttc gtgaagccaa tggtgatgta 480

aaactgtttg ttaattacca acaactcaat ggtaaagggc tagctggctt gtctaaatcg 540

ttagatgaaa tggtgcaatt tattaatcaa tttaaacttg agcaaactgg ctttgtttat 600

ctggttgatg ataaaggtat tgtgcgaatt cataatgata accagttgat gggaaaagca 660

agcttaaccg atttatacgg tagcaaggtg gcaaaccaac tgttaaaacg aggcaaaatc 720

gaaatcgtgg atcttgatct tgcaggccaa gaaaatcttg ttgcttcaag ttatatccca 780

acgatgaatt ggtatgtcat cgcccaatta cctaaaaatg aagcgtttgc gagcctcaac 840

catgcccgta atcaaatttt aatctggact gccatcattg cgcttggctt tactgcgtta 900

gcgatttggc ttgcgagctc cattacccgt ccaatcgctc gtttagccga aatgtttaaa 960

gatcttggtg aaggtgaagg cgatctacgt catcgtctag acattcaagg taacgatgaa 1020

attgcccaac tgtcccaagg ctttaatggt tttattagca aaatccataa ttcggtaaaa 1080

gaagttgcgg aaacaggaaa tgccctacgt cacgcctctc aatcggtagc ggaacaagca 1140

caaacgacct tagataacag ccaaagccaa cgcgatcgca ccattcaagt ggtaaccgcg 1200

attaatgaga tgggggcaac cgtcaatgaa attgcaggta atgctgctca agccgctgac 1260

gccactcacc tagcagaaac ggaagcacaa agtggtcaac aggttgttgg gcaagcaaga 1320

gaaaccattt cacaactgtc tcatgatgtg gcccaagtaa gtgaagtgat tgaatctttg 1380

gcccataaca cccaagccat tggcagcatt ttggatgtga tccgtggtat ttcagaacaa 1440

acgaacttat tggcattgaa cgcagccatt gaagcagctc gtgctggtga gcaaggtcgt 1500

ggttttgccg ttgttgctga tgaagtgcgc agtcttgcta gtcgaacagc ggcttcaact 1560

gatgaaatcc aaactatgat caaccgttta cagcaagagg ccagcaatgc cgtagcggct 1620

atcgagcaaa gtcgcctgtt aagttccaat ggggtttcag cctctgatga agccagcagc 1680

gcattgattt ctattgccga acgtatcacc ttaattgcag atatgaatac gcaagttgca 1740

acggcaacag aagaacaatc aacagtggtt aacgacatca actgcaatat cgaagtgatc 1800

aacgaaacca ctcagcgtac agcaaccacg gccgaagatc ttgcgcaagc gagccttgaa 1860

ctgcagcaat tatctcaccg attagaagtc atggttggaa gcttcaaact ttaa 1914

Claims (5)

1.用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，其特征在于：通过设计特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，对产物进行凝胶电泳验证后，根据是否有目的条带出现定性判断检测样品是否含有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种；

其中，DNA正向序列：PDDF:5’-CTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAG-3’和反向序列：PDDR：5’-GCGACTTTGCTCGATAGCCGCTACGGCATTG-3’；

用于检测的RPA反应体系总体积为46.5μL，包含2×Reaction Buffer缓冲液25μL，10×Basic E-mix5μL，上述浓度为10μM的PDDF和PDDR引物各2.4μL，dNTP酶9.2μL，20×CoreReaction Mix 2.5μL。

2.如权利要求1所述的用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，其特征在于：所述特异性引物基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因设计，运用该特异性引物扩增的Mcp基因的目的片段长度为300bp。

3.一种权利要求1所述用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)在无菌的200μL PCR管中分别加入浓度10μM的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种正向引物PDDF和反向引物PDDR各2.4μL；

(2)在上述PCR管中依次加入2×Reaction Buffer 25μL，dNTPs+ddH₂O 9.2μL，10×Basic E-mix 5μl，震荡混合均匀；

(3)向上述预混液中加入2.5μL 20×Core Reaction Mix4，再次震荡混合均匀，即获得所述的适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA快速检测的反应体系。

4.一种权利要求1所述用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系在制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA检测制品中的应用。

5.一种用权利要求1所述用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA的方法，所述方法为非诊断目的，其特征在于包括以下步骤：

(1)首先将预混好的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA反应体系冻干后，进行密封保存；

(2)进行检测时，打开密封的装有冻干反应体系的PCR管，并加入46.5μL中的ddH₂O，轻微振荡，直至反应体系全部溶解；

(3)随后在溶解的反应体系中，依次加入2.5μL的280mM MgOAc和1μL检测样本DNA模板，使反应体系总体积达到50μL，盖上PCR管盖，并用封口膜进行密封；

(4)将密封好的PCR管放置手心处，握拳以维持温度约37℃至20min就可以完成扩增反应，扩增好的检测产物通过凝胶电泳进行验证和拍照，完成RPA检测。

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